阮航 多浩源 范文艷 呂清晗 姜述君 朱生偉

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163316；2.中國(guó)科學(xué)院植物研究所植物分子生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

土壤鹽堿化是影響植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境條件之一［1］。據(jù)聯(lián)合國(guó)教科文組織（UNESCO）和糧農(nóng)組織（FAO）的不完全統(tǒng)計(jì)，世界上大約有9.5×109km2的鹽堿地，其中我國(guó)占9.9×106km2，土壤鹽堿化造成生態(tài)環(huán)境惡化，嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食生產(chǎn)安全［2］。為了適應(yīng)土壤鹽堿脅迫，植物會(huì)通過(guò)改變抗逆相關(guān)基因表達(dá)以及自身的生理生化等響應(yīng)逆境脅迫［3］。

植物AP2/ERF（APELATA2/ethylene response factors）轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及其非生物逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中具有重要作用［4-5］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中含有147 個(gè)成員，根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)，將AP2/ERF 家族分為5 組，即AP2 亞家族、RAV 亞家族、CBF/DREB 亞家族、ERF 亞家族以及一個(gè)特異蛋白AL079349［6］。研究表明，一些ERFs參與植物對(duì)干旱、高鹽以及滲透等脅迫的響應(yīng)過(guò)程。過(guò)表達(dá)RAP2.2（RELATED TO AP2 2）、RAP2.3和RAP2.12（RAPs）可以增強(qiáng)擬南芥對(duì)脫落酸（ABA）的敏感性和缺氧、氧化以及滲透脅迫的耐受性［7］。過(guò)表達(dá)EIN3（ETHYLENEINSENSITIVE3）和ESE1促進(jìn)鹽反應(yīng)基因表達(dá)，提高植物對(duì)鹽脅迫抗性［8］。過(guò)表達(dá)TSRF1通過(guò)調(diào)節(jié)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，提高水稻的滲透和耐旱性［9］。DREB 亞家族轉(zhuǎn)錄因子受干旱、低溫和鹽等脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá)，參與植物對(duì)非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。如過(guò)表達(dá)AtDREB1A和OsDREB1A可增強(qiáng)擬南芥對(duì)冷凍和脫水耐受性［10-11］。在油菜中，過(guò)表達(dá)BNCBF/DREB1可增加淀粉和蔗糖生物合成酶含量，提高植株對(duì)冷脅迫的抗性［12］。

在擬南芥中，AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族主要集中于對(duì)干旱、高鹽等脅迫的研究，對(duì)鹽堿脅迫研究尚未見報(bào)道。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子可參與水楊酸、茉莉酸和脫落酸等多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中AtERF49 可能是逆境信號(hào)交叉途徑中的關(guān)鍵連接因子（未發(fā)表）。AtERF49（AT1G75490）屬于DREB亞家族中A-2 亞組［13］。AtERF49只有1 個(gè)外顯子，編碼206 個(gè)氨基酸，其蛋白含有一個(gè)保守AP2 結(jié)構(gòu)和一個(gè)CMIV-1 結(jié)構(gòu)域。

本研究以擬南芥為材料，對(duì)其進(jìn)行混合鹽堿脅迫處理，利用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)AtERF49基因的基本特性、鹽堿脅迫及光合響應(yīng)基因表達(dá)模式等進(jìn)行分析，并進(jìn)行葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定，研究AtERF49在植物對(duì)鹽堿脅迫應(yīng)答過(guò)程中的功能，以期為深入解析AtERF49參與植物抗鹽堿脅迫分子機(jī)理提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用到的擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）材料為生態(tài)型Col-0、過(guò)表達(dá)AtERF49轉(zhuǎn)基因材料（AtERF49OX-11、AtERF49OX-39）和CRISPR/Cas9突變體CR-erf49材料（erf49-6、erf49-4）。種植條件為22℃，光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因AtERF49擬南芥鹽堿脅迫處理 將在1/2 MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1 周齡的Col-0、過(guò)表達(dá)AtERF49轉(zhuǎn)基因材料、CR-erf49突變體，移栽到8 cm×8 cm 方盒（土∶蛭石=3∶1）中，待長(zhǎng)到7-8 片葉子時(shí)，進(jìn)行鹽堿脅迫處理。處理組用150 mmol/L 混合鹽堿（摩爾比NaHCO3∶Na2CO3=9∶1）溶液進(jìn)行處理，用水作為對(duì)照組，每3 d 澆灌一次。

1.2.2 抗逆基因、光合相關(guān)基因的RT-qPCR 檢測(cè) 將生長(zhǎng)16 d 的擬南芥材料經(jīng)鹽堿脅迫處理0、1和6 h 取樣，采用聚合美試劑盒（MF045-05）進(jìn)行RNA 提取，參照HiScript? Reverse Transcriptase 說(shuō)明書（Vazyme 公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，按照諾唯贊Q111 說(shuō)明書，以AtUBC30為內(nèi)參，用RT-qPCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中RAB18和RD29A以及光合相關(guān)基因rbcl和psaA的表達(dá)量。RT-qPCR 的引物見表1。

表1 熒光定量PCR AtERF49 所用引物Table 1 Primers used for fluorescence quantitative PCR

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 擬南芥生長(zhǎng)16 d 時(shí)進(jìn)行鹽堿脅迫處理，處理11 d 后，暗處理20 min，利用葉綠素?zé)晒?成像-氣體交換同步測(cè)量系統(tǒng)（GFS-DUAL）測(cè)定暗適應(yīng)后植株葉片光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）、光系統(tǒng)II 實(shí)際量子產(chǎn)能Y（II）和能量耗散的量子產(chǎn)能（NO）。每個(gè)處理重復(fù)4 次，每次測(cè)定7 株。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)（Two-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 鹽堿脅迫促進(jìn)AtERF49的表達(dá)

在Col-0 生長(zhǎng)至16 d 時(shí)，經(jīng)150 mmol/L 鹽堿溶液處理0、1、3 和6 h 后，檢測(cè)擬南芥葉片中AtERF49的表達(dá)情況（圖1）。以AtUBC30為內(nèi)參，鹽堿脅迫處理后，AtERF49的表達(dá)量上升，在3 h時(shí)達(dá)到最高（25 倍），6 h 后，表達(dá)量急劇降低，下降97.4%，表明鹽堿脅迫可快速誘導(dǎo)AtERF49表達(dá)。

圖1 鹽堿脅迫下AtERF49 表達(dá)量分析Fig.1 Analysis of AtERF49 expression under Saline-alkali stress

2.2 過(guò)表達(dá)AtERF49增加植物對(duì)鹽堿的抗性

選取生長(zhǎng)4 周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，利用RT-qPCR 方法檢測(cè)AtERF49的表達(dá)水平。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株AtERF49-OX中AtEFR49的表達(dá)量均高于Col-0（2-4 倍），而erf49突變體中AtERF49的表達(dá)量低于Col-0（圖2-B）。在正常條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥和Col-0 在葉片大小和顏色上無(wú)明顯的區(qū)別（圖2-A）；鹽堿脅迫處理后，Col-0 和erf49突變體植株葉片出現(xiàn)萎蔫和黃化，嚴(yán)重者葉片死亡，而過(guò)表達(dá)AtERF49轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)少許黃化（圖2-A）。過(guò)表達(dá)AtERF49增強(qiáng)植株對(duì)鹽堿脅迫的抗性，而erf49突變體植株對(duì)鹽堿脅迫更加敏感，表明AtERF49正向調(diào)控植物對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)

圖2 過(guò)表達(dá)AtERF49 增強(qiáng)擬南芥對(duì)鹽堿脅迫的抗性Fig.2 Overexpression of AtERF49 gene increasing Arabidopsis resistance to Saline-alkali stress

2.3 過(guò)表達(dá)AtERF49增加下游相應(yīng)基因的表達(dá)

為了探究過(guò)表達(dá)AtERF49增強(qiáng)擬南芥抗鹽堿脅迫的機(jī)理，利用RT-qPCR 檢測(cè)抗逆響應(yīng)相關(guān)基因RD29A和RAB18的表達(dá)。結(jié)果表明，在鹽堿溶液處理前（0 h），Col-0、AtERF49- OX 以及erf49中RD29A和RAB18的表達(dá)量有明顯的差別，均高于Col-0。鹽堿處理1 h 后，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中RD29A和RAB18的表達(dá)水平提高，且極顯著高于Col-0，其中，RAB18的表達(dá)量為Col-0 的2-3 倍（圖3-A），RD29A的表達(dá)量上調(diào)6-10 倍（圖3-B），而erf49突變體中AtERF49的表達(dá)量較Col-0 顯著降低，其中，RAB18的表達(dá)量降低62%-66%（圖3-A），RD29A的表達(dá)量降低29%（圖3-B）。

圖3 轉(zhuǎn)基因AtERF49 植株中RAB18（A）和RD29A（B）的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of RAB18（A）and RD29A（B）in AtERF49 transgenic lines

2.4 鹽堿脅迫下，AtERF49對(duì)擬南芥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

過(guò)表達(dá)AtERF49增強(qiáng)擬南芥抗鹽堿脅迫的能力，葉片黃化表型較輕（圖2-A），推測(cè)其可能影響葉片光合作用能力和光合電子傳遞速率。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和Col-0 的葉綠素?zé)晒鈪?shù)qP、qN、Y（II）和NO 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，鹽堿脅迫處理前，轉(zhuǎn)基因擬南芥和Col-0 植株的qP、qN、Y（II）和NO 均無(wú)差異。鹽堿溶液處理后，erf49突變體植株的Y（II）和qP 均低于Col-0，NO 和qN 均高于Col-0（圖4-B和圖4-C）；而AtERF49-OX植株在處理之后，Y（II）和qP 均顯著高于Col-0，NO 和qN 均顯著低于Col-0（圖4-A 和圖4-D）。表明鹽堿脅迫下，erf49突變體植株光損傷程度較嚴(yán)重，PSII 反應(yīng)中心的開放程度降低，ERF49 可能影響光系統(tǒng)II 反應(yīng)中心光化學(xué)反應(yīng)、開放狀態(tài)以及光損傷程度。

圖4 鹽堿脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因AtERF49 擬南芥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.4 Effects of Saline-alkali stress on the chlorophyll fluorescence parameters of leaves of AtERF49 transgenic Arabidopsis

2.5 AtERF49調(diào)控光合響應(yīng)基因表達(dá)

在鹽堿脅迫處理前后，對(duì)轉(zhuǎn)基因AtERF49擬南芥蓮座葉光合響應(yīng)基因psaA和rbcL的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）表明，在正常條件下，psaA、rbcl在AtERF49-OX、erf49和Col-0 中表達(dá)量無(wú)明顯差異。在鹽堿脅迫處理下，與Col-0 相比，AtERF49-OX植株中rbcL表達(dá)量顯著增加（4-5 倍），psaA表達(dá)量顯著降低（47%-64%）；而psaA、rbcl在erf49突變體植株表達(dá)與AtERF49-OX植株相反。psaA能夠編碼光系統(tǒng)I（PSI）跨膜復(fù)合物的中心蛋白A，其作為原初反應(yīng)中心在光系統(tǒng)I 中起著重要作用，可參與葉綠素分子間的相互作用；rbcL編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）大亞基，調(diào)節(jié)rubisco 的合成和活性，rubisco 的活性與葉片的羧化效率及光合作用呈正相關(guān)。psaA、rbcl在AtERF49-OX、erf49中表達(dá)存在差異，說(shuō)明ERF49可能通過(guò)調(diào)控psaA和rbcL表達(dá)影響植物光合作用電子傳遞和碳同化能力，進(jìn)而影響植物對(duì)鹽堿脅迫的抗性。

圖5 AtERF49 轉(zhuǎn)基因株系中rbcL 和psaA 的表達(dá)Fig.5 Relative expressions of rbcL and psaA in AtERF49 transgenic lines

3 討論

AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子參與植物對(duì)多種非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程［14］。植物對(duì)鹽堿脅迫應(yīng)答的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分為ABA 依賴和非依賴兩大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［15］，相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)隨之調(diào)控不同下游基因的表達(dá)［16］，如植物逆境相關(guān)基因RD29A和RAB18。本研究中，在鹽堿脅迫處理1 h 時(shí)，AtERF49-OX植株RD29A和RAB18的表達(dá)量顯著上升，而erf49突變體中其表達(dá)量降低。結(jié)合鹽堿處理下植株表型，推測(cè)在鹽堿脅迫條件下，AtERF49-OX擬南芥的抗鹽堿脅迫能力提高，可能與ABA 依賴基因RD29A和RAB18的表達(dá)增強(qiáng)密切相關(guān)。

鹽堿脅迫對(duì)植物的影響是多方面的，在影響光合電子傳遞速率的同時(shí)也會(huì)引發(fā)光合機(jī)構(gòu)的紊亂［17］。Y（II）是光系統(tǒng)II 實(shí)際量子產(chǎn)能。本研究中，在鹽堿處理之前，各株系的Y（II）無(wú)明顯差異；在鹽堿脅迫處理?xiàng)l件下，erf49突變體Y（II）顯著下降，而AtERF49-OX植株的Y（II）增加，說(shuō)明鹽堿脅迫下erf49突變體光系統(tǒng)II 反應(yīng)中心失活程度較嚴(yán)重，過(guò)表達(dá)株系則表現(xiàn)出強(qiáng)的耐受能力。

光化學(xué)淬滅（qP）反映PSII 吸收的光能在光化學(xué)反應(yīng)電子傳遞鏈中的份數(shù)，在一定程度上反映PSII 反應(yīng)中心的開放程度，要想保持高的光化學(xué)淬滅就要使PSII 反應(yīng)中心處于“開放狀態(tài)”。非光化學(xué)淬滅（qN）反映植物耗散過(guò)剩光能為熱的能力［18-19］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在鹽堿脅迫處理前，轉(zhuǎn)基因株系和Col-0 的qP 和qN 值無(wú)明顯差異。在脅迫處理后，AtERF49-OX植株的qP 值在上升，qN 值下降；而erf49突變體則與之相反。這就說(shuō)明erf49突變體遭受鹽堿脅迫之后，天線色素吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的份額在減少，主要轉(zhuǎn)化成熱量散失。能量耗散的量子產(chǎn)能（NO）是光損傷的重要指標(biāo)，若NO 值越高，則表示受到的光損傷越嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明，在鹽堿處理?xiàng)l件下，erf49突變體NO 值上升并顯著高于Col-0，而AtERF49-OX植株NO 值下降，erf49突變體在逆境脅迫下更容易受到光損傷。進(jìn)一步說(shuō)明過(guò)表達(dá)AtERF49基因能有效的減少光損傷，在鹽堿脅迫發(fā)生時(shí)還能保持較高的光能利用率。

psaA和rbcL是葉綠體中重要生物學(xué)功能的基因，psaA能夠編碼光系統(tǒng)I 跨膜復(fù)合物的中心蛋白A，又稱P700 脫輔基蛋白A，其作為原初反應(yīng)中心在光系統(tǒng)I 中起著重要作用，可能參與結(jié)合中間電子傳遞體Fx,也可能參與了與葉綠素分子的相互作用［20］；rbcL基因編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1,5-bishosphate carboxylase/oxygenase，rubisco）大亞基，調(diào)節(jié)rubisco 的合成和活性，rubisco 在光合作用的暗反應(yīng)中起重要作用，負(fù)責(zé)碳同化又引發(fā)光呼吸，其活性與葉片的羧化效率及光合作用呈正相關(guān)［21-22］。鹽堿處理前，轉(zhuǎn)基因株系和Col-0 中psaA和rbcL的表達(dá)量無(wú)明顯差異。在鹽堿處理后二者基因表達(dá)量發(fā)生變化，AtERF49-OX植株的rbcL表達(dá)量上升并顯著高于Col-0，psaA表達(dá)量顯著下降，erf49突變體株系與之相反。erf49突變體psaA表達(dá)量在鹽堿脅迫處理后上升，而AtERF49-OX植株psaA表達(dá)量下降，這可能是因?yàn)樵邴}堿脅迫條件下，光系統(tǒng)I 跨膜復(fù)合物中心蛋白A 穩(wěn)定性有關(guān)［23］。有研究表明蟲黃藻psbA和psaA轉(zhuǎn)錄水平的主動(dòng)降低對(duì)抵抗熱應(yīng)激具有積極作用［24］，可能與鹽堿脅迫中機(jī)制是不同的，還需進(jìn)一步研究。非生物脅迫可導(dǎo)致植物的rubisco 酶活性降低［25］，本研究中，erf49突變體的rbcL表達(dá)量在鹽堿脅迫處理之后下降，可能是鹽堿脅迫導(dǎo)致rubisco 合成的轉(zhuǎn)錄過(guò)程和轉(zhuǎn)錄后翻譯表達(dá)受到抑制，使rubisco 合成受阻，從而影響暗反應(yīng)中的碳同化和葉片的羧化效率，造成葉片黃化。

4 結(jié)論

鹽堿脅迫下，AtERF49 通過(guò)調(diào)控逆境脅迫相關(guān)基因RAB18和RD29A的表達(dá)以及對(duì)植物葉片光合作用相關(guān)基因（psaA和rbcL）及電子傳遞等影響，參與植物對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)過(guò)程。