麻智芳，余 科，安 苗，黃 勝，潘秋芝，李 珊，何孝寬

( 1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽550025； 2.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，貴州 貴陽 551499； 3.荔波縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔南 558400 )

樟江系珠江流域西江水系柳江支流龍江的上游河段，是貴州省荔波縣境內(nèi)最大的河流。樟江流域地處云貴高原東南過渡的斜面上，喀斯特地貌特征明顯，且地處亞熱帶季風濕潤氣候區(qū)，其徑流的季節(jié)變化和年際變化都比較大。其特殊的地貌和適宜的氣候造成了該流域復雜多樣的生態(tài)環(huán)境，為魚類的繁衍分化提供了優(yōu)渥的自然條件。自20世紀80年代至今，野生斑鱖一直是樟江流域的主要經(jīng)濟魚類，但是產(chǎn)量不高[7-9]。在我國野生鱖類資源下降的大趨勢下[10]，了解該水域野生斑鱖的遺傳變異特征及其多樣性水平，對開展野生斑鱖資源保護和開發(fā)利用具有重要意義。

當前，關于斑鱖的研究涉及形態(tài)學、個體生態(tài)學、繁殖生物學特性以及營養(yǎng)與飼料學等領域[11-16]，但主要集中在斑鱖的分子系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性和種群結構等方面[17-20]。遺傳多樣性研究是評估物種資源現(xiàn)狀、制定物種保護和管理策略的重要前提。王偉偉等[21-23]認為，我國斑鱖的不同地理群體大體能劃分成以秦嶺山脈為界的南北兩個群體；但Cao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，鴨綠江斑鱖群體和長江中上游的斑鱖群體具有較高的親緣性，不能簡單地按照地理屏障分為南北群體；而Chu等[24]則將斑鱖分成珠江群體和長江群體。貴州省境內(nèi)河流被苗嶺山脈劃為珠江水系和長江水系，豐富的水資源和發(fā)達的喀斯特地貌孕育了種類多樣的魚類資源。貴州境內(nèi)長江流域中一些支流的鱖類遺傳多樣性研究已有報道[6,20,25]，而貴州境內(nèi)珠江流域中柳江水系的一些主要支流的鱖類遺傳學評估尚未見報道。為填補貴州境內(nèi)珠江水域柳江水系上游斑鱖野生遺傳多樣性研究的空白，合理開發(fā)和利用野生斑鱖資源，并為保護野生斑鱖種質資源提供科學依據(jù)，筆者采用Cyt b基因作為分子標記，對柳江水系上游貴州省荔波縣境內(nèi)的樟江野生斑鱖的遺傳多樣性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年10月至2019年9月間，在貴州省樟江荔波縣河段的撈村鄉(xiāng)、小七孔景區(qū)和水春河景區(qū)3個點采集野生斑鱖共75尾(表1)。每尾樣本取背部肌肉組織3～5 g放入離心管中，加入無水乙醇固定，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 荔波野生斑鱖采樣信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用(肌肉、血液、組織)基因組DNA提取試劑盒(北京天根)提取野生斑鱖基因組DNA。用微量紫外分光光度計檢測其濃度及吸光值，1.0%瓊脂糖凝膠(1×TBE)電泳檢驗其完整性，將成功提取的DNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增及測序

擴增野生斑鱖線粒體Cyt b基因序列的引物參考文獻[18](表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應總體積為25 μL，其中模板DNA 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正、反引物各1 μL，用超純水補足體積。在PTC-200PCR擴增儀(AB 公司)進行擴增，PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，56.5 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s ，重復35個循環(huán)；再72 ℃延伸10 min，反應終產(chǎn)物4 ℃保存。

表2 引物名稱及序列

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠(1×TBE)電泳檢測，將目的條帶清晰的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司純化并雙向測序，測序引物為擴增引物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用DNAstar軟件[26]對測序結果進行序列編輯、比對和排序，并進行人工校對。采用MEGA 6.0軟件計算堿基組成、氨基酸含量、遺傳距離，并以花鱸(Lateolabraxmaculatus)為外群，運用鄰接法構建單倍型分子系統(tǒng)進化樹。使用DnaSP 5.0 軟件[27]計算單倍型數(shù)目、多態(tài)位點數(shù)目、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、變異位點、單一突變位點、簡約信息位點等。利用Tajima′sD中性檢驗和核苷酸不配對分析斑鱖種群歷史上是否發(fā)生過擴張。利用軟件Network 10.2按照荔波野生斑鱖單倍型頻率繪制神經(jīng)網(wǎng)絡圖，對單倍型間的進化關系進行分析。

2 結果與分析

2.1 荔波野生斑鱖Cyt b基因堿基組成和變異分析

經(jīng)校對和拼接，得到75條長度為1141 bp的Cyt b基因同源序列。序列中的堿基A、T、G和C的平均含量分別為24.4%、27.2%、15.5%和 32.9%，A+T的含量(51.6%)略高于G+C(48.4%)的含量，呈堿基偏倚性(表3)。75條Cyt b基因序列中，共檢測到1124個保守位點和17個變異位點，變異位點是分析位點總數(shù)的1.40%。其中：有8個為簡約位點，分別位于147、228、294、363、711、798、897和975位點；9個為單一多態(tài)位點，分別位于42、120、189、321、519、687、795、828和1078位點。這些突變位點中有14個轉換位點，分別位于120、189、228、294、321、363、519、687、711、795、798、897、975和1078位點；有3個顛換位點，分別位于42、147和828位點；未有插入和缺失位點(表4)。轉換/顛換比為5.34。

表3 荔波野生斑鱖群體線粒體DNA Cyt b基因單倍型堿基組成

表4 荔波野生斑鱖群體線粒體DNA Cyt b基因單倍型多態(tài)位點分布

2.2 荔波野生斑鱖種群的遺傳多樣性

75尾荔波野生斑鱖個體共定義了15個單倍型(Hap1～Hap15)，其中單倍型Hap15的個體數(shù)量最多，共46尾。荔波野生斑鱖群體的單倍體多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.613±0.064和0.00172±0.00021，平均核苷酸差異數(shù)為1.968，中性檢驗Tajima′sD值為-1.37917，且差異不顯著(P>0.10)(表5)。另外整體核苷酸不配對分析結果呈現(xiàn)雙峰趨勢(圖1)。

表5 荔波野生斑鱖的遺傳多樣性參數(shù)

圖1 荔波野生斑鱖線粒體DNA Cyt b序列核苷酸不配對分析

2.3 荔波野生斑鱖Cyt b單倍型聚類分析與簡約網(wǎng)絡圖

15個單倍型經(jīng)美國國家生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫中BLAST比對后發(fā)現(xiàn)：Hap15與珠江流域中西江水系的支流桂江斑鱖(登錄號：DQ648645)、長江流域洞庭湖水系湘江斑鱖(登錄號：JQ010988)和沅江斑鱖(登錄號：DQ274043)的Cyt b序列相似性為100%，說明該單倍型跨水系分布；Hap9、Hap13與長江流域洞庭湖水系的支流澧水斑鱖(登錄號：KC441451)和沅江斑鱖(登錄號：KC441448)的Cyt b序列相似性為100%；Hap10與長江中游右岸的支流陸水河斑鱖(登錄號：KC441435)和洞庭湖斑鱖(登錄號：JQ010986)的Cyt b序列相似性為100%；其他的單倍型與長江流域洞庭湖水系的斑鱖的Cyt b 序列相似性均超過99%?？偟膩碚f，荔波野生斑鱖群體的Cyt b與長江流域中上游斑鱖群體具有更高的相似性。從GenBank下載16條鱖亞科的線粒體Cyt b基因同源序列(表6)，以花鱸(Lateolabraxjaponicus)(登錄號：DQ351530)為外群，與本研究中的15種斑鱖單倍型一起，采用鄰接法構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。由圖2可見，斑鱖Cyt b單倍型與麻鱖(S.fortis)、波紋鱖(S.undulata)、暗鱖(S.obscura)、大眼鱖(S.knerigarman)及鱖(S.chuatsi)聚為一支，中國少鱗鱖(Coreopercawhiteheadi)則單獨聚為一支。其中荔波野生斑鱖的15個單倍型和長江流域中的洞庭湖水系及上游的支流陸水河斑鱖群體以100%的置信度單獨成支，與珠江流域中西江水系的斑鱖群體存在較大程度的分化。本研究中的15個荔波野生斑鱖Cyt b單倍型間的遺傳距離較小，最大值為0.006，最小值為0.001，平均遺傳距離為0.003(表7)。

表6 鱖類登錄號信息

圖2 基于Cyt b基因片段荔波野生斑鱖單倍型的鄰接法系統(tǒng)發(fā)生樹

表7 荔波野生斑鱖Cyt b基因序列15個單倍間及鱖類間的型遺傳距離(Kimura-2-parameter法)

由基于荔波野生斑鱖單倍型頻率繪制出的神經(jīng)網(wǎng)絡圖(圖3)可以看出，Hap10和Hap3位于網(wǎng)絡的中心區(qū)域，其他單倍型均由其衍生而來，其在進化出Hap1的連接節(jié)點單倍型未檢測到或已經(jīng)滅絕。中心區(qū)域進化出Hap5、Hap13，Hap13又發(fā)展出Hap4、Hap9、Hap14，再由Hap14進化出荔波的優(yōu)勢單倍型Hap15。

圖3 基于NETWORK軟件的荔波野生斑鱖單倍型簡約網(wǎng)絡

3 討 論

3.1 荔波野生斑鱖群體Cyt b基因片段的基因組成

線粒體DNA為母系遺傳，且具有基因保守、序列較小和進化速率快等特點，因此被廣泛應用于魚類系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳、種類鑒定和適應性進化研究中[28]。線粒體DNA中Cyt b基因是其重要的蛋白質編碼基因，具有豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息，進化速率適中，且易于使用通用引物擴增，是研究魚類系統(tǒng)發(fā)育最常用的分子標記[29]。本研究中，獲得了75條荔波野生斑鱖Cyt b基因同源序列，其中堿基G(15.5%)的含量最低，具有明顯的反G偏倚，符合一般硬骨魚類Cyt b基因的特征[30]。在這75條Cyt b基因同源序列中共檢測到17個變異位點，其中有14個轉換位點，3個顛換位點，沒有插入或丟失位點，結果符合同種魚類中線粒體DNA基因轉換在數(shù)量上遠超過顛換的特征[31]。

3.2 荔波野生斑鱖群體遺傳多樣性分析

遺傳多樣性通常是物種長期進化的結果，是物種或其群體持續(xù)生存并適應不斷變化的環(huán)境而不斷進化的前提[32]。本研究中，荔波斑鱖線粒體DNA Cyt b序列的Tajima′sD值為負，且核苷酸不配對分析圖呈雙峰，表明荔波野生斑鱖種群比較穩(wěn)定，未發(fā)生過明顯的種群擴張史[33]。單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)作為衡量一個物種或者種群遺傳變異度的重要指標，可以根據(jù)其數(shù)值的大小來判斷所研究的目標群體的遺傳多樣性的高低。荔波野生斑鱖群體的單倍型多樣性指數(shù)和核酸多樣性指數(shù)分別為0.613±0.064和0.00172±0.00021，呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征，與李珊等[20,34]的研究結果相同。在Grant等[35]的4種單倍型多樣性和核苷酸多樣性間的組合類型中，第2種“高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性”的遺傳多樣性類型與本研究結果相吻合，即在種群擴張過程中，種群數(shù)量的增加會導致單倍型多樣性的提高，但在較短時間內(nèi)無法積累核苷酸的變異，從而可能產(chǎn)生單倍型多樣性較高、核苷酸多樣性較低的遺傳模式。荔波野生斑鱖群體遺傳多樣性呈現(xiàn)這種特征的原因推測有兩方面：一方面，冰川時期生境的劇變，使斑鱖種群數(shù)量急劇下降，遺傳多樣性降低，即受到了遺傳瓶頸效益的影響，斑鱖在“瓶頸效應”之后, 種群經(jīng)過短期快速擴張，種群數(shù)量迅速擴大，有利于積累更多突變[5,36]；另一方面，近年來，除過度捕撈和棲息環(huán)境惡化的原因外，隨著斑鱖人工繁殖技術取得突破，人工繁殖群體的擴大、異地引種及管理不善等可能也是造成野生斑鱖的種質混雜、遺傳多樣性降低和本地種群的適應性下降的原因[37]。從遺傳多樣性水平看，荔波縣境內(nèi)的樟江河段野生斑鱖群體與清水江群體(單倍型多樣性0.8165，核苷酸多樣性0.0021)[20]，鴨綠江(單倍型多樣性0.735±0.085，核苷酸多樣性0.00120±0.00061)、浙江千島湖(單倍型多樣性0.0858±0.063，核苷酸多樣性0.00237±0.00007)、長江中游洞庭湖(單倍型多樣性0.800±0.044，核苷酸多樣性0.0128±0.00052)、長江下游秋浦河(單倍型多樣性0.686±0.080，核苷酸多樣性0.00076±0.00044)、閩江(單倍型多樣性0.773±0.0690，核苷酸多樣性0.0010±0.00050)、西江(單倍型多樣性0.914±0.079，核苷酸多樣性0.00164±0.00065)、北江(單倍型多樣性0.111±0.096，核苷酸多樣性0.00029±0.00044)、韓江(單倍型多樣性0.268±0.113，核苷酸多樣性0.00047±0.00037)等群體[34]，錢塘江的江山(單倍型多樣性0.570±0.078，核苷酸多樣性0.0018±0.0003)、烏溪江(單倍型多樣性0.668±0.067，核苷酸多樣性0.0019±0.0002)群體，甌江的云和群體(單倍型多樣性0.667±0.032，核苷酸多樣性0.0043±0.0006)[38]等野生斑鱖群體相比，其多樣性處于中等偏下水平。因此，保護漳江野生斑鱖種質資源對于保護中國斑鱖種質資源的基因遺傳多樣性具有十分重要的意義。

3.3 荔波野生斑鱖群體的遺傳分化

本研究中，15個斑鱖單倍型與其他鱖屬的麻鱖、波紋鱖、暗鱖、大眼鱖及鱖聚為單獨的一支，置信度為99%，少鱗鱖屬則以99%的置信度單獨成支，符合劉煥章等[39]的將鱖類分為鱖屬和少鱗鱖屬二個屬分類處理。從鱖亞科的系統(tǒng)發(fā)育樹看，斑鱖群體Cyt b單倍型以99%的置信度最先被分化出來聚在一起，剩下的鱖屬聚成兩大支，一支是麻鱖、波紋鱖，另一支包括大眼鱖、鱖和暗鱖，本研究結果支持斑鱖是鱖屬中最先分化出來的物種的觀點[40-41]。從長江群體和珠江群體親緣關系上來看，樟江雖然是珠江流域西江水系柳江支流龍江的上游河段，但是15個樟江野生斑鱖單倍型與長江中上流的支流陸水江斑鱖群體和洞庭湖水系斑鱖群體表現(xiàn)出更近的親緣性，歷史原因是：在早更新世時期，湘黔桂低山區(qū)未分異時[42]，這兩個區(qū)域的祖先斑鱖可能生活在一起，隨后因苗嶺山脈形成地理屏障后分開，其在不同河流水系雖然進化速度各異，但母系祖先單倍型仍得以保留。從荔波野生斑鱖的單倍型簡約網(wǎng)絡圖可以推測，Hap10和Hap3為樟江流域荔波河段斑鱖群體的祖先單倍型；Hap3和Hap10分別經(jīng)美國國家生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫中BLAST比對發(fā)現(xiàn)，與長江流域的支流陸水河(KC441435)及洞庭湖斑鱖(JQ010986)的相似性為99.9%以上，表明荔波樟江野生斑鱖群體與長江流域斑鱖群體有較高的親緣性，其結果與鄰接系統(tǒng)進化樹聚類結果相吻合。從單倍型間的遺傳距離和鄰接系統(tǒng)進化樹看，荔波野生斑鱖單倍型間的遺傳距離(0.001～0.006)非常低，所有單倍型聚為一支，表明荔波野生斑鱖種群內(nèi)沒有明顯的遺傳分化。本研究中的Hap15是跨珠江水系和長江水系分布的單倍型，與周文漪等[34,36]的研究中發(fā)現(xiàn)的斑鱖線粒體DNA Cyt b單倍型的有跨水系分布的情況相同。值得注意的是，不同的Cyt b單倍型的出現(xiàn)頻率有非常大的差異，其中優(yōu)勢單倍型Hap15的比例高達61.33%，而Hap1、Hap3、Hap6、Hap7、Hap8、Hap11、Hap12、Hap13、Hap14等9個單倍型分別僅為1.33%，需要警惕的是，野生斑鱖種群一旦失去這些數(shù)量較少的單倍型，將會導致斑鱖的遺傳多樣性降低。因此，對于荔波野生斑鱖種質資源的保護除了設立種質資源保護區(qū)禁捕和改善水域棲息環(huán)境外，還應科學預防人為因素可能帶來的不利影響。

4 結 論

物種的遺傳多樣性或變異性越豐富，則表明該物種的進化潛力越大，對環(huán)境改變響應的進化能力就越強[43]。筆者基于線粒體DNA Cyt b基因序列首次調查了樟江荔波縣河段的野生斑鱖的遺傳多樣性水平，結果顯示，該水域野生斑鱖群體呈現(xiàn)高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性，與國內(nèi)其他水系的野生斑鱖群體相比，其多樣性處于中等偏下水平，且無種群擴張史。此外，對15個單倍型進行美國國家生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫中BLAST比對和構建系統(tǒng)發(fā)育樹的結果表明，雖然樟江是珠江流域西江水系中柳江的支流，但相對于珠江水系，其野生斑鱖群體與長江水系的斑鱖群體擁有更近的親緣關系。這些都為樟江野生斑鱖種質資源的保護和合理開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。但是，本研究中荔波野生斑鱖進化出Hap1的連接節(jié)點單倍型出現(xiàn)缺失，是樣本量不夠大而未能檢測到，還是該單倍型已經(jīng)滅絕，需進一步調查研究。最后，為維持該流域野生斑鱖群體的可持續(xù)發(fā)展和提高其遺傳多樣性水平，建議可以采取設立野生斑鱖種質資源保護區(qū)、有選擇地人工引種和增殖放流等措施。