邵伍軍,陳延安,袁紅露,金美春,周雪飛,覃玉梅,楊荷友,和燕玲(浙江海正藥業(yè)股份有限公司,浙江 臺州 318000)

替考拉寧是由放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的一系列結(jié)構(gòu)相似的糖肽類抗生素,主要用于治療嚴(yán)重的革蘭氏陽性菌感染[1]。替考拉寧結(jié)構(gòu)由七肽苷元母核、N-乙酰葡萄糖、甘露糖、R-氨基葡萄糖組成[2,3]?！吨袊幍洹?020版及《歐洲藥典》10.0收錄的替考拉寧活性組分有TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5、TA2-6,其中TA2-2為主要組分,占各組分相對含量的40%以上,其主成分結(jié)構(gòu)如圖1[4,5]。

替考拉寧母核是由7個氨基酸殘基之間氧化交聯(lián)產(chǎn)生的七肽苷元結(jié)構(gòu),氨基酸上的羥基會進(jìn)一步糖基化連接N-乙酰葡萄糖、甘露糖、葡萄糖胺,葡萄糖胺會繼續(xù)發(fā)生脂肪酰基化,連接的脂肪鏈的長短、取代基及碳鏈的不飽和度造成了替考拉寧各組分之間的差異性。目前,對替考拉寧主成分及雜質(zhì)的研究方法主要有超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、核磁、高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)。Barna等[6]通過水解純化、核磁共振、高分辨質(zhì)譜等技術(shù)對替考拉寧5個組分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,為以后替考拉寧其他組分及雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定奠定了基礎(chǔ)。Tengattin等[7]基于高效液相色譜-質(zhì)譜方法發(fā)現(xiàn)TA3-1由TA2-2水解脫去R-氨基葡萄糖而產(chǎn)生。Cometti等[8]通過二維液相色譜-核磁、氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)證明TA2-6a及TA2-6b側(cè)鏈為十二烷基?；?0-甲基十一烷基?；orghi等[9]通過純化制備、核磁共振、高分辨質(zhì)譜等技術(shù)證明TA2-1a和TA2-1b側(cè)鏈為6-甲基辛酰基和壬?；arrubini等[10]建立了液相色譜-質(zhì)譜方法對替考拉寧主成分及雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推斷,替考拉寧結(jié)構(gòu)由于含有2個Cl,采用低分辨質(zhì)譜很難顯示同位素峰,對某些特征離子碎片的推測也存在偏差。García-Gómez等[11]使用不同填料的色譜柱分離替考拉寧組分,通過高分辨質(zhì)譜推斷了14個其他組分的結(jié)構(gòu)。張含智等[12]基于高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜推導(dǎo)了11個具有替考拉寧母核組分的結(jié)構(gòu)和4個R-氨基葡萄糖化合物。

TeicoplaninRR′FormulaTA2-1aTA2-1bTA2-1TA2-2TA2-3TA2-4TA2-5TA2-6aTA2-6bC87H95Cl2N9O33C87H95Cl2N9O33C88H95Cl2N9O33C88H97Cl2N9O33C88H97Cl2N9O33C89H99Cl2N9O33C89H99Cl2N9O33C90H101Cl2N9O33C90H101Cl2N9O33TA3-1H/C72H68Cl2N8O28圖1 《歐洲藥典》中替考拉寧的結(jié)構(gòu)Fig.1 StructureofteicoplanininEuropeanpharmacopoeia

近年來,多維或二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對復(fù)雜體系的分離分析是分析化學(xué)的重要研究方向。與一維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用相比,多維或二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)既能實現(xiàn)多維或二維液相色譜對復(fù)雜體系的分離分析,又能體現(xiàn)質(zhì)譜高靈敏度及對未知雜質(zhì)進(jìn)行定性定量研究的特點(diǎn),已成為復(fù)雜樣品分離分析中的一種非常有效的工具。迄今為止,已有很多關(guān)于多維或二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用報道,如陳璇等[13]使用在線二維集束毛細(xì)管柱-高氣壓光電離-飛行時間質(zhì)譜測定單萜類化合物;王智聰?shù)萚14]對金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的測定;柴爽爽等[15]對水稻葉片蛋白質(zhì)組的研究;徐明明等[16]使用在線脫鹽質(zhì)譜法識別了氨基葡萄糖液相色譜的可疑色譜峰等。替考拉寧為發(fā)酵藥物,成分復(fù)雜,雜質(zhì)較多,《歐洲藥典》10.0中替考拉寧分析方法中流動相含有磷酸二氫鈉不揮發(fā)性鹽,與質(zhì)譜檢測的要求不匹配,重新建立適合質(zhì)譜檢測的系統(tǒng),雖然對檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以推導(dǎo),但無法實現(xiàn)與藥典色譜條件下各雜質(zhì)峰的準(zhǔn)確定位。因此本實驗建立二維超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜法(2D-UPLC-Q/TOF-MS),對替考拉寧的雜質(zhì)進(jìn)行分析,一維液相色譜采用藥典方法對各色譜峰進(jìn)行分離,對《歐洲藥典》10.0收錄的10個成分根據(jù)相對保留時間進(jìn)行了準(zhǔn)確定位,二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用使用適合質(zhì)譜檢測的流動相體系進(jìn)行脫鹽,對替考拉寧的10個成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn),同時對其他未知雜質(zhì)進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜分析,確認(rèn)了張含智等[12]推導(dǎo)的11個具有替考拉寧母核組分的結(jié)構(gòu)和4個R-氨基葡萄糖化合物,還發(fā)現(xiàn)了2個替考拉寧母核特征碎片離子及3個未知雜質(zhì),為替考拉寧質(zhì)量控制和工藝改進(jìn)提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC 2D/Xevo G2-XS Q/TOF二維超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)。Milli-Q Advantage A10超純水儀(德國Merck公司)。

乙腈為色譜純(德國Merck公司);甲酸銨、甲酸均為質(zhì)譜純(德國Sigma公司);其余試劑均為分析純;歐洲藥典委員會替考拉寧對照品(批號:2.0)。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1一維液相色譜方法

色譜柱:Octadecyl silica (ODS) hypersil色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);波長:254 nm;流速:2.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20.0 μL;流動相A:3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液(pH 6.0)/乙腈=9/1(v/v),流動相B:3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液(pH 6.0)/乙腈=3/7(v/v)。梯度洗脫程序:0～34.50 min,0B～50%B;34.50～35.60 min,50%B～90%B,35.60～40.25 min,90%B;40.25～47.15 min,90%B～0B;47.15～51.00 min,0B。

1.2.2二維液相色譜方法

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:45 ℃;流動相A:0.01 mol/L甲酸銨水溶液(pH 6.0),流動相B:乙腈;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min,2%B;2.0～30.0 min,2%B～80%B;30.0～35.0 min,80%B;35.0～35.1 min,80%B～2%B;35.1～38.0 min,2%B。

1.2.3質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源;正離子模式;全掃描范圍:m/z100～2 500;錐孔氣流速:50 L/h;錐孔電壓:60 V;離子源溫度:120 ℃;霧化氣流速:900 L/h;霧化氣溫度:500 ℃;毛細(xì)管電壓:2 500 V;采集模式:全信息串聯(lián)質(zhì)譜(MSE)模式;碰撞能量:20～50 eV。

1.3 溶液配制

稱取替考拉寧20 mg,置于10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,混勻,配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的替考拉寧溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 一維液相色譜分析

替考拉寧一維液相色譜圖中有26個峰(如圖2所示),根據(jù)《歐洲藥典》10.0中的相對保留時間及一級質(zhì)譜結(jié)果,替考拉寧10個主要組分TA3-1、TA2-1a、TA2-1b、TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5、TA2-6a、TA2-6b的色譜保留時間分別為8.92、17.77、18.42、19.55、20.95、21.50、23.59、24.07、27.12、27.63 min,其他色譜峰均為雜質(zhì)峰。

2.2 替考拉寧TA2-2裂解途徑推導(dǎo)

圖2 替考拉寧的一維液相色譜圖Fig.2 One-dimensional liquid chromatogram of teicoplanin 1.TA3-1;5.TA2-1a;6.TA2-1b;7.TA2-1;11.TA2-2;13.TA2-3;18.TA2-4;20.TA2-5;24.TA2-6a;25.TA2-6b;2,3,4,8,9,10,12,14,15,16,17,19,21,22,23,26.impurities.

圖3 TA2-2的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of TA2-2

替考拉寧組分復(fù)雜,但其結(jié)構(gòu)相似,在質(zhì)譜中的裂解途徑基本一致,TA2-2是替考拉寧含量最多的組分,其結(jié)構(gòu)已知,可以通過其二級質(zhì)譜信息(如圖3所示)來推測替考拉寧其他組分及雜質(zhì)的裂解方式,TA2-2可能的裂解方式見圖4。TA2-2組分(圖2中峰11,下文中峰號均與圖2中峰號相對應(yīng))的準(zhǔn)分子離子峰m/z為1 878.5 643([M+H]+);TA2-2組分失去C5H6N2O4基團(tuán)、R-氨基葡萄糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖后得到m/z為1 720.4 591、1 563.3 643、1 401.3 124、1 360.2 847的替考拉寧母核離子;m/z1 401.3 124的離子失去氨、N-乙酰葡萄糖后得到m/z為1 384.2 740、1 198.2 306的離子;m/z1 198.2 306的離子失去氨得到m/z為1 181.1 993的離子。R-氨基葡萄糖特征離子(m/z316.213 1)失水后得到m/z298.203 3的離子,再失去1分子水得到m/z280.193 9的離子,該烯醇式離子可以轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酮式結(jié)構(gòu)m/z為250.180 9。N-乙酰葡萄糖特征離子(m/z204.286 3)也會經(jīng)歷相同的失水過程得到m/z為186.075 4和168.068 0的離子。m/z186.075 4的離子失去N-乙酰基和水得到m/z144.065 8的離子,再失去1分子水得到m/z126.057 0的離子。

2.3 替考拉寧雜質(zhì)解析

替考拉寧各組分主要區(qū)別在于R-氨基葡萄糖與糖苷不同,但其裂解規(guī)律與主成分TA2-2的裂解規(guī)律一致,其次結(jié)合一維液相色譜的相對保留時間對主成分也可以準(zhǔn)確定位。本實驗結(jié)合相對保留時間及二級質(zhì)譜信息(主成分及雜質(zhì)MS數(shù)據(jù)見表1)確認(rèn)了《歐洲藥典》中的10個組分,并對其他22個雜質(zhì)進(jìn)行了裂解分析。

圖4 TA2-2的質(zhì)譜裂解規(guī)律Fig.4 MS fragmentation pathway of TA2-2

峰2的準(zhǔn)分子離子m/z為1 563.3 555 ([M+H]+),相對保留時間為0.51,推測分子式為C72H68Cl2N8O28,二級質(zhì)譜信息與TA3-1基本一致,確認(rèn)為TA3-1的同分異構(gòu)體。

峰3的準(zhǔn)分子離子m/z為1 360.2 870 ([M+H]+),相對保留時間為0.53,推測分子式為C64H55Cl2N7O23,二級質(zhì)譜中未發(fā)現(xiàn)N-乙酰葡萄糖和R-氨基葡萄糖的相關(guān)離子,其他質(zhì)譜信息與TA3-1基本一致,確認(rèn)為TA3-1脫去N-乙酰葡萄糖的降解產(chǎn)物。

峰4的準(zhǔn)分子離子m/z為1 874.5 238 ([M+H]+),相對保留時間為0.81,推測分子式為C88H93Cl2N9O33,其準(zhǔn)分子離子m/z1 874.5 238比TA2-1準(zhǔn)分子離子m/z1 876.5 498少2,m/z為312.181 3、294.169 1、276.161 5、246.146 7的離子均比TA2-1R-氨基葡萄糖的相關(guān)離子少2;m/z為204.086 3、186.075 4、168.068 0、144.065 8、126.057 0的離子與TA2-1中N-乙酰葡萄糖基團(tuán)的相關(guān)離子基本一致,推測其R′分子式為C10H15O,確認(rèn)為TA2-1在R′端脫去2H。

峰8有兩個組分,準(zhǔn)分子離子m/z為1 673.4 567 ([M+H]+)和1 876.5 613 ([M+H]+),相對保留時間為0.96,其中m/z1 876.5 613的色譜峰二級質(zhì)譜信息與TA2-1基本相同,確認(rèn)為TA2-1同分異構(gòu)體;準(zhǔn)分子離子m/z為1 673.4 567的色譜峰二級質(zhì)譜中未發(fā)現(xiàn)N-乙酰葡萄糖基團(tuán)的相關(guān)離子,推測分子式為C80H82Cl2N8O28,其他二級質(zhì)譜信息與TA2-1基本相同,確認(rèn)為TA2-1脫去N-乙酰基葡萄糖的降解產(chǎn)物。

峰9準(zhǔn)分子離子m/z為1 878.5 585 ([M+H]+),相對保留時間為0.97,其二級質(zhì)譜信息與TA2-2基本一致,根據(jù)相對保留時間確認(rèn)為TA2-2同分異構(gòu)體。

峰10的準(zhǔn)分子離子m/z為2 040.6 152 ([M+H]+),相對保留時間為0.99,推測分子式C94H107Cl2N9O38,與TA2-2分子式相比多C6H10O5(甘露糖),其中m/z為1 883.5 231、1 725.4 077、1 563.3 669、1 546.3 328、1 522.3 447的離子與TA2-2二級質(zhì)譜信息m/z為1 720.4 591、1 563.3 654、1 401.3 124、1 384.2 740、1 360.2 847的離子相比均多162(C6H10O5),其他二級質(zhì)譜信息與TA2-2基本一致,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-2加甘露糖。

表1 替考拉寧樣品中主成分及雜質(zhì)的MS數(shù)據(jù)Table 1 MS data of principal components and impurities in teicoplanin

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

峰12有兩個組分,準(zhǔn)分子離子m/z為2 040.6 152 ([M+H]+)和1 675.4 928 ([M+H]+),相對保留時間為1.01,其中m/z為2 040.6 152的色譜峰二級質(zhì)譜信息與TA2-2加一分子甘露糖基本一致,根據(jù)相對保留時間確認(rèn)為TA2-3加甘露糖;m/z為1 675.4 928的色譜峰二級質(zhì)譜中未發(fā)現(xiàn)N-乙酰葡萄糖基團(tuán)的相關(guān)離子,其他二級質(zhì)譜信息與TA2-3基本相同,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-3脫去N-乙酰葡萄糖的降解產(chǎn)物。

峰14有兩個組分,準(zhǔn)分子離子m/z為1 878.5 706 ([M+H]+)和1 716.5 077 ([M+H]+),相對保留時間為1.04,m/z1 878.5 706的色譜峰二級質(zhì)譜信息與TA2-2基本一致,根據(jù)相對保留時間確認(rèn)為TA2-3同分異構(gòu)體;m/z1 716.5 077的色譜峰推測分子式為C82H87Cl2N9O28,與TA2-2分子式相比少C6H10O5(甘露糖),其他二級質(zhì)譜信息與TA2-2基本一致,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-2脫去甘露糖的降解產(chǎn)物。

峰15有兩個組分,準(zhǔn)分子離子m/z為1 716.5 150 ([M+H]+)和1 912.5 557 ([M+H]+),相對保留時間為1.07,其中m/z1 716.5 150的色譜峰二級質(zhì)譜信息與TA2-2脫去甘露糖基本一致,根據(jù)相對保留時間確認(rèn)為TA2-3脫去甘露糖的降解產(chǎn)物;m/z1 912.5 557的色譜峰推測分子式為C88H96Cl3N9O33,與TA2-2分子式相比多1個Cl,準(zhǔn)分子離子m/z比TA2-2多34,m/z為1 435.2 800、1 418.2 363、1 394.2 437、1 232.1 987、1 215.1 553的離子均比TA2-2中相關(guān)離子多34,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-2母環(huán)上的某個H被Cl取代,但取代位置還有待核磁技術(shù)去證明。

峰16有兩個組分,準(zhǔn)分子離子m/z為1 844.6 136 ([M+H]+)和1 890.5 781 ([M+H]+),相對保留時間為1.10,其中m/z1 890.5 781的色譜峰推測分子式為C89H97Cl2N9O33,與TA2-4分子式相比少2H,m/z為328.211 2、310.203 8、292.193 8、262.182 5的離子均比TA2-4中R-氨基葡萄糖相關(guān)離子m/z少2,其他質(zhì)譜信息與TA2-4基本一致,根據(jù)相對保留時間及二級質(zhì)譜信息確認(rèn)為TA2-4在R′端脫去2H;m/z1 844.6 136的色譜峰推測分子式為C88H98ClN9O33,與TA2-2分子式相比少1個Cl,m/z為1 367.3 529、1 326.3 231、1 164.2 623、1 147.2 397、1 129.2 288的離子均比TA2-2中相關(guān)離子m/z少34,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-2母環(huán)上的某個Cl被H取代,但取代位置無法用質(zhì)譜來證明。

峰17有兩個組分,準(zhǔn)分子離子m/z為1 890.5 781 ([M+H]+)和2 054.6 470 ([M+H]+),相對保留時間為1.11,其中m/z1 890.5 781的色譜峰二級質(zhì)譜與峰16(TA2-4在R′端脫2H)基本一致,根據(jù)相對保留時間確認(rèn)為TA2-5在R′端脫2H;m/z2 054.6 470的色譜峰推測分子式為C95H109Cl2N9O38,與TA2-4分子式相比多C6H10O5(甘露糖),其中m/z為1 890.5 248、1 725.4 247、1 563.3 669、1 546.3 328、1 522.3 447的離子與TA2-4中相關(guān)離子相比m/z均多162(C6H10O5),其他二級質(zhì)譜信息與TA2-4基本一致,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-4加甘露糖。

峰19準(zhǔn)分子離子m/z為2 054.6 284 ([M+H]+),相對保留時間為1.14,二級質(zhì)譜信息與峰17(TA2-4加甘露糖)基本一致,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-5加甘露糖。

峰21準(zhǔn)分子離子m/z為1 892.5 801 ([M+H]+),相對保留時間為1.17,二級質(zhì)譜信息與TA2-5基本一致,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-5同分異構(gòu)體。

峰22準(zhǔn)分子離子m/z為1 730.5 262 ([M+H]+),相對保留時間為1.19,推測分子式為C83H89Cl2N9O28,與TA2-5分子式相比少C6H10O5(甘露糖),其他質(zhì)譜信息與TA2-5基本一致,結(jié)合相對保留時間確認(rèn)為TA2-5脫去甘露糖的降解產(chǎn)物。

峰23準(zhǔn)分子離子m/z為1 976.6 354 ([M+H]+),相對保留時間為1.27,推測分子式為C94H107Cl2N9O34,與TA2-2分子式相比多C6H10O,m/z為126.053 2、144.066 7、168.063 8、186.076 6、204.087 6的離子與TA2-2中N-乙酰葡萄糖基團(tuán)的相關(guān)離子基本一致,m/z為250.176 0、280.188 8、298.198 1、316.207 8的離子與TA2-2中R-氨基葡萄糖的相關(guān)離子基本一致,m/z1 918.5 934的離子比m/z1 976.6 354少58(C3H6O),m/z1 661.4 230的離子與TA2-2中m/z1 563.3 643的離子相比多98(C6H10O),m/z1 603.3 770的離子與TA2-2中m/z1 563.3 643的離子相比多40 (C3H4),結(jié)合相對保留時間及二級質(zhì)譜信息確認(rèn)為TA2-2/3母環(huán)上的2個H被丙醇和環(huán)丙烷取代,但取代位置還需制備純化雜質(zhì)通過核磁精確鑒定。

峰26準(zhǔn)分子離子m/z為1 918.5 992 ([M+H]+),相對保留時間為1.42,推測分子式為C91H101Cl2N9O33,與TA2-2分子式相比多C3H4,m/z為126.057 0、144.065 8、168.062 7、186.075 4、204.086 3的離子與TA2-2中N-乙酰葡萄糖基團(tuán)的相關(guān)離子基本一致,m/z為250.180 9、280.187 1、298.203 3、316.213 1的離子與TA2-2中R-氨基葡萄糖的相關(guān)離子基本一致,m/z1 760.4 945的離子比TA2-2中m/z1 720.4 591的離子多40(C3H4),m/z1 441.3 494的離子比TA2-2中m/z1 401.3 124的離子多40(C3H4),結(jié)合相對保留時間及二級質(zhì)譜信息確認(rèn)為TA2-2/3母環(huán)上的1個H被環(huán)丙烷取代,但取代位置無法通過質(zhì)譜確定。

3 結(jié)論

本研究建立了二維超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質(zhì)譜對替考拉寧雜質(zhì)的研究方法,對替考拉寧主成分及22個雜質(zhì)進(jìn)行了二級質(zhì)譜分析,方法簡便、靈敏,有效地解決了流動相中含不揮發(fā)性鹽的色譜系統(tǒng)不適用于質(zhì)譜快速鑒定雜質(zhì)的難題。本研究新發(fā)現(xiàn)了3個雜質(zhì)TA2-2加氯、TA2-2/3母環(huán)上的2個H被丙醇和環(huán)丙烷取代與TA2-2/3母環(huán)上的1個H被環(huán)丙烷取代;m/z為1 720.4 591、1 601.3 199的2個母核特征離子。研究結(jié)果為嚴(yán)格控制替考拉寧質(zhì)量及替考拉寧工藝純化提供了一種新解決思路。

致謝:感謝沃特世科技(上海)有限公司楊青老師在實驗和解譜上的幫助與指導(dǎo)!