高瑩瑩，劉新富，胡 鵬，黃 濱，劉 濱

( 1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071; 4.內(nèi)江師范學(xué)院，四川 內(nèi)江 641100 )

暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)又名河鲀，是我國長江中下游地區(qū)重要淡水養(yǎng)殖種類，其營養(yǎng)價(jià)值豐富、肉質(zhì)鮮美，被稱為“魚中極品”[1]，但過去因受國內(nèi)市場禁止銷售的限制，多年以來養(yǎng)殖產(chǎn)量一直在1×104～2×104t內(nèi)波動[2]。2016年9月農(nóng)業(yè)部辦公廳和國家食品藥品監(jiān)督管理總局辦公廳聯(lián)合發(fā)布《關(guān)于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營的通知》[3]，解除了自1990年開始實(shí)施的暗紋東方鲀不準(zhǔn)市場流通的禁令，國內(nèi)市場的開放為暗紋東方鲀產(chǎn)業(yè)的二次創(chuàng)業(yè)和可持續(xù)發(fā)展提供了新的契機(jī)。

暗紋東方鲀雌雄個(gè)體體長生長規(guī)律相似，但在2.5齡前雄魚體質(zhì)量生長速度大于雌魚[4]，且雄魚精巢被認(rèn)為是難得的珍貴食材，有“西施乳”的美譽(yù)。一對精巢的價(jià)值甚至超過雄魚本身，養(yǎng)殖全雄苗種的利潤是養(yǎng)殖普通苗種的1.5倍以上。因此，生產(chǎn)和養(yǎng)殖全雄暗紋東方鲀，可以大幅度提高我國暗紋東方鲀的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。但遺憾的是，目前有關(guān)暗紋東方鲀的性別調(diào)控機(jī)制及其性控技術(shù)的研究還較少。

雌激素在促進(jìn)魚類卵巢的分化、成熟和保持雌性性別特征的過程中起著十分重要的調(diào)控作用[5]，而P450芳香化酶(P450arom)是細(xì)胞色素P450超家族中的一員，是類固醇代謝中的一種酶復(fù)合體，是催化脊椎動物雄激素芳構(gòu)化合成雌激素的一種關(guān)鍵酶，因此P450芳香化酶成為各大研究學(xué)者探索魚類性別分化過程中分子調(diào)控機(jī)制的重要研究對象[6]。在大多數(shù)哺乳動物中，芳香化酶是芳香化酶19基因的產(chǎn)物，由單一基因編碼，但在硬骨魚類中存在兩種異構(gòu)體芳香化酶基因，即性腺型芳香化酶基因(cyp19a)和腦型芳香化酶基因(cyp19b)[7-8]。諸多研究表明，性腺型芳香化酶在早期雌性性別分化和卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，芳香化酶抑制劑和RNA干擾處理后引起中華鱉(Pelodiscussinensis)雌性向雄性方向逆轉(zhuǎn)，而性腺型芳香化酶過表達(dá)處理后則導(dǎo)致中華鱉雄性性腺呈現(xiàn)典型的雌性特征[9]；芳香化酶抑制劑來曲唑抑制暗紋東方鲀仔魚性腺型芳香化酶的基因表達(dá)，導(dǎo)致稚魚的原始卵巢退化，且向功能性精巢發(fā)育[10]；芳香化酶抑制劑來曲唑通過抑制內(nèi)源性雌二醇的合成，誘導(dǎo)已分化的赤點(diǎn)石斑魚(Epinephelusmerra)雌魚向雄性轉(zhuǎn)化[11]。到目前為止，已經(jīng)克隆得到一些魚類的性腺型芳香化酶基因序列，如翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)[12]、食蚊魚(Gambusiaaffinis)[13]、綠鰭馬面鲀(Navodonseptentrionalis)[8]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[14]、條斑星鰈(Veraspermoseri)[15]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[16]和黃顙魚(Pelteobagrusflvidraco)[17]等。證實(shí)了性腺型芳香化酶在雌性性腺分化和功能維持上發(fā)揮著十分重要的作用。在此基礎(chǔ)上，筆者以暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，?yīng)用分子生物學(xué)方法，擴(kuò)增并克隆性腺型芳香化酶基因的cDNA全長序列，從分子水平分析暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因的序列結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物信息學(xué)特征，并應(yīng)用相對定量RT-PCR技術(shù)對性腺型芳香化酶基因mRNA在不同組織和不同發(fā)育期中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在為研究暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的遺傳特性及相關(guān)生理的功能研究奠定基礎(chǔ)，為河鲀魚類性別分化過程中分子調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究提供重要參考，同時(shí)為培育暗紋東方鲀?nèi)勖绶N，實(shí)現(xiàn)單性良種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

暗紋東方鲀樣本購自江蘇省南通市中洋集團(tuán)股份有限公司，車間循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi)養(yǎng)殖，日投喂2～3次，水溫為22～26 ℃。分別采集孵化后60、90、120日齡和150日齡幼魚，雌魚和雄魚各取12尾，每個(gè)時(shí)期各取3尾，體長分別為(7.2±0.8)、(8.5±0.6)、(10.3±0.9) cm和(14.4±1.1) cm，分別剖取卵巢和精巢組織，置于RNA Store保存液中，-20 ℃冷凍保存，用于暗紋東方鲀幼魚不同發(fā)育期性腺組織性腺型芳香化酶基因相對表達(dá)量的檢測。

選取1齡雌魚和雄魚成魚各3尾，分別剖取下丘腦、腦、垂體、性腺、心臟、肝臟、膽、胃、腸、肌肉、眼等組織，置于RNA Store保存液中，-20 ℃冷凍保存，用于暗紋東方鲀不同組織中性腺型芳香化酶基因相對表達(dá)量的檢測。

1.2 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶cDNA全長克隆

采用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa，大連)提取暗紋東方鲀卵巢組織總RNA，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，NanoDrop2000(Thermo Scientific，美國)超微量分光光度計(jì)測定總RNA含量。以暗紋東方鲀卵巢總RNA為模板，按照SMARTer?RACE5′/3′Kit User Manual(Clontech，美國)說明書合成cDNA第一鏈。

根據(jù)已知河鲀魚類的保守序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物F1/R1和F2/R1(表1)，以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行性腺型芳香化酶基因保守片斷的擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系：Premix Ex TaqTM12 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板2 μL，滅菌水10 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工生物工程有限公司測序。

根據(jù)獲得的保守片段序列設(shè)計(jì)特異性引物3′-RACE-F3、3′-RACE-F4、3′-RACE-F5和5′-RACE-R2、5′-RACE-R3(表1)，用于RACE擴(kuò)增性腺型芳香化酶基因cDNA全長序列。使用SMART RACE試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE的半巢式PCR擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)體系：PCR-Grade H2O 17.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5 μL，3′/5′ RACE cDNA 1.0 μL，UPM(10×)2.5 μL，3′/5′ RACE引物0.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)。第二輪PCR反應(yīng)體系：PCR-Grade H2O 18 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5 μL，第一輪3′/5′ RACE PCR產(chǎn)物(稀釋50倍)2.5 μL，UPS 0.5 μL，3′/5′ RACE引物0.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據(jù)膠回收試劑盒(天根，北京)說明書對目的條帶切膠后進(jìn)行純化回收。切膠回收的PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體(全式金生物，北京)連接，采用熱激法將5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至20 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金生物，北京)，在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單一克隆菌落繼續(xù)培養(yǎng)2 h。菌液PCR鑒定后，將含有目的條帶的菌液送至上海生工生物工程有限公司測序。

采用DNAstar軟件將5′-RACE、保守片段和3′-RACE的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全長序列。

1.3 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因的表達(dá)分析

取適量暗紋東方鲀雌魚和雄魚成魚下丘腦、腦、垂體、性腺、心臟、肝臟、膽、胃、腸、肌肉、眼等組織，幼魚60、90、120日齡和150日齡的卵巢和精巢組織，采用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，NanoDrop2000測定總RNA含量。以暗紋東方鲀雌魚和雄魚提取的不同組織和不同發(fā)育期性腺組織的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)說明書合成cDNA第一鏈。

表1 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因克隆及熒光定量引物Tab.1 Cloning and fluorescence quantitative primers of gonadal aromatase gene in puffer T. obscurus

根據(jù)已獲得的性腺型芳香化酶基因序列，采用DNAMAN設(shè)計(jì)特異性引物cyp19a-F/R(表1)，以暗紋東方鲀雌魚和雄魚成魚不同組織以及幼魚不同發(fā)育期性腺組織的cDNA第一鏈為模板，以β-actin為內(nèi)參基因，采用RT-PCR方法在Line Gene 9600型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(博日，杭州)上檢測性腺型芳香化酶在暗紋東方鲀成魚不同組織和幼魚不同發(fā)育期中的相對表達(dá)量。20 μL反應(yīng)體系：2×SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，滅菌水6.4 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，55 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)步驟參考SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa，大連)操作說明。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR獲得一系列Ct值，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，分析方法為單因素方差分析，即當(dāng)P<0.05時(shí)為差異顯著，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.4 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的生物信息學(xué)分析

獲得的全長序列在美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，推斷其開放閱讀框序列并進(jìn)行同源性分析后完成注冊(登錄號：MH218815)；使用DNAMAN軟件進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)的氨基酸多重序列比對分析；利用Mega 5.1軟件構(gòu)建基于鄰位相接法和最大似然法的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并采用1000次自舉檢驗(yàn)分析評估進(jìn)化樹分支節(jié)點(diǎn)的置信度。

借助ExPASy ProtParam工具推斷蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；使用ExPASy ProtScale程序分析蛋白質(zhì)的疏水性；采用PSORT Ⅱ Prediction工具定位蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞；利用TMHMM Server 2.0程序分析跨膜區(qū)；采用SignalIP 4.1、TargetP 1.1 Server和TatP 1.0 Server分別預(yù)測信號肽剪切位點(diǎn)；使用NetPhos 3.1 Server程序預(yù)測磷酸化位點(diǎn)；使用 NetNGlyc 1.0程序預(yù)測糖基化位點(diǎn)；利用SMART和PROSITE工具分別分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域及其功能域位點(diǎn)；借助SOPMA和SWISS-MODEL工具分別預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶cDNA全長克隆和序列分析

通過半巢式PCR得到477 bp長度的部分編碼區(qū)片段(圖1a)，采用RACE技術(shù)得到5′-RACE序列長度為225 bp(圖1b)，3′-RACE序列長度為1392 bp(圖1c)。拼接得到1786 bp的暗紋東方鲀性腺型芳香化酶cDNA全長序列，包括5′非編碼區(qū)35 bp和3′非編碼區(qū)206 bp，開放閱讀框1545 bp，編碼514個(gè)氨基酸，氨基酸序列中包含I-螺旋區(qū)(301～332位)、Ozol′s肽區(qū)(357～379位)、芳香化酶特異性保守區(qū)(388～411位)和亞鐵血紅素結(jié)合區(qū)(438～451位)(圖2)。

圖1 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因部分編碼區(qū)(a)、 5′-RACE(b)和3′-RACE(c)電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of partial coding region of gonadal aromatase gene (a), 5′-RACE (b) and 3′-RACE (c) in puffer T. obscurus

2.2 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

同源性分析結(jié)果顯示，暗紋東方鲀性腺型芳香化酶與紅鰭東方鲀(NM_001280028.1)、星點(diǎn)東方鲀(T.niphobles，KX499501.1)、花鱸(Lateolabraxmaculatus，KP335158.1)、白姑魚(Pennahiaargentata，LC317123.1)、斜帶石斑魚(E.coioides，AY510711.1)、細(xì)須石首魚(Micropogoniasundulatus，DQ184486.1)、尖吻鱸(Latescalcarifer，AY684256.1)、條斑星鰈(FJ169904.2)、許氏平鲉(Sebastesschlegelii，F(xiàn)J594995.2)、鱖魚(S.chuatsi，KX911988.1)、平鯛(Rhabdosargussarba，DQ345786.1)、鯔魚(Mugilcephalus，AY859425.1)、黃鱔(Monopterusalbus，EU252487.1)、雙帶雙鋸魚(Amphiprionsebae，KP260920.1)和青鳉(Oryziasmelastigma，JX454653.1)等15種性腺型芳香化酶基因核苷酸序列的相似性分別為99%、99%、85%、85%、84%、84%、84%、84%、83%、83%、83%、82%、82%、82%和81%，說明克隆得到的基因?qū)儆赑450家族。

氨基酸多重序列比對分析結(jié)果顯示，哺乳動物或魚類的性腺型芳香化酶氨基酸序列均十分保守(圖3)?；卩徫幌嘟臃ê妥畲笏迫环?gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹完全一致，僅在節(jié)點(diǎn)支持率方面略有不同。結(jié)果表明，系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為兩個(gè)大支：哺乳類、鳥類和兩棲類聚為一大支，所有魚類聚為另一大支。其中暗紋東方鲀位于魚類這個(gè)分支中，且與同屬的紅鰭東方鲀和星點(diǎn)東方鲀聚為一個(gè)小分支，親緣關(guān)系最近，其次是鱸形目的斜帶石斑魚、細(xì)須石首魚和黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)等魚類，而與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、雞(Gallusgallus)、人(Homosapiens)和鼠(Musmusculus)等較高等脊椎動物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

2.3 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶結(jié)構(gòu)與功能分析

2.3.1 基本理化性質(zhì)分析

性腺芳香化酶的基本理化性質(zhì)：相對分子量58.23 ku，等電點(diǎn)6.29，分子式C2605H4119N711O754S24，總原子數(shù)8213。成熟蛋白質(zhì)中含有帶負(fù)電荷的酸性氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)和帶正電荷的堿性氨基酸(精氨酸+賴氨酸)分別為56和51個(gè)。摩爾消光系數(shù)為61 140。不穩(wěn)定系數(shù)為38.97，屬于穩(wěn)定蛋白?？偲骄杷笖?shù)為-0.092，屬于親水性蛋白，且在第1～100、300～350位氨基酸處含有2個(gè)典型的疏水性區(qū)域(圖5)。

圖2 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因cDNA 及其編碼的氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of gonadal aromatase gene in puffer T. obscurus ATG.起始密碼子；TGA(*).終止密碼子；□. 跨膜螺旋區(qū)(TMⅠ～TMⅡ)；●.潛在的N糖基化位點(diǎn)；灰色陰影區(qū)自上到下分別為Ⅰ-螺旋區(qū)、Ozol′s肽區(qū)、芳香化酶特異性保守區(qū)和亞鐵血紅素結(jié)合區(qū). ATG. initiation codon； TGA (*). termination codon; the position of the one predicted transmembrane domain (TMⅠ～TMⅡ) is showed as black box; potential N-glycosilation sites is indicated by closed black circle; grey shadows from top to bottom are the I-helix region, Ozol′s peptide region, specific conservative region of aromatase and heme-ferrous binding region, respectively.

2.3.2 性腺型芳香化酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，性腺型芳香化酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、空泡、高爾基體、質(zhì)膜、線粒體和細(xì)胞質(zhì)的概率為33.3%、22.2%、11.1%、11.1%、11.1%和11.1%，由此可推測，性腺型芳香化酶最有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡，屬于分泌蛋白。跨膜區(qū)分析結(jié)果顯示，該蛋白在36～53氨基酸處含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，方向?yàn)橛砂獾桨麅?nèi)；65～81氨基酸處含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，方向?yàn)橛砂麅?nèi)到胞外(圖6)。

2.3.3 信號肽、磷酸化和糖基化位點(diǎn)的預(yù)測

通過SignalP 4.1軟件分析暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的信號肽結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，在第17和30位氨基酸殘基處存在信號肽剪切位點(diǎn)的概率分別為0.206和0.250(圖7a)。采用TargetP 1.1 Server軟件分析發(fā)現(xiàn)其存在信號肽的概率為0.956，但剪切位點(diǎn)沒有預(yù)測到；采用TatP 1.0 Server軟件分析發(fā)現(xiàn)其在第30位氨基酸殘基處存在信號肽剪切位點(diǎn)的概率為0.565(圖7b)，這說明該蛋白可能存在長度為29個(gè)氨基酸的雙精氨酸信號肽結(jié)構(gòu)，從而推測該蛋白可能存在一種類似于細(xì)菌和植物中雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)方式。NetPhos 3.1分析性腺型芳香化酶磷酸化位點(diǎn)的結(jié)果表明，19個(gè)絲氨酸、17個(gè)蘇氨酸和2個(gè)酪氨酸可能會成為蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)(圖7c)。NetNGlyc 1.0分析性腺型芳香化酶糖基化位點(diǎn)的結(jié)果表明，其可能存在4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(圖7d)。

圖3 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶與其他物種氨基酸序列比對圖Fig.3 Comparison of Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of gonadal aromatase in T. obscures with the corresponding sequences from other species 序列中相同氨基酸殘基用黑色背景表示，同源性超過75%用粉紅色背景表示，同源性超過50%用淺藍(lán)色背景表示.序列號：黑鯛(AS)，AY273211；鯉魚(CC)，EU375455；人(HS)，NP_112503；花鱸(LM)，KP335158；尖吻鱸(LC)，AY684256；黃鱔(MA)，EU252487；鼠(MM)，NP_031836；許氏平鲉(SS)，F(xiàn)J594995；暗紋東方鲀(TO)，MH218815；條斑星鰈(VM)，F(xiàn)J169904. Position with>50% similarity are shaded in light blue, position with >75% similarity are shaded in pink, while completely conserved positions are shaded in black.Accession number: Acanthopagrus schlegelii (AS) AY273211 ,Cyprinus carpio (CC) EU375455, Homo sapiens (HS) NP_112503, Lateolabrax maculatus (LM) KP335158, Lates calcarifer (LC) AY684256, Monopterus albus (MA) EU252487, Mus musculus (MM) NP_031836, Sebastes schlegelii (SS) FJ594995, Takifugu obscures (TO) MH218815, and Verasper moseri (VM) FJ169904.

圖4 不同物種基于性腺型芳香化酶序列利用鄰位相接法和最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic trees of different species based on sequences of gonadal aromatase using neighbor contiguity method and maximum likelihood method 每個(gè)分支節(jié)點(diǎn)位于上面的支持率為鄰位相接法構(gòu)建進(jìn)化樹的支持率，位于下面且斜體的支持率為最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹的支持率. The support rate of each branch node on the top is the support rate of the evolutionary tree constructed by adjacent connection method, and the support rate at the bottom and in italics is the support rate of the evolutionary tree constructed by maximum likelihood method.

圖5 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的疏水性分析圖Fig.5 Hydrophobicity analysis of gonadal aromatase in puffer T. obscures

2.3.4 性腺型芳香化酶保守結(jié)構(gòu)域分析和功能域預(yù)測

采用SMART分析性腺型芳香化酶的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，該蛋白在41～50、60～494、250～284和319～330氨基酸殘基處分別有低復(fù)雜度區(qū)、Pfam、卷曲螺旋區(qū)和2個(gè)低復(fù)雜度區(qū)等保守結(jié)構(gòu)域(圖8a)。使用PROSITE在線預(yù)測性腺型芳香化酶的功能域，結(jié)果表明，第438～447位氨基酸殘基處可能是細(xì)胞色素P450半胱氨酸血紅素—鐵配體結(jié)合識別位點(diǎn)(圖8b)。

2.3.5 性腺型芳香化酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

采用SOPMA和SWISS-MODEL同源建模在線分析性腺型芳香化酶的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，性腺型芳香化酶二級結(jié)構(gòu)中-螺旋占46.89%，β-折疊占13.04%，β-轉(zhuǎn)角占4.86%，無規(guī)卷曲占35.21%(圖9)，這種二級結(jié)構(gòu)組成可使得性腺型芳香化酶構(gòu)象多樣化。性腺型芳香化酶三級結(jié)構(gòu)建模范圍為58～506位氨基酸，覆蓋率為87%。GMQE值為0.74，說明建模質(zhì)量較好。暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的三級結(jié)構(gòu)模型(圖10a)與GeneBank數(shù)據(jù)庫中公布的人性腺型芳香化酶的三級結(jié)構(gòu)模型(圖10b)相比，暗紋東方鲀性腺型芳香化酶三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)型與人相似，這說明該結(jié)構(gòu)域在不同的物種中具有高度的保守性。

圖6 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的跨膜區(qū)域Fig.6 Transmembrane region of gonadal aromatase in puffer T. obscures

圖7 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶信號肽剪切位點(diǎn)(a、b)、磷酸化位點(diǎn)(c)和糖基化位點(diǎn)(d)Fig.7 Signal peptide splice site(a, b), phosphorylation site (c) and glycosyl site (d) of gonadal aromatase in puffer T. obscurus

圖8 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的保守結(jié)構(gòu)域(a)和功能域(b)Fig.8 Conserved domain (a) and functional domain (b) of gonadal aromatase in puffer T. obscures

圖9 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶的二級結(jié)構(gòu)Fig.9 Secondary structure of gonadal aromatase in puffer T. obscures h.α-螺旋；e.β-折疊延伸鏈；t.β-轉(zhuǎn)角；c.無規(guī)則卷曲. h.alpha helix; e.beta extended strand; t.beta turn; c.random coil.

圖10 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶(a)和 人類性腺型芳香化酶(b)的三級結(jié)構(gòu)Fig.10 Tertiary structure of gonadal aromatase in puffer T. obscurus (a) and H. sapiens (b)

2.4 暗紋東方鲀各組織中性腺型芳香化酶基因的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對定量檢測性腺型芳香化酶基因在暗紋東方鲀雌魚各組織中的表達(dá)情況見圖11，結(jié)果顯示，雌魚的性腺型芳香化酶基因在肌肉中表達(dá)量最高，其次是在卵巢中，并與其他組織相比存在有顯著性差異(P<0.05)，而下丘腦、腦、垂體、肝臟、膽、腸、眼、心、胃中均有少量表達(dá)，但差異不顯著(P>0.05)；雄魚的性腺型芳香化酶基因在肌肉中表達(dá)量最高，在其他組織中有少量表達(dá)甚至不表達(dá)，肌肉中的表達(dá)量與其他組織相比存在顯著性差異(P<0.05)；暗紋東方鲀精巢中性腺型芳香化酶基因的表達(dá)量明顯低于卵巢(圖11)。不同發(fā)育期性腺中性腺型芳香化酶基因的表達(dá)水平分析結(jié)果表明，性腺型芳香化酶基因在60～150日齡期間卵巢中的表達(dá)量呈現(xiàn)出逐漸升高再降低的趨勢，其中60～120日齡內(nèi)幼魚卵巢中性腺型芳香化酶基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢并在約120日齡到達(dá)峰值，隨后逐漸降低，至150日齡時(shí)其表達(dá)水平基本與90日齡時(shí)相同；而性腺型芳香化酶基因在精巢中基本不表達(dá)(圖12)。

圖11 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因的組織表達(dá)Fig.11 Expression of gonadal aromatase gene in various tissues of puffer T. obscurus Hy.下丘腦； B.腦； P.垂體； G.性腺； L.肝； Ga.膽； I.腸； M.肌肉； E.眼； H.心； S.胃. 不同大寫字母表示雌魚不同組織間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示雄魚不同組織間差異顯著(P<0.05). Hy.hypothalamus; B.brain; P.pituitary; G.gonad; L.liver; Ga.gallbladder; I.intestine; M.muscle; E.eye; H.heart; S.stomach. The significant differences in female tissues are shown in capital letters (P<0.05), and the significant differences in male tissues are shown in different lower-case letters (P<0.05).

3 討 論

3.1 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶信號肽的結(jié)構(gòu)預(yù)測及功能分析

依賴N端的信號肽有兩種典型的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，分別為分泌途徑和雙精氨酸移位途徑，分泌途徑廣泛存在于真核生物、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中，而雙精氨酸移位途徑主要存在于細(xì)菌和植物中。通過SignalP 4.1軟件對信號肽的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，暗紋東方鲀性腺型芳香化酶不存在分泌途徑的信號肽結(jié)構(gòu)；但采用TargetP 1.1 Server軟件分析蛋白質(zhì)序列信號肽時(shí)發(fā)現(xiàn)，其存在信號肽的概率為0.956；采用TatP 1.0 Server軟件分析發(fā)現(xiàn)，其存在雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑信號肽的概率為0.565，但信號肽序列不存在典型的雙精氨酸標(biāo)志；故推測性腺型芳香化酶可能是一種非分泌蛋白，也有可能是一種分泌蛋白，分泌途徑比較特殊，類似于雙精氨酸移位途徑。亞細(xì)胞定位的預(yù)測結(jié)果表明，性腺型芳香化酶最有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡，在這方面已有文獻(xiàn)報(bào)道，芳香化酶在亞細(xì)胞水平上定位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體內(nèi)膜上[7]。疏水性和跨膜區(qū)的分析結(jié)果顯示，其存在兩個(gè)典型的疏水性區(qū)域和跨膜結(jié)構(gòu)，這說明性腺型芳香化酶是一種跨膜蛋白，且鄒立軍等[12]在研究中也提及P450芳香化酶是一種膜結(jié)合蛋白。暗紋東方鲀性腺型芳香化酶磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示，其存在38個(gè)磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，這說明性腺型芳香化酶基因在翻譯結(jié)束后可能存在磷酸化和糖基化的加工修飾。亞細(xì)胞定位、疏水性、跨膜區(qū)、磷酸化和糖基化的預(yù)測結(jié)果從側(cè)面為證實(shí)性腺型芳香化酶可能是一種分泌蛋白提供了有力的證據(jù)，但其分泌途徑尚未可知，可能類似于雙精氨酸移位途徑，也可能與其他蛋白結(jié)合，由其他蛋白攜帶跨膜。關(guān)于性腺型芳香化酶基因克隆的文獻(xiàn)很多，但有關(guān)其信號肽預(yù)測的研究卻寥寥無幾，且其預(yù)測范圍僅限于分泌途徑的信號肽，如食蚊魚[13]，因此暗紋東方鲀性腺型芳香化酶是存在于細(xì)胞質(zhì)中構(gòu)成自身結(jié)構(gòu)，還是與其他蛋白結(jié)合后由其他蛋白攜帶跨膜,有待進(jìn)一步的研究。

圖12 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因在不同發(fā)育期 性腺組織的相對表達(dá)Fig.12 The relative expression level of gonadal aromatase gene in gonad tissues of puffer T. obscurus at different developmental stages 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05). The significant differences are shown in different letters(P<0.05).

3.2 暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因的表達(dá)模式

通常情況下，目的基因的組織表達(dá)模式能夠在一定程度上反映該基因的生物學(xué)功能。熒光定量PCR結(jié)果顯示，暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因在卵巢中表達(dá)量較高，且明顯高于精巢，這與半滑舌鰨[18]和斑馬魚(Daniorerio)[19]的表達(dá)模式基本一致，除此之外，在肌肉中表達(dá)量最高，下丘腦、垂體和肝臟等其他組織中有也少量表達(dá)，這種性腺型芳香化酶基因在性腺以外的組織中也表達(dá)的情況在其他魚類中也有過報(bào)道，如翹嘴鱖[12]、大黃魚[14]和條斑星鰈[15]等，這種表達(dá)差異可能與魚的種類和發(fā)育時(shí)期有關(guān)。從魚的種類方面來說，性腺型芳香化酶基因在三倍體湘云鯽(Carassiusauratus)[20]、斑馬魚[21]、鯉魚[22]和綠鰭馬面鲀[8]等硬骨魚類中具有組織特異性表達(dá)，即卵巢特異性表達(dá)，在卵巢中表達(dá)量最高，在其他組織中有少量表達(dá)或不表達(dá)。從魚的發(fā)育時(shí)期方面來說，有研究表明，斑馬魚性腺型芳香化酶基因在卵黃發(fā)生過程中主要表達(dá)于濾泡中[23]；印度囊鰓鲇(Heteropneustesfossilis)[24]性腺型芳香化酶基因的表達(dá)水平在卵巢重復(fù)發(fā)育和卵泡卵黃累積早期逐漸升高，而在卵黃累積完成后迅速降低；綠鰭馬面鲀[8]性腺型芳香化酶基因表達(dá)量在卵巢重復(fù)發(fā)育時(shí)逐漸升高，同時(shí)卵黃逐漸積累，直到卵黃累積結(jié)束時(shí)達(dá)到最高值，排卵結(jié)束時(shí)達(dá)到最低值。進(jìn)一步對暗紋東方鲀不同發(fā)育期性腺中性腺型芳香化酶基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，性腺型芳香化酶基因在幼魚不同發(fā)育期卵巢中的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高再降低的表達(dá)趨勢，在精巢中則不表達(dá)，以上結(jié)果說明性腺型芳香化酶基因可能參與性腺分化后卵巢的發(fā)育、雌性特征的維持以及其他組織的發(fā)育等過程。

綜上所述，本試驗(yàn)首次克隆了暗紋東方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全長序列，利用生物信息學(xué)方法分析其序列結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)性質(zhì)等相關(guān)信息，并應(yīng)用相對定量PCR技術(shù)探明了性腺型芳香化酶基因在暗紋東方鲀雌魚和雄魚不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，這為深入探索性腺型芳香化酶基因在暗紋東方鲀性腺發(fā)育和性別分化過程中的生物學(xué)功能奠定了重要基礎(chǔ)，也為今后實(shí)現(xiàn)河鲀魚類良種人工繁育中的性別控制提供了重要參考。