熊含露，張露，李金林，李小鋒，梅強(qiáng)根，馬天新，涂宗財(cái),2*

1(國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心和江西省淡水魚(yú)高值化利用工程技術(shù)研究中心(江西師范大學(xué))，江西 南昌，330022)2(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)

鮰魚(yú)(Leiocassislongirostris)俗稱(chēng)肥王魚(yú)、淮王魚(yú)等，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，2020年的產(chǎn)量為30.85萬(wàn)t[1]。鮰魚(yú)肉嫩且味美，富含蛋白質(zhì)和脂肪，被譽(yù)為淡水魚(yú)中的食用上品。鮰魚(yú)最美味之處在于軟邊的腹部，常被加工成凍魚(yú)片，但會(huì)產(chǎn)生約40%～55%的副產(chǎn)物，如魚(yú)骨、魚(yú)皮、魚(yú)鱗等[2]。其中，鮰魚(yú)骨含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分，鈣磷比接近2∶1，易被人體吸收，是一種優(yōu)良的補(bǔ)鈣食物資源[3]。但鮰魚(yú)骨質(zhì)構(gòu)堅(jiān)硬，不便利用，目前主要被加工成動(dòng)物飼料，造成資源浪費(fèi)。

鈣是人體中必需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)維持人體正常的新陳代謝和酸堿平衡起著重要的作用。約99%的鈣以羥基磷灰石的形式存在于骨骼、牙齒中。缺鈣則易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、佝僂病等疾病，且多發(fā)生在中老年和兒童群體中[4]。根據(jù)《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量(2013版)》顯示，中國(guó)成年居民每日的鈣推薦攝入量在800～1 000 mg，而人們實(shí)際每日攝入鈣量低于400 mg[5]，因此，補(bǔ)鈣至關(guān)重要。目前，市場(chǎng)上常見(jiàn)的補(bǔ)鈣制劑有無(wú)機(jī)鈣、有機(jī)酸鈣、有機(jī)鈣等，但部分產(chǎn)品存在吸收率低、補(bǔ)鈣效果差等問(wèn)題，無(wú)法滿(mǎn)足當(dāng)代群體對(duì)補(bǔ)鈣的需求[6-7]。研究表明，肽-鈣螯合物具有溶解性好、易吸收、生物利用率高且無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為人們一種理想選擇的補(bǔ)鈣劑[8]。如ZHANG等[9]研究證明，肽-鈣螯合物可提高腸道的鈣生物利用率，從而改善大鼠的骨質(zhì)疏松問(wèn)題。因此，基于低值鮰魚(yú)骨制備蛋白水解物，開(kāi)發(fā)新型鈣制劑，不僅可以豐富鈣制劑的種類(lèi)，還能提高魚(yú)骨資源利用率，降低環(huán)境污染，促進(jìn)漁業(yè)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益。

本文以鮰魚(yú)骨為原料，以鈣結(jié)合能力為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化制備膠原多肽的酶解工藝，采用Sephadex G-25進(jìn)行分離純化，篩選出與鈣結(jié)合活性較好的膠原多肽組分。制備膠原多肽-鈣螯合物，通過(guò)傅里葉紅外光譜、掃描電鏡、能譜分析技術(shù)探究鮰魚(yú)骨膠原多肽螯合前后的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，最后對(duì)膠原多肽-鈣螯合物的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、體外模擬消化穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其生物利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冷凍鮰魚(yú)脊骨，由安徽富煌三珍公司提供。

S1063S鈣含量顯色檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶(200 000 U/g)、胃蛋白酶(250 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)，北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞色素C(12 384 Da)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；抑肽酶(6 511.51 Da)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)、羥脯氨酸(131.13 Da)，上海源葉生物科技有限公司；CaCl2，西隴科學(xué)股份有限公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、乙腈(acetonitrile，ACN)，賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

S—3400 N掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；Spectrum One傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司；EASY-nLC 1000型超高效液相，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio Tek公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；5430R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；FiveEasy Plus臺(tái)式pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SR-AON-50型冷凍干燥機(jī)，上海舍巖儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮰魚(yú)骨的預(yù)處理

將冷凍鮰魚(yú)骨沸水蒸煮5 min，去除魚(yú)骨表面殘留的魚(yú)肉和膜性組織。按照1∶6(g∶mL)的料液比向魚(yú)骨中加入0.3 mol/L NaOH溶液脫脂，1 h后換液搖勻，靜置浸泡1 h后用蒸餾水反復(fù)沖洗魚(yú)骨至中性，瀝干水分，于60 ℃烘箱中烘干，粉碎備用。

1.2.2 鮰魚(yú)骨的酶解提取工藝

堿性蛋白酶由多種不同的蛋白酶組成，對(duì)膠原蛋白的水解程度較高，一定程度上有助于產(chǎn)生更多的生物活性肽和活性位點(diǎn)[10]，因此本文采用堿性蛋白酶水解鮰魚(yú)骨粉制備鮰魚(yú)骨膠原多肽。以鈣結(jié)合能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)固定其他因素，依次研究料液比(1∶20、1∶13、1∶10、1∶8、1∶6，g∶mL)、酶添加量(1%、2%、3%、4%、5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、pH(8.0、8.5、9、9.5、10)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5 h)、酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)水解物鈣結(jié)合能力的影響。

1.2.3 鮰魚(yú)骨膠多肽的分子質(zhì)量分布

采用高效體積排阻色譜法測(cè)定最優(yōu)條件下酶解的鮰魚(yú)骨膠原多肽的分子質(zhì)量分布[11-12]。2 mg/mL的鮰魚(yú)骨膠原多肽溶液過(guò)0.22 μm水系濾膜后進(jìn)行上樣分析。測(cè)定條件：色譜柱，Waters XBridge Protein BEH 125? SEC(3.5 μm，7.8 mm×300 mm)；流動(dòng)相：V(ACN)∶V(0.1%TFA溶液)=40∶60；紫外檢測(cè)220 nm；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。以細(xì)胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 511.51 Da)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)和羥脯氨酸(131.13 Da)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)，利用校正曲線(xiàn)方程計(jì)算酶解液的分子質(zhì)量分布情況。

1.2.4 Sephadex G-25分離純化

參照李軍等[13]的方法略作修改。將溶脹好的Sephadex G-25填料裝入玻璃層析柱(1.6 cm×80 cm)中，超純水平衡2～3個(gè)柱體積，膠原多肽溶液過(guò)0.22 μm水系濾膜后上樣分析。洗脫條件：洗脫液為超純水，流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，每5 min收集1管。多次制備后合并相同組分，凍干。

1.2.5 膠原多肽鈣結(jié)合能力分析

稱(chēng)取0.5 g鮰魚(yú)骨膠原多肽及其最優(yōu)組分和0.25 g CaCl2溶于20 mL蒸餾水中，40 ℃水浴1 h。冷卻至室溫后用8倍體積的無(wú)水乙醇沉淀4 h，離心取沉淀凍干得到肽-鈣螯合物。最后采用鈣含量顯色檢測(cè)試劑盒測(cè)定鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣含量，鈣含量可直接反應(yīng)膠原多肽的鈣結(jié)合能力[14]。

1.2.6 鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.2.6.1 傅里葉紅外光譜測(cè)定

將1.2.5小節(jié)中確定的鈣螯合能力最強(qiáng)肽組分及其鈣螯合物與干燥的KBr于瑪瑙研缽中混合，充分研磨后壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀在500～4 000 cm-1掃描[15]。

1.2.6.2 掃描電鏡及能譜分析

參照張玲[16]的方法將1.2.5小節(jié)中確定的鈣螯合能力最強(qiáng)肽組分及其鈣螯合物分別固定在導(dǎo)電膠帶上，噴金鍍膜，放入掃描電鏡施加電壓獲取微觀(guān)結(jié)構(gòu)圖像，并對(duì)其進(jìn)行能譜分析。

1.2.7 鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1.2.7.1 熱穩(wěn)定性分析

配制5 mg/mL的鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物溶液，分別放置于25(控制組)、50、60、70、80 ℃條件下恒溫水浴1 h，冷卻至室溫后用無(wú)水乙醇沉淀，離心凍干，測(cè)定其鈣結(jié)合能力。以控制組的鈣保留率為100%，計(jì)算不同溫度下鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率。

1.2.7.2 酸堿穩(wěn)定性分析

配制5 mg/mL的鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物溶液，以原液為控制組，其余組分別調(diào)pH為2、4、6、8、9，37 ℃水浴2 h，冷卻至室溫后用無(wú)水乙醇沉淀，離心凍干，評(píng)價(jià)樣品的鈣結(jié)合能力。以控制組的鈣保留率為100%，計(jì)算不同pH條件下鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率。

1.2.7.3 體外模擬消化穩(wěn)定性

用0.01 mol/L HCl溶液(pH 2.0)配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物，按照1∶50的酶底物質(zhì)量比添加胃蛋白酶模擬胃消化環(huán)境，37 ℃水浴酶解1 h后，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，再按照1∶25的酶底物質(zhì)量比加入胰蛋白酶模擬腸消化環(huán)境，37 ℃水浴酶解2 h后，沸水浴加熱滅酶10 min終止酶解。最后冷卻至室溫，并用無(wú)水乙醇沉淀，離心凍干，測(cè)定其鈣結(jié)合能力。以未消化的鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物(控制組)的鈣保留率為100%，計(jì)算模擬消化過(guò)程中鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 8.6軟件作圖，用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)間的顯著性差異，P<0.05認(rèn)定具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮰魚(yú)骨膠原蛋白多肽酶解單因素試驗(yàn)

堿性蛋白酶酶解鮰魚(yú)骨制備膠原多肽的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1-a中可知，鈣結(jié)合能力隨料液比的增加整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)榈孜餄舛葧?huì)影響酶解液的分子擴(kuò)散性，其底物濃度太低，酶與底物不易接近，在料液比為1∶13(g∶mL)時(shí)，鈣結(jié)合能力最高，達(dá)到22.95 mmol/L(P<0.05)。由圖1-b可知，堿性蛋白酶的添加量在1%～4%，鈣結(jié)合能力基本呈上升的趨勢(shì)，最大值達(dá)到28.47 mmol/L(P<0.05)。繼續(xù)增加酶添加量時(shí)，鈣結(jié)合能力反而下降。這是因?yàn)閴A性蛋白酶的酶添加量增加，其水解能力增強(qiáng)，當(dāng)繼續(xù)增加酶量，此時(shí)的鈣結(jié)合能力幾乎沒(méi)有發(fā)生改變，說(shuō)明酶與底物達(dá)到飽和，因此確定最佳酶添加量為4%。由圖1-c可知，鈣結(jié)合能力隨著pH的增加整體上呈下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH為8.0時(shí)，鈣結(jié)合能力最高達(dá)到27.68 mmol/L(P<0.05)，這是因?yàn)楫?dāng)pH較低時(shí)，H+與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)供電基團(tuán)，并促進(jìn)肽-鈣螯合物中Ca2+的解離，而pH過(guò)高時(shí)，溶液中的OH-會(huì)與Ca2+形成Ca(OH)2沉淀物，導(dǎo)致肽鈣結(jié)合能力下降[17-18]。同時(shí)，當(dāng)酶解pH值為8.0時(shí)，正好為堿性蛋白酶的最適pH，此時(shí)的酶解活性最高[13]。

a-料液比；b-酶添加量；c-pH值；d-酶解時(shí)間；e-酶解溫度圖1 酶解條件對(duì)鈣結(jié)合能力的影響Fig.1 Effects of enzymatic hydrolysis conditions on calcium binding capacity

由圖1-d可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣結(jié)合能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí)，鈣結(jié)合活性達(dá)到最大值27.56 mmol/L(P<0.05)。這是因?yàn)楫?dāng)酶解反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，堿性蛋白酶與魚(yú)骨底物激烈反應(yīng)，膠原多肽含量增加，其鈣結(jié)合能力也隨之增加，但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原多肽也會(huì)被過(guò)度水解成氨基酸，使與鈣結(jié)合的膠原多肽含量降低。由圖1-e可知，鈣結(jié)合能力隨著酶解溫度增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在酶解溫度為40 ℃時(shí)，其鈣結(jié)合能力達(dá)到最大值27.48 mmol/L(P<0.05)。其原因在于隨著溫度的逐漸增加，堿性蛋白酶活性增強(qiáng)，但過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致堿性蛋白酶酶活力下降甚至失活，影響膠原多肽與鈣的結(jié)合能力。綜上所述，由單因素試驗(yàn)可確定堿性蛋白酶制備鮰魚(yú)膠原多肽的最佳酶解工藝：料液比1∶13(g∶mL)，酶添加量4%，pH 8.0，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度40 ℃，此時(shí)制備的鮰魚(yú)膠原多肽與鈣結(jié)合能力為29.37 mmol/L。

2.2 鮰魚(yú)骨膠原蛋白肽的分子質(zhì)量分布分析

鮰魚(yú)骨膠原多肽分子質(zhì)量分布情況如圖2-a所示，混合標(biāo)準(zhǔn)品分離效果良好。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與保留時(shí)間的關(guān)系，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgMw)對(duì)保留時(shí)間(t)作線(xiàn)性回歸得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)，如圖2-b所示，其相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)方程：lg(Mw)=-0.188 1t+6.642 1，R2=0.996 6，表明相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)與保留時(shí)間(t)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，可根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)方程和鮰魚(yú)骨膠原多肽的出峰時(shí)間，計(jì)算出鮰魚(yú)骨膠原多肽粉末各組分的分子質(zhì)量分布情況。

a-標(biāo)準(zhǔn)品的體積排阻色譜圖；b-相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)；c-鮰魚(yú)骨膠原多肽分子質(zhì)量范圍圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的體積排阻色譜圖、相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)和鮰魚(yú)骨膠原多肽分子質(zhì)量分布Fig.2 Size exclusion chromatogram, relative molecular mass calibration curve and molecular mass distribution of catfish bone collagen polypeptide注：相對(duì)含量的數(shù)據(jù)來(lái)源于高效液相色譜分析結(jié)果

鮰魚(yú)骨膠原多肽的高效體積排阻色譜圖如圖2-c所示，圖中主要出現(xiàn)4個(gè)峰，表明鮰魚(yú)骨膠原多肽由4種不同分子質(zhì)量膠原多肽所組成。通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線(xiàn)方程和鮰魚(yú)骨膠原多肽的出峰時(shí)間計(jì)算，分子質(zhì)量分布如2-c所示，鮰魚(yú)骨膠原多肽的分布范圍廣，大小不一，且分子質(zhì)量范圍為195～1 967 Da的膠原多肽相對(duì)含量最高，約占鮰魚(yú)骨膠原多肽整體的77.73%。因此，采用Sephadex G-25分子層析將其進(jìn)行分離純化，并分析各個(gè)組分對(duì)鈣結(jié)合活性的影響。

2.3 鮰魚(yú)骨膠原多肽Sephadex G-25分離純化分析

凝膠過(guò)濾層析可根據(jù)樣品的分子質(zhì)量大小對(duì)樣品進(jìn)行分離，分子質(zhì)量大的樣品不能進(jìn)入凝膠顆粒，先被洗脫下來(lái)，分子質(zhì)量小的樣品后被洗脫出來(lái)[19]。鮰魚(yú)骨膠原多肽經(jīng)Sephadex G-25分離純化的圖譜如圖3-a所示，鮰魚(yú)骨膠原多肽按照分子質(zhì)量大小被分離成3個(gè)不同組分，依次命名為F1、F2、F3。3個(gè)組分的鈣結(jié)合能力如圖3-b所示，F(xiàn)1、F2、F3組分與鈣的結(jié)合能力分別為1.78、5.43、6.69 mmol/L，其中F3組分顯示出最高的鈣結(jié)合能力，這與低分子質(zhì)量的多肽更容易與金屬離子結(jié)合相符合[20]。

a-Sephadex G-25凝膠過(guò)濾層析色譜圖；b-肽-鈣結(jié)合能力圖3 鮰魚(yú)骨膠原多肽的Sephadex G-25凝膠過(guò)濾層析色譜圖和各個(gè)組分的鈣結(jié)合能力Fig.3 Sephadex G-25 gel filtration chromatography of catfish bone collagen polypeptide-calcium chelate and calcium binding capacity of different components注：不同小寫(xiě)字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.4 鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物結(jié)構(gòu)表征分析

2.4.1 傅里葉紅外光譜

圖4 F3和肽-鈣螯合物的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of F3 and peptide-calcium chelate

2.4.2 掃描電鏡及能譜分析

F3組分及其肽-鈣螯合物的掃描電鏡如圖5-a和圖5-b所示，F(xiàn)3組分表面呈現(xiàn)光滑的平面，其表面還存在由于快速冷凍干燥而形成的裂紋。與Ca2+螯合后，其表面變?yōu)榇植?、疏松、多孔的形狀，且多個(gè)球狀連接一起，這是由于膠原多肽和Ca2+發(fā)生配位結(jié)合，Ca2+的嵌入和膠原多肽對(duì)Ca2+的截留共同作用的結(jié)果。為了更詳細(xì)了解F3組分及其肽-鈣螯合物中內(nèi)部元素分布情況，采用能譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5-c和圖5-d所示。F3組分及其肽-鈣螯合物都能檢測(cè)到鈣元素，同時(shí)還共同含有N、C、O、Na、Cl等元素。但肽-鈣螯合物中鈣元素的信號(hào)強(qiáng)度要明顯強(qiáng)于F3組分，說(shuō)明肽-鈣螯合物中的鈣含量要明顯高于F3組分。通過(guò)掃描電鏡和能圖分析可知，F(xiàn)3組分與Ca2+發(fā)生了螯合作用，形成了新的物質(zhì)。

a-F3掃描電鏡圖；b-肽-鈣螯合物掃描電鏡圖；c-F3能譜圖；d-肽-鈣螯合物能譜圖圖5 F3及肽-鈣螯合物的掃描電鏡及能譜分析Fig.5 Scanning electron microscopy and energy spectrum analysis of F3 and its peptide-calcium chelate

2.5 鮰魚(yú)骨膠原多肽鈣螯合物穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.5.1 熱穩(wěn)定性

熱處理是食品加工的常用手段，因此本研究以鈣保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了不同熱處理溫度對(duì)鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物穩(wěn)定性的影響。如圖6-a所示，隨著熱處理溫度的升高(50～80 ℃)，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率先保持穩(wěn)定，后緩慢降低，但鈣保留率仍在95.91%以上，且無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物具有一定的熱穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)镃a2+與鮰魚(yú)骨膠原多肽通過(guò)配位鍵相互作用將形成有序、緊密的結(jié)構(gòu)，使其空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[23]。

a-溫度與鈣保留率關(guān)系；b-pH與鈣保留率關(guān)系；c-消化穩(wěn)定性圖6 鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物溫度、pH和消化穩(wěn)定性關(guān)系分析Fig.6 Calcium retention rate of catfish bone collagen polypeptide-calcium chelate at different temperatures, different acid-base environment, different digestion methods

2.5.2 酸堿穩(wěn)定性

鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的酸堿穩(wěn)定性如圖6-b所示，隨著pH值(2.0～9.0)的增加，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，但鈣保留率均在77.52%以上。與控制組相比，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物在強(qiáng)酸性環(huán)境下的鈣保留率下降較快，這是由于高H+濃度可與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)活性基團(tuán)，導(dǎo)致鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣結(jié)合能力下降[18]。而在堿性環(huán)境下，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率略有下降，這是因?yàn)閴A性環(huán)境下的OH-與Ca2+結(jié)合發(fā)生少量的沉淀所致，但有研究表明金屬肽鈣復(fù)合物一旦形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其解離需要克服較大的活化能[24]，所以在弱堿性條件下(pH 8.0)的鈣保留率下降趨勢(shì)不明顯。

2.5.3 體外消化穩(wěn)定性

膳食營(yíng)養(yǎng)素的吸收利用需要經(jīng)過(guò)胃腸道的消化吸收，其吸收利用率會(huì)受到pH及各種消化酶的影響。因此，需要評(píng)價(jià)鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物在胃腸道模擬消化過(guò)程中的穩(wěn)定性，其結(jié)果如圖6-c所示。經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化后，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率下降到82.25%，這是因?yàn)槟M胃消化環(huán)境的pH為2.0，其高濃度的H+與Ca2+發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，與圖6-b的強(qiáng)酸環(huán)境下導(dǎo)致鈣保留率下降的結(jié)果相一致。加入胰蛋白酶再次消化后，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物的鈣保留率再次下降，其值為73.84%，這可能是胃消化階段的強(qiáng)酸環(huán)境和胰蛋白酶可能對(duì)鮰魚(yú)骨膠原多肽存在一定的降解作用，導(dǎo)致其鈣螯合能力降低[25]。但總體來(lái)說(shuō)，其鈣保留率均在70%以上，表明鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶消化和胃腸道pH環(huán)境不敏感，能較好地保持結(jié)構(gòu)不被破壞，促進(jìn)人體對(duì)鈣的吸收。

3 結(jié)論

本文以鮰魚(yú)骨為原料，經(jīng)堿性蛋白酶水解后與CaCl2螯合制備鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物。采用鈣結(jié)合能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)得到鮰魚(yú)骨膠原多肽的最佳酶解工藝為：料液比1∶13(g∶mL)，酶添加量4%，pH 8.0，酶解時(shí)間2 h，酶解溫度40 ℃，此時(shí)制備的鮰魚(yú)骨膠原多肽與鈣結(jié)合能力達(dá)到29.37 mmol/L。HPLC分析發(fā)現(xiàn)，鮰魚(yú)骨膠原多肽的分子質(zhì)量主要集中在195～1 967 Da，其相對(duì)含量約占鮰魚(yú)骨膠原多肽整體的77.73%。利用Sephadex G-25分離純化得到3個(gè)組分，其中F3組分的鈣結(jié)合活性最佳。紅外光譜、掃描電鏡和能譜結(jié)果顯示，鮰魚(yú)骨膠原多肽的氨基、羧基和酰胺鍵是Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)，與Ca2+螯合之后，其光滑的平面變?yōu)榇植?、疏松、多孔的形狀，鈣含量明顯增加，都表明有新物質(zhì)的產(chǎn)生。熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性分析表明，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物具有一定的耐熱性、耐弱堿性，但在強(qiáng)酸環(huán)境下不穩(wěn)定。消化穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，鮰魚(yú)骨膠原多肽-鈣螯合物可在胃腸道的環(huán)境中保持穩(wěn)定，其鈣保留率在70%以上，具有促進(jìn)人體鈣吸收的潛力。