汪桂宇，王璐明，巫旗生，岑雙雙，馬 曉，李學軍

( 1.河南師范大學 水產學院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.福建省水產研究所，福建 廈門 361000 )

雌激素功能廣泛，是非哺乳脊椎動物性別分化的關鍵，也參與動物機體脂代謝。雌激素促進肝臟中甘油三酯、膽甾醇酯、游離脂肪酸的合成，并組裝成極低密度脂蛋白[1-2]。雌激素失調會影響脂肪細胞分化、脂解作用和脂質合成[3]。由芳香化酶基因(Cyp19a1基因)編碼的芳香化酶，是雄烯二酮、睪酮轉化為雌酮和雌二醇的關鍵酶[4-5]。Cyp19a1基因敲除的小鼠會產生性逆轉，同時腹部和肝臟部位的脂肪含量明顯增加[6]。此外，高脂飲食也會導致雄性小鼠脂肪組織芳香化酶的表達量增加，引起機體雌激素水平升高[7]。以上結果表明，芳香化酶在雌激素脂代謝中扮演著重要角色[8]。

雌激素受體拮抗劑是一種甾體類選擇性雌激素受體調節(jié)劑、雌激素受體的特異性拮抗劑[9]。有研究報道，雌二醇通過激活腦內雌激素受體抑制女性的進食行為。去卵巢的雌性大鼠后腦灌注雌激素受體拮抗劑，可明顯減弱雌二醇對食物攝取的抑制作用[10]。來曲唑作為人工合成的第3代非甾體類選擇性芳香化酶抑制劑被廣泛應用于性別分化相關研究[11]。芳香化酶抑制劑和激素受體拮抗劑處理試驗結果一致，均可改變大鼠性別[12]。來曲唑通過結合芳香化酶中亞鐵血紅素的鐵原子，抑制芳香化酶活性，進而抑制雄激素轉化為雌激素，使雌激素水平下降。雌激素功能發(fā)揮需要與其受體結合，肝臟中的脂代謝基因受雌激素受體的調控[13]。因此，降低雌激素水平或干擾其作用途徑均會影響到機體脂代謝水平。

中華鱉(Pelodiscussinensis)屬爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬[14]，俗稱水魚、甲魚、團魚等，是我國重要的特種經濟水生動物之一，具有較高的經濟價值[15]。雄性中華鱉具有生長速度快、抗逆性強、裙邊寬厚等優(yōu)點[16]，因此性腺分化與發(fā)育是中華鱉相關研究的重要內容[17]。通過抑制雌激素合成培育出全雄個體，是魚類單性育種的主要手段[18]。芳香化酶在暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)雌性性腺分化功能維持上發(fā)揮重要作用[19]。利用芳香化酶抑制劑來曲唑，降低暗紋東方鲀稚魚性腺型芳香化酶的基因表達，導致雌性稚魚的性逆轉[20]。中華鱉性別分化過程中，雌激素合成關鍵基因芳香化酶表達降低，也可以培育性逆轉的雄性個體[16]。然而，雌激素分布于動物多個器官，具有多重功能。有研究表明，雌激素缺乏會導致雌性斑馬魚(Daniorerio)體內脂代謝失調[21-23]，但其他水產動物脂代謝的相關研究尚少。

脂肪在中華鱉生長發(fā)育和生殖發(fā)育過程中必不可少。據(jù)報道，性成熟的關鍵時期，2齡中華鱉，生殖性腺增長增大，雄鱉睪酮和雌二醇合成量達到峰值[8]。其中，雌二醇是雄性性腺發(fā)育過程中的重要雌激素。雌激素受體拮抗劑與芳香化酶抑制劑2種藥物能分別阻斷雌激素與受體結合及雌激素合成，通過影響雌激素的功能影響性腺發(fā)育，改變性腺對脂類物質的需求，從而影響中華鱉的脂肪代謝。

為探究中華鱉雌激素和脂代謝的關系，筆者在雄性中華鱉腹腔中注射芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑，分析肝臟組織形態(tài)和Cyp19a1基因、脂代謝基因(Fas、Scd、Pparγ、Bmp4、Stat3基因)表達變化，討論中華鱉體內雌激素缺乏后對脂代謝的影響，為后續(xù)采用性激素誘導、基因編輯等技術培育全雄個體提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 雌激素受體拮抗劑和芳香化酶抑制劑處理

試驗用健康2齡雄性中華鱉(300～350 g)取自固始縣晨源水產養(yǎng)殖專業(yè)合作社，飼養(yǎng)在河南師范大學水產基地。設置對照組、高劑量組和低劑量組3組，每組5只中華鱉。分別使用7、14 mg/(kg·d)的雌激素受體拮抗劑(索萊寶，中國)和5、10 mg/(kg·d)來曲唑試劑(索萊寶，中國)對中華鱉進行腹腔注射。處理組以二甲基亞砜作為溶劑[24]，對照組注射等體積的二甲基亞砜。每周對中華鱉進行腹腔注射1次，雌激素受體拮抗劑注射6周，芳香化酶抑制劑注射7周；采樣前禁食12 h，于雌激素受體拮抗劑處理后1、4、42 d和芳香化酶抑制劑處理后1、2、3、49 d收集肝臟組織，對照組分別在處理后1、2、3、4、42、49 d收集樣品。冰上進行取樣，樣品經液氮快速冷凍，-80 ℃儲存。取雌激素受體拮抗劑處理后的肝臟組織，保存在多聚甲醛溶液中備用。

1.2 油紅O染色

肝臟組織在多聚甲醛溶液中固定24 h，冰凍切片包埋劑包埋后，進行冷凍切片，切片厚15 μm。切片復溫干燥，用體積分數(shù)10%的福爾馬林固定15 min，蒸餾水沖洗，用體積分數(shù)60%的異丙醇內浸洗20～30 s晾干。再將切片組織放入新鮮過濾的油紅O工作液中浸染8～10 min(加蓋避光)，60%異丙醇清洗，去除染液。Mayer蘇木精染色液復染1～2 min，純水浸洗后，用體積分數(shù)1%的鹽酸溶液分化，蒸餾水清洗。稀碳酸鋰溶液促藍，沖洗后鏡檢。甘油明膠或阿拉伯糖膠封固后，使用Leica DM 60008顯微鏡觀察并拍照。

1.3 總RNA提取

Trizol法提取肝臟組織總RNA，1%體積分數(shù)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，紫外分光光度法測定濃度，使用反轉錄試劑盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)獲得第一鏈cDNA，以1 μg 總RNA為模板逆轉錄合成cDNA。

1.4 實時熒光定量分析

相關基因引物根據(jù)美國國家生物技術信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中華鱉基因組序列設計，使用Primer Premier 5.0軟件設計定量引物(表1)。Gapdh基因作內參，進行實時熒光定量PCR，試驗流程參照Bio-Rad SYBR實時熒光定量PCR測定試劑盒的操作說明。熒光定量PCR反應體系(10 μL)：2×SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，大連)5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL；反應程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個處理設置3個平行。

表1 用于實時熒光定量PCR分析的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)分析

用2-ΔΔCt法計算熒光定量相對表達水平，結果用平均值±標準誤表示。運用SPSS 20.0軟件對表達數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，檢驗通過后進行雙因素方差分析，顯著性差異水平設置為0.05。

2 結 果

2.1 不同劑量的雌激素受體拮抗劑處理后油紅O染色結果

經雌激素受體拮抗劑處理的肝臟組織，冷凍切片油紅O染色后，于光學顯微鏡下觀察。肝臟組織內脂滴被親脂的油紅O著色而呈鮮紅色，細胞核因蘇木精著色而呈藍色(圖1)。由圖1a、b可見，經染色后，細胞核呈藍色，細胞質無色。雌激素受體拮抗劑處理后，脂滴呈深紅色。低劑量雌激素受體拮抗劑處理組的脂滴在胞質內的積累量明顯增加(圖1c、d)。高劑量雌激素受體拮抗劑處理組的脂肪細胞體積顯著增大(圖1e、f)。

圖1 不同劑量雌激素受體拮抗劑處理肝臟組織

2.2 芳香化酶抑制劑與雌激素受體拮抗劑處理對肝臟內雌激素代謝基因表達的影響

不同劑量的雌激素受體拮抗劑處理后1 d，隨劑量增加Cyp19a1基因表達量降低，處理后4、42 d，隨劑量增加Cyp19a1基因表達量顯著升高(P<0.05，圖2a)。芳香化酶抑制劑處理后1 d，低劑量組表達量降低，高劑量組表達量升高；處理后2 d，低劑量組顯著升高，高劑量組降低(P<0.05)；處理后3 d，處理組的表達量顯著升高(P<0.05)；處理后49 d，低劑量組表達量升高，高劑量組表達量降低(P<0.05，圖2b)。

圖2 芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑注射雄鱉后Cyp19a1基因表達

2.3 芳香化酶抑制劑與雌激素受體拮抗劑處理對脂肪代謝相關基因表達的影響

雌激素受體拮抗劑處理后1、4 d，處理組Fas基因表達量降低，42 d后處理組表達量顯著升高(P<0.05，圖3a)。同樣，在雌激素受體拮抗劑處理42 d后處理組Pparγ基因表達量顯著升高(P<0.05，圖3b)。雌激素受體拮抗劑處理后1 d，隨劑量增加Scd基因表達量降低，4 d后，低劑量組Scd基因表達量升高，高劑量組表達量降低，42 d后處理組表達量均顯著升高(P<0.05，圖3c)。雌激素受體拮抗劑處理后42 d，隨劑量增加，Stat3基因表達量顯著升高，處理組Bmp4基因的表達量也顯著升高(P<0.05，圖3d、e)。

圖3 雌激素受體拮抗劑處理后脂代謝基因表達

芳香化酶抑制劑處理后1、2、3 d，隨劑量增加Fas基因表達量顯著升高，49 d后低劑量組Fas基因表達量升高，高劑量組表達量無顯著差異(P<0.05，圖4a)。芳香化酶抑制劑處理后2、3 d，高劑量組Pparγ基因表達量顯著升高(P<0.05，圖4b)。經過芳香化酶抑制劑處理后1、2 d，處理組Scd基因表達量顯著升高(P<0.05，圖4c)。芳香化酶抑制劑處理后2 d，隨劑量增加Stat3基因表達量顯著升高(P<0.05，圖4d)。芳香化酶抑制劑處理后3 d，處理組Bmp4基因表達量顯著升高(P<0.05，圖4e)。

圖4 芳香化酶抑制劑處理后脂代謝基因表達

3 討 論

3.1 雌激素缺乏對雄性中華鱉脂代謝的作用

雌激素在動物體內有廣泛的生理功能，也是非哺乳動物性別分化的關鍵影響因素。雌激素及其編碼基因(Cyp19a1基因)是水產動物育種研究中的關鍵基因，通過抑制雌激素功能發(fā)揮或降低Cyp19a1基因表達，均會導致遺傳雌性個體性腺分化過程發(fā)生性逆轉。因此，可以通過降低激素水平或編輯Cyp19a1基因培育全雄群體，但雌激素缺乏對雄性個體的影響研究尚少。筆者通過腹腔注射芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑，研究雌激素缺乏后雄性中華鱉脂代謝的變化，為后續(xù)中華鱉全雄群體的培育和養(yǎng)殖提供參考。

3.2 雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉肝臟組織脂滴形態(tài)變化

雌激素對動物脂代謝有重要的調控作用。在裸鼠中，高雌激素環(huán)境脂肪細胞體積顯著減小，低雌激素環(huán)境脂肪細胞肥大[25]。雌激素受體拮抗劑處理后雄性體內也會產生脂肪堆積[26]。本試驗中，雌激素受體拮抗劑處理后，中華鱉肝臟組織中形成明顯的脂滴，脂肪含量增加，脂肪細胞體積增大，且高劑量組的脂滴含量明顯高于低劑量組。這一結果表明，雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉體內出現(xiàn)了脂肪積聚，且呈劑量效應。

3.3 雌激素受體拮抗劑處理后Cyp19a1基因和脂代謝相關基因表達模式

為研究雌激素受體拮抗劑處理對脂肪合成和分解代謝的影響，筆者通過實時熒光定量PCR分析相關基因表達。Fas、Pparγ、Scd和Stat3基因是脂代謝過程中脂肪沉積的相關基因，分別調控甘油三酯的合成、肌內脂肪的含量、單不飽和脂肪酸的合成及脂肪的合成，Bmp4基因參與脂肪的分解過程[27-31]。不同劑量雌激素受體拮抗劑處理1 d后，隨劑量增加Cyp19a1基因表達量降低，可能是由于雄鱉體內雌激素合成減少所致，這與姚亞運等[23]在斑馬魚中的相關研究結果一致。處理4、42 d后，隨劑量增加Cyp19a1基因表達量反而顯著上升(P<0.05)，可能是藥物處理導致雄鱉體內雌激素缺乏，動物機體出現(xiàn)的反饋機制。兩種劑量的雌激素受體拮抗劑均引起Fas基因表達量的顯著升高，促進體內甘油三酯合成，增加脂肪沉積。1、4 d處理組Fas基因表達量降低，可能是Cyp19a1基因表達降低所引起的反饋調節(jié)。1、4 d處理組基因Pparγ基因和Stat3基因在高劑量組中表達量顯著升高，Scd基因和Bmp4基因在處理42 d后的低劑量組中表達量顯著升高，高劑量表達量低于劑量組，表明不同劑量的芳香化酶抑制劑處理對脂肪調節(jié)代謝有顯著性差異。42 d后處理組Fas基因表達量增加，肝組織脂肪沉積，這與肝臟組織油紅O染色后觀察結果一致。處理后42 d，脂肪分解相關的Bmp4基因表達量升高，脂肪沉積相關的Scd、Pparγ和Stat3基因表達量增加。這與Phrakonkham等[32]研究結果一致，雌激素干擾后，F(xiàn)as基因和Pparγ基因的表達量均上調。本試驗結果表明，雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉肝臟脂肪分解和合成代謝增強，脂肪含量增加。

3.4 芳香化酶抑制劑處理后Cyp19a1基因和脂代謝相關基因表達模式

來曲唑芳香化酶抑制劑處理雄性中華鱉后，其芳香化酶活性降低，導致成熟精子數(shù)目減少[33]。本試驗中，芳香化酶抑制劑處理后49 d，低劑量組Cyp19a1基因表達量升高，高劑量組Cyp19al基因表達量降低，表明雌激素的合成途徑受到影響，且呈劑量效應。Fas、Scd和Pparγ基因在芳香化酶抑制劑處理1、2、3 d后表達量呈上升趨勢，表明甘油三酯和單不飽和脂肪酸合成增加，肌內脂肪含量增加。Stat3基因在芳香化酶抑制劑處理2 d后隨劑量增加表達量顯著升高，Bmp4基因在處理2 d后表達量升高，3 d后表達量顯著升高(P<0.05)。芳香化酶抑制劑處理后1、2、3 d脂代謝相關基因的高表達，說明芳香化酶抑制劑處理前期引起脂肪積累。芳香化酶抑制劑處理后49 d，Pparγ、Stat3和Bmp4基因表達量降低，表明芳香化酶抑制劑處理后期脂代謝積累調控途徑受到抑制。Fas基因在低劑量組和Scd基因在高劑量組中的表達量升高，表明芳香化酶抑制劑的劑量干擾脂肪代謝情況，低劑量組和高劑量組均有脂肪積累。芳香化酶抑制劑和雌激素受體拮抗劑在脂代謝調控中的差異，說明雌激素介導的脂肪代謝調控網絡與體內的雌激素濃度或受抑制程度顯著相關，但具體的調控機制有待進一步研究。

4 結 論

使用抗雌激素藥物會使雄性中華鱉脂代謝紊亂，導致肝臟內脂肪的積聚。雌激素受體拮抗劑處理后中華鱉肝臟脂肪分解和合成代謝增強，脂肪含量增加。芳香化酶抑制劑的劑量干擾脂肪代謝情況，低劑量組和高劑量組均有脂肪積累，說明這種代謝紊亂受抗雌激素藥物濃度的影響。筆者探究了中華鱉脂肪代謝調控的途徑過程，雌激素及其受體與脂肪代謝的相關調節(jié)過程，結果可為培育高質量“全雄鱉”提供理論依據(jù)。