孫卓 王妍 韓忠明 王云賀 趙淑杰 楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 省部共建生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)系統(tǒng)管理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118）

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti）隸屬于鐮刀菌屬（Fusarium），均為世界性分布、危害性較大的土傳病原真菌，其擁有廣泛的寄生宿主，可引起農(nóng)業(yè)類(lèi)、設(shè)施園藝類(lèi)、藥用植物類(lèi)等百余種作物病害的發(fā)生［1-2］。防風(fēng)（Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schisck.）作為我國(guó)重要的藥用植物資源之一，主要分布于中國(guó)東北、河北等地區(qū)［3］，由于地理環(huán)境原因，易受尖孢鐮刀菌及木賊鐮刀菌的越冬孢子侵染而誘發(fā)防風(fēng)枯萎病、根腐病，年發(fā)病率15%-20%以上，嚴(yán)重影響防風(fēng)藥源的產(chǎn)量及品質(zhì)［4］。利用化學(xué)途徑可有效防控植物真菌性病害，且以化學(xué)農(nóng)藥為主導(dǎo)仍是目前植物病害的主要防控策略，但其引發(fā)的環(huán)境污染、抗藥性增強(qiáng)等問(wèn)題日趨凸顯。利用益生微生物防控植物病害具有作用良好、生態(tài)安全性高及經(jīng)濟(jì)效益顯著等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色、安全的植物保護(hù)理念，是目前降低化學(xué)農(nóng)藥使用、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)性的一種理想替代手段［5］，而挖掘具有生防潛質(zhì)的微生物資源也成為了目前植物保護(hù)領(lǐng)域的重要研究方向［6］。

植物根際是植物根系與土壤進(jìn)行物質(zhì)交流的重要區(qū)域，植物體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中向土壤中釋放的根系分泌物對(duì)土壤微生物具有富集趨化作用［7］。相較于植物非根際區(qū)域，根際土壤中微生物的相對(duì)豐度及多樣性更高，而活躍于植物根系表面及根際土壤的有益微生物通過(guò)活化土壤養(yǎng)分，調(diào)控植物土壤微生態(tài)等機(jī)制，顯著影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和質(zhì)量形成，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)植物體生長(zhǎng)的正向促進(jìn)作用［8］。此外，根際有益微生物可通過(guò)空間和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生作用、拮抗作用以及誘導(dǎo)植物抗病性等方式，抑制植物病原微生物的生長(zhǎng)［9］。因此，利用植物根際有益微生物防控植物真菌性病害的研究備受科研工作者的關(guān)注［10-11］。楊茉等［12］從辣椒根際土壤中分離篩選獲得5 株對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsiciLeonian）及辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsicibulterg）具有生防潛力的植物根際促生菌。Khalil等［13］研究證實(shí)，篩選自植物根際的醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）、暹羅芽胞桿菌（Bacillus siamensis），可通過(guò)產(chǎn)生鐵載體、生物膜、蛋白酶、內(nèi)切葡聚糖酶和吲哚乙酸等，實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄枯萎病的防控作用及對(duì)番茄植株的促生作用。Silva等［14］研究發(fā)現(xiàn)，根際真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）ESALQ-1306 和棘孢木霉（T.asperellum）BRM-29104 可通過(guò)調(diào)控內(nèi)生菌群多樣性，改變大豆內(nèi)生菌群的群落組成，協(xié)助大豆抵御核盤(pán)菌侵染，有效降低大豆菌核病造成的作物減產(chǎn)。此外，枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［15］、哈茨木霉［16］等作為優(yōu)質(zhì)的生防菌源均已被開(kāi)發(fā)為生物制劑，廣泛應(yīng)用于作物病害田間管理。但有關(guān)防風(fēng)枯萎病、根腐病等真菌性病害的生物防控研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

為發(fā)掘防風(fēng)根際土壤中的有益微生物資源，獲取對(duì)防風(fēng)枯萎病、根腐病具有較好抑菌作用的生防菌源，本研究以防風(fēng)健康根際土壤為研究對(duì)象，從中分離純化篩選獲得1 株對(duì)尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌均具有顯著抑菌活性的拮抗真菌MR-43，基于形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合ITS 基因序列分析確立其分類(lèi)學(xué)地位。通過(guò)室外盆栽試驗(yàn)方法對(duì)拮抗真菌MR-43 的土壤定殖能力、防病效果及植物促生效果進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以期為防風(fēng)枯萎病、根腐病等真菌性病害生物制劑的開(kāi)發(fā)提供優(yōu)質(zhì)生防菌源，為藥用植物病害的生物防控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集 2020年6月于吉林省長(zhǎng)春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)防風(fēng)栽培實(shí)驗(yàn)田（43°48'24″N、125°24'59″E，海拔251 m），以五點(diǎn)采樣法結(jié)合抖落法，采集健康防風(fēng)植株根際土壤（距離主根及須根根軸表面0-3 mm 土壤），收集土樣經(jīng)均勻混合后置于無(wú)菌自封袋內(nèi)并編號(hào)為MR，4℃保存、備用。

1.1.2 供試病原真菌 尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）Fox201、木賊鐮刀菌（F.equiseti）Feq112 分別為防風(fēng)枯萎病、根腐病致病菌，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂17.0 g，去離子水1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖水（potato dextrose broth，PDB）：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，去離子水1 000 mL。

1.1.4 供試試劑 代森錳鋅可濕性粉劑（70% W/W，mancozeb，WP），四川潤(rùn)爾科技有限公司；多菌靈可濕性粉劑（50% W/W，carbendazim，WP），江蘇豐山集團(tuán)股份有限公司；哈茨木霉T-22（有效活菌數(shù)50 億/g），山東綠隴生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌BSn5（有效活菌數(shù)200 億/g），山東奧豐生物科技有限責(zé)任公司；利福平（≥97% W/W，rifampicin，Reagent grade），上海麥克林生化科技有限公司；DNA Marker 和 PCR 擴(kuò)增試劑盒，日本TaKaRa 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒及ITS 合成引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 根際真菌的分離、純化及保存 于無(wú)菌條件下，采用稀釋平板法對(duì)根際土壤真菌進(jìn)行分離［17］。取供試土樣與無(wú)菌水按照1∶9 比例混合于無(wú)菌錐形瓶中，充分振蕩 10 min 后靜置。將所得土壤懸濁液梯度稀釋至103、104、105倍，備用。分別吸取不同梯度溶液200 μL 稀釋液涂布于PDA 中，于25℃恒溫倒置培養(yǎng)5-7 d 后，挑取具有真菌特征的菌落于PDA 平板上純化，編號(hào)為MR，-20℃保藏備用。

1.2.2 拮抗真菌的篩選 采用對(duì)峙培養(yǎng)法［18］，于無(wú)菌條件下，將經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)后的供試根際真菌、尖孢鐮刀菌及木賊鐮刀菌分別用打孔器制成直徑為 8 mm 的菌餅，2 種病原真菌分別接種于直徑為 90 mm PDA 平板中央，根際真菌接種于距平板中心 30 mm處的對(duì)稱(chēng)點(diǎn)，以單接病原菌為對(duì)照，每處理重復(fù)3 次，置于21-25℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察記錄抑菌情況，計(jì)算抑菌率［19］。

抑菌率（%）=（RC-RP）/RC×100%

其中，RC 為對(duì)照趨勢(shì)半徑，RP 為處理趨勢(shì)半徑。

1.2.3 拮抗真菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 于無(wú)菌條件下，將活化后的拮抗真菌制成8 mm 的菌餅，接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，3 次重復(fù)，置于25℃恒溫倒置暗培養(yǎng)，逐日觀察拮抗真菌的菌落形態(tài)、顏色等特征。挑取培養(yǎng)物進(jìn)行制片，顯微觀察菌絲、分生孢子等形態(tài)特征［20］。

1.2.3.2 分子鑒定 將活化后的拮抗真菌接種于PDB 培養(yǎng)液中，25℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d，收集菌絲，采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 試 劑 盒（TaKaRa Bio,Japan）提取真菌基因組DNA，通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。

1.2.3.3 DNA 擴(kuò)增 基于ITS-PCR 對(duì)拮抗真菌DNA 進(jìn)行擴(kuò)增［21-22］，引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），反應(yīng)體系：Master Mix 12.5 μL、ITS1 1 μL、ITS4 1 μL、rDNA 2 μL、ddH2O 8.5 μL，擴(kuò)增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3.4 序列同源性比較和聚類(lèi)分析 將拮抗真菌測(cè)序結(jié)果提交NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行BIAST 比對(duì)分析，利用MEGA 5.2 軟件（https://www.megasoftware.net/megamac.php,Arizona State University）進(jìn)行Clustal W 多重比對(duì)，并以鄰近法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 MR-43 利福平（Rif）標(biāo)記菌株的篩選及土壤定殖能力評(píng)價(jià)

1.2.4.1 利福平標(biāo)記菌株篩選 對(duì)拮抗真菌MR-43進(jìn)行利福平抗性誘變，將MR-43 依次接種于含50、100、200、300、350、400 μg/mL Rif 的PDB 中進(jìn)行逐級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，170 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d。當(dāng)菌株MR-43 可在含400 μg/mL Rif 的PDB 中穩(wěn)定生長(zhǎng)，且形態(tài)學(xué)指標(biāo)及對(duì)木賊鐮刀菌抑菌活性無(wú)明顯變化時(shí)，即得拮抗真菌MR-43 的利福平標(biāo)記菌株，將其編號(hào)為MRRif-43，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 菌株MRRif-43 孢子懸液制備 將MRRif-43菌株在PDA 平板上25℃培養(yǎng)7 d 后，用無(wú)菌水洗脫其分生孢子，并配制為1×108CFU/mL 孢子懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 菌株MR-43 的土壤能力評(píng)價(jià) 將供試MRRif-43 孢子懸液與防風(fēng)栽培土壤按照1∶10 比例均勻混合后放入育苗盆缽中，每處理10 次重復(fù)，室溫下放置，每隔7 d 回收分離1 次土壤中的菌株MRRif-43，統(tǒng)計(jì)并記錄其在土壤中的定殖菌量。

1.2.5 拮抗真菌 MR-43 的防病效果

1.2.5.1 病原菌孢子懸液的制備 將尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌菌株分別在PDA 平板上25℃培養(yǎng)10 d后，用無(wú)菌水洗脫2 種病原真菌的分生孢子，并分別配制為1×108CFU/mL 孢子懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 盆栽防病試驗(yàn) 參考Gholami 等［23］研究方法。土壤基質(zhì)（農(nóng)田土壤∶蛭石=2∶1）已分別用尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌孢子懸液進(jìn)行預(yù)先感病。選取長(zhǎng)勢(shì)一致、根系發(fā)達(dá)的1年生健康防風(fēng)植株，共設(shè)計(jì)2 個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)，分別為尖孢鐮刀菌防病區(qū)和木賊鐮刀菌防病區(qū)，每小區(qū)均設(shè)置5 個(gè)處理，分別為無(wú)處理對(duì)照（水）、農(nóng)藥處理組（5.0 g/L 多菌靈50%可濕性粉劑用于尖孢鐮刀菌引起的防風(fēng)枯萎病，0.18 g/L 代森錳鋅70%可濕性粉劑用于木賊鐮刀菌引起的防風(fēng)根腐病）、枯草芽孢桿菌菌懸液（含菌量1×107CFU/mL）、哈茨木霉孢子懸液（含菌量1×107CFU/mL）、MR-43 孢子懸液（含菌量1×107CFU/mL）。

各實(shí)驗(yàn)小區(qū)獨(dú)立且完全隨機(jī)分布，每個(gè)處理進(jìn)行20 個(gè)重復(fù)。常規(guī)農(nóng)業(yè)管理70 d 后，調(diào)查防風(fēng)枯萎病、根腐病發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)及防病效果。防風(fēng)枯萎病和根腐病發(fā)病程度分為9 級(jí)（表1）。

表1 防風(fēng)枯萎病和根腐病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Disease grading standard of Fusarium wilt and root rot of S.divaricata

病情指數(shù)=［∑（病級(jí)株數(shù)×代表值）/（總株數(shù)×最高病級(jí)代表值）］×100

防病效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.2.6 拮抗真菌MR-43 的促生能力評(píng)價(jià) 土壤基質(zhì)（農(nóng)田土壤∶蛭石=2∶1）已預(yù)先進(jìn)行消毒滅菌。選取長(zhǎng)勢(shì)一致、根系發(fā)達(dá)的1年生健康防風(fēng)植株，共設(shè)置4 個(gè)處理，分別為無(wú)處理對(duì)照（水）、枯草芽孢桿菌菌懸液（含菌量1×107CFU/mL）、哈茨木霉孢子懸液（含菌量1×107CFU/mL）、MR-43 孢子懸液（含菌量1×107CFU/mL）。實(shí)驗(yàn)小區(qū)為完全隨機(jī)分布，每個(gè)處理進(jìn)行15 個(gè)重復(fù)。常規(guī)農(nóng)業(yè)管理60 d 后，隨機(jī)抽取9 株防風(fēng)植株，測(cè)定并記錄防風(fēng)的全株長(zhǎng)度、根長(zhǎng)、全株鮮重、全株干重、根鮮重、根干重等生物量指標(biāo)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS ver.13.0（SPSS,Inc.,Chicago,USA）統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 根際土壤真菌的抑菌活性

本研究于防風(fēng)根際土壤中共分離純化104 株真菌。如表2所示，7 株根際真菌對(duì)尖孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌均具有拮抗作用，抑菌率為9.91%-61.85%。菌株MR-43、MR-38 對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率達(dá)56%以上，且MR-43 菌株的抑菌活性顯著高于余下6 種拮抗真菌，抑菌率為59.63%（P<0.05）。與尖孢鐮刀菌相比，7 株拮抗真菌對(duì)木賊鐮刀菌的拮抗作用更為明顯，MR-24、MR-70、MR-43 等6 株拮抗真菌對(duì)木賊鐮刀菌的抑菌率均達(dá)55%以上，其中菌株MR-24 抑菌率為61.85%，差異顯著（P<0.05）。但菌株MR-24 對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌率僅為22.36%，其對(duì)供試2 種病原真菌的平均抑菌率為42.11%，而MR-43 菌株對(duì)尖孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌的平均抑菌率為58.34%，由此說(shuō)明，MR-43 更為有效地控制了2 種病原真菌生長(zhǎng)擴(kuò)繁（圖1）。經(jīng)多次驗(yàn)證，菌株MR-43 的抑菌活性穩(wěn)定，因此將其作為候選菌株用于后續(xù)研究。

表2 根際真菌對(duì)防風(fēng)病原真菌的抑制作用Table 2 Antifungal activities of selected rhizospheric fungi against fungal pathogens of S.divaricata

圖1 菌株MR-43 對(duì)尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of MR-43 on F.oxysporum and F.equiseti during the dual culture assay

2.2 拮抗菌株MR-43的分類(lèi)學(xué)鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 MR-43 菌落在PDA 平板上25℃倒置暗培養(yǎng)7 d 后，菌落平鋪、密實(shí)，有分泌物滲入PDA 中，邊緣不規(guī)則，菌落正面呈粉白色（圖2-A），菌落背面有放射狀褶皺，呈橙紅色（圖2-B）。分生孢子橢圓形（5-7）μm ×（2-4）μm（圖2-C），分生孢子梗直或略彎（圖2-D、E），產(chǎn)孢瓶體單孢、輪生，每輪3-10 個(gè)產(chǎn)孢瓶體，底部漸細(xì)，頂端略膨大，瓶體（9-14）μm ×（2-4）μm（圖2-F）。結(jié)果表明，菌株MR-43 的形態(tài)與葡萄穗霉科真菌相近。

圖2 菌株MR-43 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)特征Fig.2 Microscopic morphology characteristics and the colony morphology of strain MR-43 isolate

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 菌株MR-43 的ITS 基因序列經(jīng)PCR 擴(kuò)增，由上海生工公司測(cè)序，獲得大小為540 bp 的堿基序列，GenBank 登陸號(hào)為OK287148.1。序列上傳至NCBI 經(jīng)BLAST 比對(duì)，與Sirastachys castanedae（KU846661.1）的同源性達(dá)99% 以上，與S.pseudolongispora（KU846674.1）、S.longispora（AF081482.1）、S.parvispora（KX690114.1）的同源性為97%-98%。基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果（圖3）顯示，菌株MR-43 與S.castanedae（MW793377.1）表現(xiàn)了高度同源性并處于同一分支。

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建MR-43 近緣關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of MR-43 isolate and closely related taxa based on ITS sequences

結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將分離自防風(fēng)根際土壤的菌株MR-43 確定為S.castanedae。這是首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道該菌種可宿生于植物根際土壤。

2.3 菌株MR-43的土壤定殖能力

菌株MRRif-43 經(jīng)傳代培養(yǎng)10 代后仍可在含400 μL/mg 利福平的PDA 平板上穩(wěn)定生長(zhǎng)，且較菌株 MR-43 的形態(tài)無(wú)明顯變化。菌株MRRif-43 對(duì)尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌的抑菌活性與菌株MR-43 相比無(wú)顯著差異，抑菌率仍可保持約60%，結(jié)果表明，菌株MRRif-43 具有遺傳穩(wěn)定性且對(duì)病原真菌仍保持較好抑菌活性。土壤定殖試驗(yàn)周期為35 d，未接種標(biāo)記菌株的供試土壤經(jīng)檢測(cè)，其所含微生物無(wú)法在含有400 μg/mL 利福平的PDA 平板生長(zhǎng)，由此說(shuō)明，該濃度下的抗生素選擇培養(yǎng)基可用于MRRif-43 菌株的有效回收。如圖4所示，土壤中菌株MRRif-43的菌量變化呈明顯波動(dòng)趨勢(shì)。接種14 d，MRRif-43的土壤含菌量降至1.85×106CFU/g 土；第21 天，MRRif-43 實(shí)現(xiàn)擴(kuò)繁，其土壤含菌量上升至5.36×106CFU/g 土，增幅為190%，差異顯著（P<0.05）；第28 天，菌株MRRif-43 的定殖菌量出現(xiàn)小幅下降，至35 d，MRRif-43菌株的土壤含菌量回升至5.38×106CFU/g 土，與28 d 相比差異顯著（P<0.05），定殖菌量較為可觀。結(jié)果表明，菌株MR-43 具有良好的土壤定殖能力。

圖4 菌株MRRif-43 在防風(fēng)土壤中的定殖情況Fig.4 Colonization of MRRif-43 in the soil of S.divaricata

2.4 菌株MR-43對(duì)防風(fēng)枯萎病及根腐病的防控效果

篩選自防風(fēng)根際土壤的菌株MR-43，其孢子懸液回施于防風(fēng)栽培土壤后，可有效緩解防風(fēng)枯萎病、根腐病病害的發(fā)生，降低病害危害。接種MR-43 70 d 后，對(duì)照組防風(fēng)植株枯萎病、根腐病均發(fā)生嚴(yán)重，病情指數(shù)分別為50.59、64.14，而經(jīng)多菌靈、代森錳鋅農(nóng)藥處理，以及枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和MR-43 孢子懸液處理后防風(fēng)病害均得到了不同程度地控制。其中，MR-43 對(duì)枯萎病、根腐病的防效可達(dá)63%以上，平均防效為68.51%，與農(nóng)藥處理組相比差異不顯著（P>0.05）；菌株MR-43 防效顯著高于枯草芽孢桿菌、哈茨木霉（表3，圖5）。

圖5 MR-43 對(duì)防風(fēng)根腐病、枯萎病的防控效果Fig.5 Biocontrol effects of MR-43 against the root rot and Fusarium wilt disease of S.divaricata

表3 MR-43 孢子懸液對(duì)防風(fēng)真菌性病害的防效Table 3 Control effect of the MR-43 spore suspension on fungal disease of S.divaricata

2.5 菌株MR-43對(duì)防風(fēng)植株生長(zhǎng)的影響

將菌株MR-43 接種于防風(fēng)植株后，其葉片、莖梗及根須等部位未出現(xiàn)致病引發(fā)的霉?fàn)€或病斑，表明S.castanedaeMR-43 對(duì)藥用植物防風(fēng)無(wú)致病力。如表4所示，菌株MR-43、B.subtilis菌懸液及T.harzianum孢子懸液均可不同程度的促進(jìn)防風(fēng)植株生長(zhǎng)。經(jīng)MR-43 處理后的防風(fēng)整株長(zhǎng)度、根鮮重及根干重指標(biāo)均顯著高于其他處理組（P<0.05）。與CK組（清水處理）相比，MR-43 組防風(fēng)整株長(zhǎng)度、整株鮮重等6 項(xiàng)指標(biāo)平均增加33.44%，防風(fēng)根鮮重及根干重提高44%以上。結(jié)果表明，菌株MR-43 可促進(jìn)防風(fēng)生長(zhǎng)，具有根際促生真菌（plant growthpromoting fungi，PGPF）屬性，可作為增產(chǎn)有益菌源進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。

表4 MR-43 對(duì)防風(fēng)植株的促生效果Table 4 Effects of MR-43 on the promoting growth of S.divaricata

3 討論

葡萄穗霉科（Stachybotryaceae）真菌是土壤中普通存在的腐生菌成員之一［24］，雖然部分該科真菌可引起人類(lèi)疾?。?5-26］，但其作為較早被發(fā)現(xiàn)并命名的真菌物種之一，在植物病害防控方面擁有較高的研究?jī)r(jià)值［27］，作為生防菌源具有一定的開(kāi)發(fā)潛力［28］。本研究在開(kāi)展吉林長(zhǎng)春防風(fēng)栽培基地土壤有益微生物資源調(diào)查的研究中，篩選獲得1 株對(duì)防風(fēng)常見(jiàn)真菌性病害致病菌尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌具有較強(qiáng)拮抗作用的根際真菌MR-43，基于培養(yǎng)特性、顯微形態(tài)特征及分子生物學(xué)手段，將菌株MR-43 鑒定為Sirastachys castanedae，首次發(fā)現(xiàn)該菌種可作為土著真菌宿生于植物根際土壤。S.castanedae隸屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota），盤(pán)菌亞門(mén)（Pezizomycotina），糞殼菌綱（Sordariomycetes），肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales），葡萄穗霉科（Stachybotryaceae），Sirastachys組進(jìn)化分支中，在1964年首次發(fā)現(xiàn)于加拿大安大略省的阿伯福伊爾地區(qū)種植的北美香柏土壤，目前S.castanedae僅在中國(guó)及西班牙等個(gè)別國(guó)家有資源調(diào)查及分布的報(bào)道［29-31］。

生防真菌對(duì)植物病原菌具有多種直接或間接的抑菌機(jī)制，包括生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)、真菌寄生、抗性物質(zhì)溶菌及誘導(dǎo)植物抗性等［32］。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄穗霉科真菌可通過(guò)產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等物質(zhì)有效抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株MR-43 作用后的尖孢鐮刀菌及木賊鐮刀菌，其菌落邊緣均變薄且趨于清晰，氣生菌絲溶解消亡。由此推測(cè)S.castanedaeMR-43 可通過(guò)產(chǎn)生某些次生代謝物質(zhì)破壞病原真菌菌絲胞壁或胞膜結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)抑制病原真菌生長(zhǎng)的作用機(jī)制，由此暗示S.castanedae胞外次生代謝產(chǎn)物具有植物病害生防制劑的開(kāi)發(fā)潛質(zhì)。但S.castanedaeMR-43 產(chǎn)生抑菌效應(yīng)的具體物質(zhì)尚不明確，仍需開(kāi)展后續(xù)工作挖掘研究。

拮抗微生物的定殖能力強(qiáng)弱直接影響其生防作用有效性及穩(wěn)定性，同時(shí)也是評(píng)估生防菌源應(yīng)用潛力的重要指標(biāo)［33］。本研究基于抗生素標(biāo)記法，證實(shí)S.castanedaeMR-43 對(duì)防風(fēng)栽培土壤環(huán)境的適應(yīng)力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定地?cái)U(kuò)繁增殖，具有較好的土壤定殖能力。后續(xù)會(huì)進(jìn)一步評(píng)價(jià)MR-43 在防風(fēng)等植株體內(nèi)的定殖效果。

目前，植物病害生物防控研究中普通存在生防菌源室內(nèi)抑菌效果明顯，但室外盆栽或田間防效偏低的問(wèn)題［34］。本研究利用MR-43 孢子懸液，證實(shí)了S.castanedae可有效防控防風(fēng)枯萎病、根腐病，其室外盆栽防病效果與室內(nèi)抑菌效果相比仍保持較高水平，且與常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥的病害管理效果持平。此外，本研究發(fā)現(xiàn)S.castanedaeMR-43 對(duì)防風(fēng)植株的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，效果優(yōu)于已進(jìn)行農(nóng)藥登記注冊(cè)的B.subtilis和T.harzianum。有研究者稱(chēng)，將非土著性外源微生物大量引入土壤，易受到來(lái)自于習(xí)居優(yōu)勢(shì)微生物的競(jìng)爭(zhēng)或其他環(huán)境因子的影響，其生長(zhǎng)繁殖受限導(dǎo)致生防效果不理想，且非土著性微生物對(duì)土壤小環(huán)境的習(xí)居微生物可能存在取代作用，由此改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，影響土壤原有的微生態(tài)平衡［35］。土著群落的多樣性及結(jié)構(gòu)對(duì)群落功能的發(fā)揮具有重要作用，外源微生物的過(guò)分干擾，可能會(huì)導(dǎo)致宿主植物與土壤微生物的互作受到直接或間接的影響［36］。本研究中，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉作為外源微生物，并非源自防風(fēng)栽培土壤固有的微生態(tài)平衡體系，引入土壤后可能與土著微生物存在生態(tài)位重疊，土著微生物的功能多樣性發(fā)生變化導(dǎo)致土壤代謝功能下降，最終影響了外源生防微生物對(duì)植物促生效果的發(fā)揮。綜上所述，分離篩選自防風(fēng)根際土壤的S.castanedaeMR-43 在防風(fēng)生態(tài)友好型病害防控及作物增產(chǎn)方面具有開(kāi)發(fā)及應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

本研究于防風(fēng)根際土壤中分離篩選1 株葡萄穗霉科（Stachybotryaceae）真菌S.castanedaeMR-43，發(fā)現(xiàn)該菌種可宿生于植物根際土壤。S.castanedaeMR-43 可在防風(fēng)栽培土壤中穩(wěn)定擴(kuò)繁，具有良好的定殖能力，且其病害防控能力及對(duì)防風(fēng)植株的促生能力均較為突出。由此說(shuō)明，S.castanedaeMR-43 作為防控防風(fēng)真菌性病害的候選生防菌源具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。