張 蓉,陳 躍,鄭 培,代 瑩,李莎莎,賈穎異,謝 然,王金花*(.中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心,北京 0006;.山東警察學(xué)院,山東 濟南 5000)

中藥材是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的重要組成部分,也是中華民族傳統(tǒng)文化的瑰寶,隨著世界天然藥物的研發(fā)熱潮和中藥在此次新冠疫情中的廣泛應(yīng)用,東南亞及歐美市場對中藥的關(guān)注日益增強。目前,常用中藥材多采用農(nóng)業(yè)種植的方式獲得,為防治作物病除害,不可避免在中藥材的生產(chǎn)過程中使用農(nóng)藥,因此容易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題[1]?！吨袊幍洹穼r(nóng)殘檢測方法的多次更新和修訂正是為了不斷增強中藥材中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管水平,促進中藥材的質(zhì)量提升和保障消費者的使用安全。2020年版《中國藥典》一部規(guī)定了人參、甘草、西洋參等常用中藥材中有機氯類農(nóng)藥殘留檢測方法及限量標準,其中五氯硝基苯(PCNB)、六氯苯、氯丹(順式氯丹、反式氯丹和氧化氯丹之和)、六六六(BHC)不得超過0.1 mg/kg,七氯(七氯、環(huán)氧七氯之和)不得超過0.05 mg/kg,滴滴涕(DDT)不得超過1 mg/kg[2];四部“2341農(nóng)藥殘留量測定法”中給出了農(nóng)藥殘留的檢測標準和檢出限,“0212藥材和飲片檢定通則”中規(guī)定了33種禁用農(nóng)藥,并且要求該類農(nóng)藥在中藥材及飲片(植物類)中不得檢出[3]。2017版《日本藥局方》中規(guī)定了六六六和滴滴涕在20種藥材中農(nóng)藥殘留限量為0.2 mg/kg;《美國藥典》規(guī)定了76種農(nóng)藥殘留限量,《歐洲藥典》在農(nóng)藥殘留限量上與美國藥典保持一致[4];而韓國在第10版《韓國藥典》(KP 10)中規(guī)定了生藥及其萃取物中農(nóng)藥殘留的限量,要求所有標準范圍內(nèi)的生藥及其萃取物都需滿足農(nóng)藥殘留的限量要求,其中六六六限量為0.2 mg/kg,滴滴涕限量為0.1 mg/kg,狄氏劑、異狄氏劑、艾氏劑限量均為0.01 mg/kg[5]。

目前,中藥材中農(nóng)藥殘留檢測多關(guān)注六六六、滴滴涕以及五氯硝基苯等有機氯農(nóng)藥和對硫磷、甲基對硫磷、甲胺磷、久效磷等有機磷農(nóng)藥[6],崔麗麗等[7]利用QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對人參中的六六六、滴滴涕和六氯苯等有機氯農(nóng)藥進行了檢測,發(fā)現(xiàn)人參樣品中α-BHC、δ-BHC、六氯苯和p,p′-滴滴伊均有檢出,分別為0.011、0.014、0.007和0.018 mg/kg,張雪輝等[8]對23種中藥材中六六六、滴滴涕和五氯硝基苯殘留量進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分樣品都有不同程度的檢出,但農(nóng)藥殘留量多在中國藥典的限量范圍之內(nèi)。王芳煥等[9]用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對枸杞中20種農(nóng)藥殘留進行了分析,在選取的20個樣品中氯氟氰菊酯、噠螨靈、苯醚甲環(huán)唑和氯氰菊酯的檢出率分別為30%、25%、35%、30%,其中氯氟氰菊酯的檢測值最高為1.759 mg/kg,呂盼等[10]以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了陳皮原料藥材中179種農(nóng)藥,在選取的11批次樣品中檢出毒死蜱、戊唑醇、炔螨特、三氯殺螨醇、丙溴磷等農(nóng)藥,甚至個別樣品檢出的戊唑醇殘留高達47.025 mg/kg。從檢測方法上看,文獻中對中藥中農(nóng)殘的檢測多采用色譜法并配以不同檢測器[11-13],這些選擇性檢測器雖然靈敏度較高,但不能提供農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)信息,定性能力較弱,而采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以同時對各種類型的農(nóng)藥進行定性定量分析,以提高分析的準確性,常用的有氣/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣/液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法等[14-22],2020版《中國藥典》(四部)[3]“2341農(nóng)藥殘留量測定法”中也新增了“第四法 農(nóng)藥多殘留測定法(質(zhì)譜法)”,提供了QuEChERS結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對中藥中88種農(nóng)藥殘留定量檢測的方法,其凈化過程采用分散固相萃取劑(無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺(PSA)300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化炭黑90 mg)凈化樣品提取液。鮮見使用離子阱質(zhì)譜法的相關(guān)報道。因此,本文建立了一種利用氣相色譜-離子阱質(zhì)譜技術(shù)檢測中藥材中101種常見農(nóng)藥殘留的檢測方法,在采用凝膠滲透色譜(GPC)凈化的條件下,通過優(yōu)化離子阱質(zhì)譜參數(shù),達到進一步排除復(fù)雜基質(zhì)干擾、提高目標化合物信號的效果,其對復(fù)雜中藥基質(zhì)的凈化效果和凈化容量優(yōu)于QuEChERS法,同時可采用凝膠滲透色譜設(shè)備實現(xiàn)高通量自動化前處理,為中藥材的農(nóng)藥殘留檢測提供有益的方法補充。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(AS 3000,TraceGC Ultra,PolarisQ MS,美國Thermo公司);凝膠滲透色譜儀(美國J2 Scientific公司);KQ-250型超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);EYELA-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社);DSY-II自動快速濃縮儀(北京金科精華苑科技研究所);丙酮、甲苯、乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷均為色譜級(美國J.T.Baker公司);101種農(nóng)藥標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司);FW400A型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)。

標準溶液的配制:將各標準品分別以甲苯配制成1 000 mg/L的標準儲備液。根據(jù)氣相色譜保留時間將101種農(nóng)藥分為兩組(見表1),并分別按靈敏度高低用甲苯將單標儲備液配制成兩組混合標準儲備液,實驗時用甲苯將上述混合標準儲備液稀釋,配制成系列混合標準工作溶液。上述標準儲備液置于-20 ℃冰箱避光保存。

柴胡、桔梗(北京同仁堂中藥進出口有限公司)經(jīng)粉碎機粉碎成60～200目粉末,低溫、干燥保存。當歸提取物(河南中冠健業(yè)生物科技有限公司)。

1.2 實驗條件

1.2.1色譜條件

DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);流速:1 mL/min;進樣量:1 μL;進樣方式:不分流進樣;進樣口溫度:250 ℃;柱起始溫度40 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升到160 ℃,以2 ℃/min升到230 ℃,以20 ℃/min升到300 ℃,保持5 min。

1.2.2質(zhì)譜條件

電離方式:電子轟擊源(EI);電離能量:70 eV,離子源溫度250 ℃,傳輸線溫度:280 ℃,最大激發(fā)能量(maximum excitation energy,q):0.3。采用二級離子監(jiān)測模式:每種化合物選擇一個母離子,然后選擇1～3個子離子,每種化合物的母離子、子離子、掃描時間、碰撞能量等見表1。

表1 101種農(nóng)藥殘留的保留時間、質(zhì)譜參數(shù)和在混合標準儲備液中的濃度Table 1 Retention times,MS parameters and concentrations in mixed standard stock solution for the 101 pesticides

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

1.3 提取與凈化

稱取5.0 g粉碎好的試樣,加入20 mL乙腈超聲30 min,6 000 r/min離心5 min后轉(zhuǎn)移提取液到雞心瓶中,試樣殘渣用20 mL乙腈按上述步驟再提取一次,合并兩次提取液并在40 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干,用2 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,v/v)洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾轉(zhuǎn)移至GPC進樣瓶。

GPC條件為:柱長40 cm,內(nèi)徑20 mm,填料粒度200～400目,流動相乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1,v/v),進樣量2 mL,流速4 mL/min,收集時間17～30 min。收集后,在40 ℃以下濃縮至近干。用1 mL甲苯定容,待檢測。

圖1 升溫速率為(a)5 ℃/min和(b)2 ℃/min時色譜分離效果對比Fig.1 Comparison of chromatographic separation effects at heating rates of (a) 5 ℃/min and (b) 2 ℃/min

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

為提高檢測靈敏度,讓化合物盡量實現(xiàn)最大分離,嘗試了不同的程序升溫條件。本實驗測定的101種農(nóng)藥的出峰溫度主要集中在160～230 ℃,比較了該溫度范圍內(nèi)升溫速率為5 ℃/min(見圖1a)和2 ℃/min(見圖1b)時化合物的分離效果,可以看出后者能實現(xiàn)更好的分離效果以減少化合物的共流出對質(zhì)譜檢測靈敏度的負面影響,因此采用160～230 ℃間升溫速率為2 ℃/min作為程序升溫的中段條件。

離子阱質(zhì)譜是時間串聯(lián)型質(zhì)譜,離子被抓取和裂解時都在同一個阱中完成,實驗發(fā)現(xiàn)當同一保留時間有多個化合物時儀器檢測靈敏度會略低,因此,根據(jù)101種農(nóng)藥的出峰時間和分離度,將其分為Ⅰ組和Ⅱ組進行分析,能獲得更好的靈敏度,空白桔?；|(zhì)添加混合標準溶液的二級總離子流圖見圖2。

圖2 空白加標桔梗溶液的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of blank spiked Platycodonis radix solution

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

二級質(zhì)譜的定性定量通常是每種化合物選擇一個母離子,采用合適的碰撞電壓對其進行二級電離,然后在碎片離子中選擇1～3個碎片離子對目標化合物定性定量,這符合歐盟指令2002/657/EC規(guī)定的在應(yīng)用質(zhì)譜儀對目標化合物進行確證時的評價準則。在本方法中,中藥樣品基質(zhì)非常復(fù)雜,具有很強的基質(zhì)干擾,因此選擇滿足條件且基質(zhì)干擾較小的母離子、選擇合適的碰撞電壓及最大激發(fā)能量就成為優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)的關(guān)鍵問題。

圖3 (a)乙拌磷的全掃質(zhì)譜圖及選用(b)m/z 186和(c)m/z 245為母離子時空白桔?；|(zhì)的總離子流圖Fig.3 (a) Full scan MS spectra of disulfoton and total ion chromatograms of blank Platycodonis radix matrix with precursor ions (b) m/z 186 and (c) m/z 245

首先,選擇合適的母離子和子離子是保證目標化合物獲得最佳靈敏度的重要前提。母離子應(yīng)優(yōu)先選擇m/z較大且相對豐度較大的碎片離子,但由于某些m/z或豐度較大的離子有基質(zhì)干擾,因此需要選擇其他更合適的離子作為母離子以避免干擾,例如,乙拌磷的初級碎裂質(zhì)譜圖中(見圖3a),m/z186的碎片離子豐度明顯高于m/z245,本應(yīng)選擇m/z為186的碎片離子作為母離子,但因為桔梗樣品中也產(chǎn)生m/z186碎片離子,采用此離子作為母離子時樣品基質(zhì)產(chǎn)生的背景干擾(見圖3b)比m/z為245的碎片離子作為母離子時(見圖3c)高10倍,所以為降低化合物電離時的基質(zhì)效應(yīng)，最終選擇m/z為245的碎片離子作為母離子。

其次,一般來說提高激發(fā)電壓可使離子阱中的母離子加速與惰性氣體分子發(fā)生劇烈碰撞,促進母離子的裂解,即碰撞電壓的大小能影響母離子的裂解程度。通常選擇能使母離子充分裂解的電壓以確?；衔锒壻|(zhì)譜的響應(yīng)達到最大,但不同化合物裂解情況不一,如降低殺撲磷激發(fā)電壓反而可以增加子離子的豐度,當激發(fā)電壓由1 V降低至0.8 V時子離子豐度增加了43.4%(見圖4a)。又如溴苯磷的激發(fā)電壓由1 V增加到1.5 V時,雖然可以使其母離子m/z377碎裂更完全,可子離子m/z362的豐度也隨之降低36.3%,因此仍然采用1 V作為激發(fā)電壓(見圖4b)。

圖4 不同激發(fā)電壓下(a)殺撲磷和(b)溴苯磷的母離子碎裂質(zhì)譜圖Fig.4 Precursor ion cleavage MS spectra of (a) methidathion and (b) leptophos at different excitation voltages

最后,離子阱的特征是選擇和儲存離子,最大激發(fā)能量(q值)是表征離子在阱中穩(wěn)定性的無量綱參數(shù)。q值大,離子在阱中的振蕩能量高,離子易裂解,但同時也會造成碎片離子易從阱中拋出。相反,q值小,離子在阱中相對穩(wěn)定,但母離子不易裂解,相應(yīng)的子離子產(chǎn)率比較低。本實驗發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)q值為0.225、0.3、0.45時對多數(shù)母離子碎裂的影響不大,因此全部采用0.3,這也與Derouiche等[23]的研究結(jié)果一致。

2.3 前處理條件的選擇

考慮到對多種農(nóng)藥殘留的整體提取效率,重點考察了乙腈、丙酮和乙酸乙酯等3種常用于多殘留檢測的提取溶劑,經(jīng)實驗對比,3種溶劑雖然在個別農(nóng)藥上的提取效率各有高低、但綜合來看乙腈對多種農(nóng)藥成分的整體提取效率略好于另外兩種,目標檢測物的響應(yīng)值較高,同時提取的色素和油脂等雜質(zhì)也相對較少,這有利于降低背景干擾,提高檢測靈敏度,因此選定乙腈作為提取溶劑。

凈化方式對去除雜質(zhì)、降低背景干擾、提高方法檢出限具有重要意義,實驗重點考察了各種常用SPE固相萃取小柱和GPC的凈化效果。由于中藥材基質(zhì)復(fù)雜、脂類雜質(zhì)較多,經(jīng)過對比碳十八固相萃取柱(C18)、弗羅里硅土固相萃取柱(Florisil)、中性氧化鋁固相萃取柱(N-Al2O3)以及GPC凈化后的效果(見圖5),凈化效果從總離子流圖上判斷依次為GPC>Florisil≈N-Al2O3>C18。因此,決定采用GPC凈化。

圖5 不同凈化方法下空白加標桔?；|(zhì)的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatograms of of Platycodonis radix in blank spiked matrix solution with different clean methods GPC:gel permeation chromatography.

2.4 線性范圍、定量限和回收率

本實驗采用空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標準曲線,以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(X,μg/L)及該化合物峰面積(Y)繪制標準曲線,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r2),見附表1和附表2(詳見https://www.chrom-China.com)。結(jié)果表明,101種農(nóng)藥在一定線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)>0.995,滿足分析要求。以基質(zhì)空白標準溶液S/N≥3和10分別計算得到方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),101種農(nóng)藥的檢出限和定量限范圍分別為0.2～40.0 μg/kg和0.6～120.0 μg/kg,具體數(shù)值見附表1和附表2。

分別對桔梗原藥和當歸提取物進行了高、中、低3水平添加試驗(n=10),計算回收率和精密度。測定結(jié)果表明,101種農(nóng)藥在這兩種基質(zhì)中的平均回收率為58.3%～108.9%,10次平行測定的相對標準偏差為0.4%～16.5%,結(jié)果均滿足定量分析要求,每種基質(zhì)中各農(nóng)藥的添加水平和回收率等測定結(jié)果詳見附表1和附表2。

2.5 實際樣品檢測

應(yīng)用本方法檢測了本市藥店購買的3批桔梗和3批當歸原藥,未檢測到樣品中含有本方法相關(guān)農(nóng)藥,隨樣品進行基質(zhì)添加,其回收率滿足方法要求。通過對當歸原藥基質(zhì)添加的方法,采用本方法和《桑枝、金銀花、枸杞子和荷葉中488種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》(GB 23200.10-2016)同時檢測,相同農(nóng)藥定量結(jié)果的精密度小于15%,說明本方法可用于相關(guān)農(nóng)藥在中藥材中的定量檢測。

3 結(jié)論

本研究通過使用氣相色譜-離子阱質(zhì)譜技術(shù)建立了一種可操作性強、高效且可同時檢測桔梗原藥及當歸提取物中101種農(nóng)藥殘留的方法。本方法采用GPC為凈化手段,有效去除了樣品中的油脂、色素等干擾儀器檢測的雜質(zhì),采用氣相色譜-離子阱質(zhì)譜二級離子模式檢測,通過對色譜條件、質(zhì)譜掃描參數(shù)的優(yōu)化,進一步排除了基質(zhì)干擾。通過對比桔梗原藥及當歸提取物的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對于雜質(zhì)含量較少的提取物,原藥中絕大部分農(nóng)藥的回收率和靈敏度沒有明顯差異,說明本方法的凈化手段和檢測技術(shù)能有效排除復(fù)雜中藥基質(zhì)中雜質(zhì)的影響,實現(xiàn)了同時對101種農(nóng)藥的高效、高靈敏度定性和定量分析,方法可滿足當前韓國、日本、歐盟規(guī)定的相關(guān)農(nóng)藥最大殘留限量要求,是對現(xiàn)有中藥材中多農(nóng)殘檢測方法的有益補充。