孫紅娟，鄭智亮，王際輝，周遵春

( 1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點試驗室，遼寧 大連 116023； 2.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034 )

Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)作為先天性免疫系統(tǒng)中最古老的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)，由胞外區(qū)(ectodomain, ECD)、跨膜區(qū)(transmembrane, TM)和胞內(nèi)區(qū)(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)3部分組成[1]。在Toll樣受體信號通路中，接頭蛋白發(fā)揮著開啟并調(diào)控信號傳導(dǎo)的重要作用。髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88, MyD88)作為Toll樣受體信號通路中一個關(guān)鍵的接頭分子，通過死亡結(jié)構(gòu)域(death domain, DD)募集白細胞介素受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs)。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6)通過穿膜肽酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子同源區(qū)(meprin and TRAF homology, MATH)與上游白細胞介素受體相關(guān)激酶結(jié)合后被激活，隨后激活細胞核因子κB(nuclear factor κB, NFκB)抑制蛋白激酶(IκB kinase, IKK)復(fù)合物導(dǎo)致IκB的磷酸化和降解，最終誘導(dǎo)NFκB的轉(zhuǎn)位和炎癥因子的表達[2]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為世界上重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟物種，主要分布在中國、俄羅斯、日本以及朝鮮[3]。腐皮綜合征是仿刺參養(yǎng)殖過程中最為嚴(yán)重的流行性疾病，目前已經(jīng)鑒定到的致病原包括細菌、寄生蟲和病毒等，燦爛弧菌(Vibriosplendidus)為仿刺參腐皮綜合征的細菌性致病原，針對它刺激后仿刺參體內(nèi)免疫應(yīng)答機制的研究成為當(dāng)前的熱點[4-8]。仿刺參作為無脊椎動物，主要依賴先天性免疫系統(tǒng)來應(yīng)對病原菌的入侵。通過MyD88介導(dǎo)的Toll樣受體信號通路(MyD88依賴途徑)所識別配體主要是細菌的細胞膜成分。因此，筆者選擇燦爛弧菌進行免疫刺激試驗。目前已經(jīng)報道的仿刺參Toll樣受體信號通路相關(guān)基因有Toll、TLR3、MyD88、TRAF6、TRAF3、IRAK4、P105和Rel[9-14]。除了TLR3和TRAF3之外，其他6個基因均參與MyD88依賴途徑。

筆者通過生物信息學(xué)的方法探索TLR信號通路上6個基因的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域，找到其互作位點。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測體腔細胞中這6個基因在受到燦爛弧菌刺激后的表達調(diào)控模式，探索仿刺參TLR信號通路分子如何參與信號傳導(dǎo)，為闡釋仿刺參的免疫調(diào)控機制以及病害防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因結(jié)構(gòu)分析

仿刺參MyD88依賴途徑上6個基因的信息見表1。提取這6個基因的開放閱讀框，翻譯成氨基酸序列，找到保守結(jié)構(gòu)域，對基因間的互作位點進行分析[9-14]。

1.2 免疫刺激試驗

1.2.1 材料

試驗采用的體質(zhì)量(12.0±1.5) g健康仿刺參取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心。在實驗室暫養(yǎng)7 d，控制水溫(16±1) ℃，pH 8.6±0.1，鹽度31。免疫刺激試驗使用的燦爛弧菌為在2216E培養(yǎng)基中，于溫度28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)的。當(dāng)燦爛弧菌密度達到108cfu/mL時，進行免疫刺激試驗。

1.2.2 方法

將120頭健康的仿刺參平均分為對照組與菌刺激組。采用滅菌注射器對仿刺參進行體腔注射，對照組注射滅菌海水100 μL/頭，試驗組注射菌液100 μL/頭。注射4、12、24 h和48 h后分別用滅菌注射器取體腔液5 mL/頭，每組每個時間點隨機選取15個，并隨機分成3份，樣品混合后在4 ℃、3000 r/min的條件下離心10 min，收集沉淀的體腔細胞。

使用RNAprep pure Tissue (TIANGEN BIOTECH)試劑盒提取體腔細胞的總RNA，采用NanoPhotometer (Implen GmbH)測量其含量，隨后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。樣品合格后，使用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，加入5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL，反轉(zhuǎn)錄RNA的總量不超過900 ng，添加RNase Free dH2O至20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 5 min，85 ℃ 5 s。經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA樣品保存在-20 ℃，用于qRT-PCR試驗。

使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒對TLR信號通路的6個基因進行qRT-PCR，以Cytb作為內(nèi)參基因[15]，具體信息見表2。反應(yīng)體系：ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，cDNA 模板1 μL，TB Green Premix Ex Taq (TliRNaseH Plus) (2×Conc.)10 μL，正反引物各0.8 μL，dH2O 7 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；40個循環(huán)：95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 25 s。每個反應(yīng)重復(fù)3次。

表1 仿刺參TLR信號通路基因信息Tab.1 Information on TLR signaling pathway genes in sea cucumber A. japonicus

注：aa代表氨基酸. Notes：aa stands for amino acids.

表2 仿刺參TLR信號通路基因引物信息Tab.2 Primer information on TLR signaling pathway genes in sea cucumber A. japonicus

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)qRT-PCR所獲取的Ct值，使用軟件REST 384 v.2 (Relative Expression Software Tool，REST)進行分析，試驗組與對照組間發(fā)生的表達變化采用隨機配對檢驗分析法計算得到[16]。相對表達量選取平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。當(dāng)P<0.05時，表明具有顯著差異。采用Pearson相關(guān)系數(shù)R對不同基因間表達水平的相關(guān)性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Toll樣受體信號通路基因序列比對

Toll樣受體通過胞內(nèi)區(qū)與接頭分子MyD88連接，MyD88通過死亡結(jié)構(gòu)域募集IRAK4[12]，IRAK4的激酶區(qū)和TRAF6的穿膜肽酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子同源區(qū)相互作用來激活TRAF6，TRAF6序列中的指環(huán)區(qū)能使NFκB活化，Rel和P105之間的互作發(fā)生在Rel同源區(qū)。因此將Toll樣受體和MyD88的胞內(nèi)區(qū)，MyD88和IRAK4的死亡結(jié)構(gòu)域，IRAK4的激酶區(qū)和TRAF6的穿膜肽酶及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子同源區(qū)，TRAF6的指環(huán)區(qū)，P105和Rel的Rel同源區(qū)的氨基酸序列進行比對分析，結(jié)果見圖1。

Toll和MyD88的胞內(nèi)區(qū)序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)了白介素受體家族中3個高度保守的區(qū)域：box 1，F(xiàn)/YDA；box 2，RDXXPG；box 3，F(xiàn)W[17]。預(yù)測到MyD88死亡結(jié)構(gòu)域中和IRAK4結(jié)合位點是R49、L51、A54、D56、E62、T68、I71、Q72、E107、E109、D110、E113和D114。在IRAK4的激酶區(qū)同樣也存在1個保守結(jié)構(gòu)域RVSIATAAAKGINFLHEMK，預(yù)測到的ATP結(jié)合位點為I167、G170、G173、V175、A187、K189、I222、L236、I239、K285、I289、L290、D292、F302和G303。在TRAF6的穿膜肽酶和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子同源區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個高度保守的區(qū)域RVNINATDSIRGAYISLFVHFMK，預(yù)測到3個亞基結(jié)合位點F448、G509和G511。在TRAF6的指環(huán)結(jié)合區(qū)存在1個保守結(jié)構(gòu)域CX2C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-(N/C/H)-X2-C-X(4-48)C-X2-C。在P105和Rel的Rel同源區(qū)均存在保守的DNA結(jié)合位點，分別為R67、R69、Y70、C72、E73、P75、G78、H154、T156、R157、K239，R64、R66、Y67、C69、E70、R72、G75、C151、K153、K154、K223。

2.2 燦爛弧菌刺激后基因的表達變化

對照組經(jīng)過滅菌海水刺激后，Toll樣受體信號途徑基因在不同時間點表達差異不顯著。在燦爛弧菌刺激組，Toll基因除了在12 h表達小幅上調(diào)外，其他時間點表達都是顯著下調(diào)(圖2a)。MyD88在4 h和12 h時表達顯著上調(diào)，并在12 h達到最高點，在24 h表達下調(diào)，48 h又恢復(fù)表達上調(diào)狀態(tài)(圖2b)。IRAK4在4 h時表達顯著下調(diào)，12 h時表達均上調(diào)達到最高點，隨后表達逐漸恢復(fù)至初始狀態(tài)(圖2c)。TRAF6在4 h表達上調(diào)，12 h表達顯著上調(diào)并達到最高點，在24 h表達基本恢復(fù)至初始狀態(tài)(圖2d)。P105在12 h和48 h表達顯著上調(diào)，在其他時間點表達下調(diào)(圖2e)。Rel在4 h表達顯著下調(diào)，12 h表達上調(diào)但是不顯著，在48 h后表達趨于穩(wěn)定恢復(fù)到初始水平(圖2f)。

根據(jù)免疫刺激后基因的表達水平對發(fā)生互作基因之間的相關(guān)性進行分析，Toll和MyD88，MyD88和IRAK4，IRAK4和TRAF6，Rel和P105之間呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R均大于95%(表3)。

3 討 論

第一個Toll樣受體是在果蠅(Drosophilamelanogaster)中被發(fā)現(xiàn)的，隨后在脊椎動物和無脊椎動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了大量Toll樣受體[18-19]。越來越多的證據(jù)表明，從果蠅到人類存在著一條典型的Toll樣受體信號通路并且信號通路中的分子均高度保守[20]。隨著基因組層面分子技術(shù)的不斷發(fā)展，在海洋無脊椎動物紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)[21]、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[22]、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[23]、日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicas)[24]，長牡蠣(Crassostreagigas)[25]，櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[26-27]，夏威夷短尾烏賊(Euprymnascolopes)[28]體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了Toll樣受體信號通路相關(guān)基因，并且被證實參與了免疫應(yīng)答過程。筆者篩選了仿刺參Toll樣受體信號通路中MyD88依賴途徑上的6個基因，探索該通路上下游分子間如何進行信號傳遞和免疫應(yīng)答。

3.1 MyD88依賴途徑基因的保守結(jié)構(gòu)域

通過對Toll樣受體信號通路基因保守結(jié)構(gòu)域的比對分析，找到了基因間以及和其他分子間的互作位點。Toll樣受體通過胞內(nèi)區(qū)的保守結(jié)構(gòu)域與接頭分子互作來進行信號傳遞。MyD88作為Toll樣受體信號通路的關(guān)鍵接頭分子，可以介導(dǎo)凋亡反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄因子的激活。對Toll和MyD88的胞內(nèi)區(qū)進行比對，找到了3個高度保守的結(jié)構(gòu)域：box 1，F(xiàn)/YDA；box 2，RDXXPG；box 3，F(xiàn)W。MyD88通過死亡結(jié)構(gòu)域來募集IRAK4[29]，經(jīng)過比對找到了13個MyD88和IRAK4的結(jié)合位點。IRAK4是通過激酶區(qū)來激活TRAF6，在激酶區(qū)共預(yù)測到15個ATP結(jié)合位點，和其他物種激酶區(qū)的比對分析找到了ATP結(jié)合的保守區(qū)域(IGEGGFGTVFLGYFRDGTKCAVK)以及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活化區(qū)(YVHRDIKSANILL)[11]。其中ATP結(jié)合位點K189和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活化位點D285是高度保守存在，表明仿刺參IRAK4是一個活性激酶[30]。通過Rel和P105的Rel同源區(qū)的氨基酸序列進行比對分析，均找到了11個保守的DNA結(jié)合位點。免疫共沉淀試驗證明，在Rel和P105之間確實存在著相互作用，并且作用區(qū)域位于Rel同源區(qū)內(nèi)[12]。

圖1 Toll樣受體信號通路基因序列比較Fig.1 Sequences comparison of genes in TLR signaling pathway

圖2 燦爛弧菌刺激后仿刺參體腔細胞中Toll樣受體信號通路基因的表達變化Fig.2 Changes in expression of TLR signaling pathway genes in sea cucumber A. japonicus of subjected to V. splendidus infection *.差異顯著(P<0.05). *.significant difference (P<0.05).

表3仿刺參Toll樣受體信號通路基因表達相關(guān)性分析

Tab.3 Correlation analysis of TLR signaling pathway genes in sea cucumber A. japonicus

3.2 MyD88依賴途徑基因的免疫應(yīng)答

為了進一步探索仿刺參Toll樣受體信號通路基因如何進行信號傳導(dǎo)，筆者對免疫刺激后基因的表達水平進行了分析。Toll樣受體在受到燦爛弧菌刺激后表達變化水平要低于信號通路中其他5個基因。在櫛孔扇貝Toll樣受體信號通路5個基因受到脂多糖刺激后，TLR的表達變化水平也顯著低于信號通路另外4個基因[27]。前期的研究證實，仿刺參和玉足海參(Holothurialeucospilota)中的MyD88都可以介導(dǎo)Toll樣受體信號通路并且激活轉(zhuǎn)錄因子NFκB[11,31]。仿刺參體腔細胞MyD88受到燦爛弧菌刺激后，在6 h表達上調(diào)了約2倍，在48 h開始就恢復(fù)到了初始狀態(tài)[10]。本研究中，仿刺參受到燦爛弧菌刺激4 h，MyD88表達上調(diào)了2倍，在12 h達到最高點，在48 h表達水平仍處于上調(diào)狀態(tài)。這可能與燦爛弧菌刺激方式有關(guān)，Lu等[10]將燦爛弧菌注入養(yǎng)殖水體中對仿刺參進行免疫刺激，而本研究采用體腔注射方式對仿刺參進行免疫刺激，免疫應(yīng)答持續(xù)時間相對較長。

IRAKs在MyD88和TRAF6分子之間起連接作用，操控Toll樣受體信號通路下游信號的傳遞。IRAK4不同于IRAK家族中其他成員，它具有激酶活性可以使下游的分子發(fā)生磷酸化促進信號的傳遞，最終激活轉(zhuǎn)錄因子NFκB[32]。Cui等[11]研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參體腔細胞IRAK4受到燦爛弧菌和脂多糖刺激后，表達發(fā)生了顯著上調(diào)。本研究IRAK4在燦爛弧菌刺激12 h表達上調(diào)，在48 h恢復(fù)到初始狀態(tài)。這兩個研究均表明，IRAK4參與了體腔細胞Toll樣受體信號通路的免疫應(yīng)答。TRAF6可以作為橋梁來連接上游的TLRs、MyD88、IRAK4和下游的NFκB信號途徑。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)仿刺參受到燦爛弧菌刺激后，體腔細胞TRAF6的表達上調(diào)幅度要比MyD88大，并且持續(xù)時間長[10]。在本研究中，TRAF6和MyD88表達模式基本一致，在12 h表達達到最高點，隨后表達水平降低。NFκB是先天性免疫系統(tǒng)中高度保守的分子，在生長發(fā)育、凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。NFκB家族是由多個亞基組成，不同亞基之間可以形成二聚體，促進DNA的結(jié)合[33]。仿刺參體內(nèi)鑒定到的P105和Rel是NFκB的兩個同源物，具有相似的Rel同源結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化發(fā)現(xiàn)這兩個基因也是聚類在同一個分支中[12]。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，這兩個基因在免疫刺激后，表達模式相似，共同參與了轉(zhuǎn)錄因子的免疫應(yīng)答。

通過對Toll樣受體信號通路Toll、MyD88、IRAK4、TRAF6、P105和Rel互作位點和保守結(jié)構(gòu)域的比對分析，證明在仿刺參體內(nèi)存在一條保守的Toll樣受體信號通路。進行免疫刺激后，該通路的基因之間協(xié)同合作參與機體免疫應(yīng)答。研究結(jié)果為揭示仿刺參體腔細胞的免疫應(yīng)答機制提供參考，同時為病害的防治提供了理論依據(jù)。