肖志強， 劉傳杰， 陳殿松， 蔣建新*

(1.北京林業(yè)大學 材料科學與技術學院，北京 100083； 2.廣州德谷個人護理用品有限公司，廣東 廣州 510000；3.國家林業(yè)和草原局木本香料(華東)工程研究中心，江西 南昌 330045)

茶皂素又名茶皂苷，是山茶科植物中含有的一類糖苷類物質，由糖體、皂苷元(配基)和有機酸三部分組成的結構復雜的五環(huán)三萜化合物[1-2]。茶皂素是一種性能良好的非離子表面活性劑，具有起泡、分散和乳化等作用，且具有抑菌、溶血、抗癌和抗炎等生理活性，在生產各類乳化劑、洗滌劑和殺菌劑等領域有廣泛應用[3-6]。目前油茶皂素的提取方法主要是水提法和醇提法[7]，這兩種方法具有工藝簡單、成本低和污染小等特點，但得到的茶皂素往往純度不高[8]，含有黃酮、多酚、蛋白質和色素等雜質，導致茶皂素的色澤較深，進而影響茶皂素在洗發(fā)香波等中高檔產品中的應用。因此工業(yè)生產中要對茶皂素進行脫色，從而拓寬茶皂素的應用領域。傳統(tǒng)的物理吸附脫色方法對油茶皂素并沒有很好的脫色效果，甚至會由于吸附劑的無選擇性導致目標產物的損失[9]。過氧化氫能通過產生高反應性氧化劑羥基自由基與自由物發(fā)生反應，達到漂白作用[10]。凹凸棒土是一種富含鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，其特有的纖維狀或棒狀晶體形態(tài)使其具備了較大的比表面積和良好的吸附性能，有研究表明，凹凸棒土有較強的吸附脫色功能[11]。目前相關領域對皂素的色澤評價方法僅停留在類似色階比色計分析等較淺層次的階段，不同茶皂素色澤評價方法的優(yōu)劣之處也未見有系統(tǒng)且深層次的研究。而對茶皂素進行系統(tǒng)且合理的色澤評價至關重要，因為不同的色澤評價方法在同一樣品的研究中可能產生不同的結果。因此,開展茶皂素色澤評價方法的建立勢在必行。本研究采用過氧化氫/凹凸棒土耦合體系對油茶皂素進行脫色，探究最適宜茶皂素脫色的條件，并通過比較不同的顏色評價方法，為茶皂素的色澤鑒定奠定實驗基礎，以期為今后油茶皂素的工業(yè)化生產應用提供理論依據。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

油茶皂素(純度40%，粒徑約0.075 mm)，產自浙江；過氧化氫溶液(30%)，氫氧化鈉和鹽酸，均為市售分析純；凹凸棒土(純度≥95%，粒徑約0.075 mm)，常州鼎邦礦產品科技有限公司。

LGJ-12冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV- 6100A紫外可見分光光度計，上海比朗儀器有限公司；FE28 pH計，瑞士梅特勒公司；分光輻射亮度計(PR715)，美國Photo Research公司；WSL系列羅維朋比色計，上海儀電物理光學儀器有限公司；SONY CORP系列數碼相機，日本SONY公司。

1.2 實驗方法

1.2.1油茶粗皂素預處理 油茶粗皂素經無水乙醇在料液比1 ∶10(g ∶mL)、 70 ℃下純化1 h，離心除去蛋白質和多糖等水溶性物質，同一批粗皂素純化3次，旋蒸濃縮，真空干燥后得到純化皂素。將此純化皂素作為后續(xù)脫色實驗的原料。純化皂素得率為(42.08±0.68)%，純度根據香草醛濃硫酸法測得為(60.20±1.32)%。實驗時做兩組平行實驗，取平均值。純化皂素得率根據式(1)計算。

Y1=m1/m×100%

(1)

式中:Y1—純化皂素得率，%；m1—浸提后皂素總質量，g；m—浸提前粗皂素質量，g。

1.2.2皂素的脫色 用去離子水將純化后的茶皂素配置成質量分數5%的皂素溶液(用10%的氫氧化鈉將溶液pH值調至10)，加入一定量的過氧化氫溶液，加熱反應一段時間，反應完后取出錐形瓶，用鹽酸將溶液pH值調至4.39(原料溶液的pH值)，再加入凹凸棒土吸附25 min，最后取出溶液于4 000 r/min 離心15 min，離心后的上清液稀釋成1%的溶液在分光光度計下測定吸光度，然后濃縮、冷凍和干燥制得脫色皂素，保存至干燥器中，用作其他色澤評價。實驗時做兩組平行實驗。脫色皂素的得率根據式(2)計算。

Y2=m2/m3×100%

(2)

式中：Y2—脫色皂素得率，%；m2—脫色后皂素質量，g；m3—脫色前皂素質量，g。

1.2.3正交試驗 在實驗室前期研究的基礎上，采用正交試驗法優(yōu)化油茶皂素脫色條件。選擇H2O2用量4%～8%，脫色溫度60～80 ℃，脫色時間1～3 h，凹凸棒土用量1%～3%(以脫色前皂素質量計)，以分光光度計(510 nm)的脫色率為指標，每個條件均進行兩次平行試驗。

1.3 顏色的評價

1.3.1分光光度計法 將脫色后的皂素稀釋成質量分數1%的溶液，以去離子水為空白，分別在510和480 nm波長下利用分光光度計測量其吸光度值(所測吸光度值均在0.2～1.0之間)，脫色率根據式(3)計算。

η=(A0-A1)/A0×100%

(3)

式中：η—脫色率，%；A0—1%原料在一定波長下的吸光度,510 nm下A0=0.676 0,480 nm下A0=0.797 6；A1—脫色后皂素溶液在一定波長下的吸光度。

1.3.2分光輻射亮度計法 參考嚴俊等[12]的方法，使用分光輻射亮度計進行顏色測定，并將測定記錄的數據(L*、a*和b*值)進行綜合分析。L*值是顏色的明度值，表示色彩的明暗度，其范圍從0到100，值為0時明度最低，值為100時明度最高。a*、b*值是色彩的色度值，其中a*值從紅(正值)到綠(負值)漸變，b*值則由黃(正值)到藍(負值)漸變。其中L*值是衡量亮度的一個重要的指標，故使用L*值作為脫色效果的衡量標準。脫色率根據式(4)計算。

(4)

式中：L0*—皂素脫色前的明度值；L1*—皂素脫色后的明度值。

1.3.3羅維朋比色計法 將5%的脫色后的皂素溶液注入比色皿中，再把比色皿放到比色箱的槽里即可開始測量(使比色皿緊貼色片盒窗口)，通過觀察目鏡，移動儀器配套的羅維朋濾色片使比色箱內兩視場的顏色保持一致，記錄此時的濾色片數據。采用配套的比色皿尺寸(nm)為10×20×40。脫色率根據式(5)計算。

η=(R0-R1)/R0×100%

(5)

式中：R0—脫色前皂素的羅維朋紅度值，數值為2.0；R1—脫色后皂素的羅維朋紅度值。

1.3.4直觀觀察拍照法 將脫色后的皂素研磨后過0.425 mm篩，稱取0.48 g樣品，為了杜絕普通玻璃反光導致的色度不均一，放置于定制的帶圓槽的石英比色皿中并將其緊壓，最后采用SONY CORP系列相機在同一光照環(huán)境下對凍干樣品進行拍照。

1.3.5色階比色法 制備標準色階比色卡，將脫色后的皂素和純化皂素進行比色。表1為制備的標準色階比色卡。圖1為制備的標準色階比色卡顏色變化。

表1 標準色階比色卡

圖1 標準色階比色卡顏色變化

2 結果與分析

2.1 脫色正交試驗結果分析

在此最優(yōu)條件下進行2組驗證試驗，510 nm下脫色率為78.99%和80.04%，平均值為79.52%，脫色效果顯著，證明該優(yōu)化條件可行。

表2 油茶皂素脫色情況的正交試驗結果

2.2 顏色測定結果

2.2.1分光光度計法 分光光度計法是一種基于朗伯比爾定律原理的顏色測定方法。在可見光波段，通常采用鎢燈作為可見光區(qū)的光源，具有較大共軛體系的分子結構的物質(黃酮等物質)在這一波段會出現特定的吸收，吸收的強度能提供有效的信息并以此作為定量分析基礎[14]。如Verma等[15]利用分光光度計對染料顏色的脫色率進行了測定，測色效果良好。

皂素的最大吸收波長在210 nm左右，提取的皂素中一般含有色素、黃酮和單寧等顯色雜質[16]。然而，在查閱大量資料后發(fā)現：這些顯色物質根據現有理論并無統(tǒng)一和準確的標準，并不能簡單地通過類似黃酮一種單一物質的最大顯色波長來論定。而由分光光度計的原理可知，溶液之所以呈現不同顏色，與它對光的選擇性吸收有關，即溶液對可見光區(qū)的光吸收越強，則該溶液顏色越深，反之越淺，在此理論基礎上同時參考相關文獻[17]，選取與皂素無交叉影響的可見光波長510 nm作為脫色率計算標準。同時采用了現有研究中480 nm波長作為研究標準[18]進行對比研究。

物質對光的吸收是有選擇性的，本實驗選用的510和480 nm屬于可見光的范疇，脫色前后的皂素溶液在分光光度計上的吸光度會發(fā)生變化，從表3可看出，有些實驗組(樣品1、 2、 7、 8和9)脫色率相差細微，說明分光光度計是一種對溶液顏色十分敏感的顏色檢測儀器。當溶液顏色較深時，對光的吸收較大；溶液顏色較淺時，對光的吸收也較小。

分光光度計對茶皂素溶液色澤的評價能夠達到精確且量化的程度，受人為因素影響小，這也是Wang等[19]使用分光光度計對水溶液中酸性橙7的脫色定量測定的原因之一，因此，選用此法作為本研究的主要依據。由數據可知，對比510、 480 nm下脫色皂素溶液的測定結果，發(fā)現在兩個波段的原料皂素吸光度和脫色皂素吸光度均稍有相同，且在510 nm的脫色率均比480 nm高，這可能是由茶皂素中色素和黃酮等顯色物質在不同波段的吸光度有差異導致的，但兩個波段脫色率呈現一致規(guī)律，且最佳條件的脫色率均達到較高水平。由此可見分光光度計適用于對茶皂素溶液進行精確且量化的顏色測定；同時在選用分光光度計作為色澤評價工具時需綜合考察顯色物質在不同可見光波段對結果的影響。

表3 分光光度計脫色率和羅維朋比色計脫色率

2.2.2羅維朋比色計法 羅維朋比色計是一種目視顏色測量儀器，它采用了國際公認的專用色標——羅維朋色標度來測量各種液體、膠體、固體和粉末樣品的色度。如Irshad等[20]使用羅維朋比色計成功地評價了一種固體肉制品的顏色。該儀器具有結構簡單，操作便利的特點，常用于食油、飲料、果醬等物質的顏色測定[21-22]。

羅維朋比色計利用一系列的濾色片對白光加以吸收，通過濾色片后的光色與待測顏色進行比較得到結果，是一種結構簡單、使用方便的目視測色儀器?？梢詼y定固體和液體等物質的顏色，是國際上普遍采用的測量色度的儀器，該法只需測定紅、黃、藍3個值，且本實驗發(fā)現不需使用藍色濾色片。本實驗測得的黃度值都是10，故不列出，只測量紅度值的大小。

分光光度計適合樣品中顯色物質在可見光波段有明顯吸收時使用，而羅維朋比色計雖然無法達到其精確量化程度，但羅維朋比色不受吸光度需介于0.2～1.0條件的拘束，在需要對物質顏色進行更廣泛的測定場景中占有優(yōu)勢。但因為影響羅維朋比色計測量結果準確度的因素較多[23]，例如不同觀察者用同一儀器測量同一樣品有可能會有不同的測量值，張靜雯等[24]和周德祥等[25]研究發(fā)現在實驗中比色片的顏色會隨著使用者的長時間使用而逐漸失真，因此羅維朋比色計只能間歇使用，長時間使用會出現視覺疲勞，出現誤差，影響顏色評價準確性。此方法的優(yōu)點是操作簡單，且能夠達到定性分析和粗略定量分析程度。

2.2.3分光輻射亮度計法 分光輻射亮度計通過測量物體反射的光譜功率分布或者物體本身的反射光度特性，然后根據光譜測量數據計算出物體在各種標準光源和標準照明體下的三刺激值(L*、a*和b*)。三刺激值系統(tǒng)在顏色科學和紡織物色彩[26]領域中被廣泛應用，近年來在其他領域也被逐漸應用。Peterson等[27]就在視覺評價的基礎上，運用分光輻射亮度計對小麥籽粒顏色進行了客觀的評價，研究也表明L*、a*和b*3個數值難以捕捉到視覺上的“微妙之處”。Schelkopf等[28]利用類似的裝置測定成熟牛肉的3個刺激值(L*、a*和b*)，評估了成熟牛肉的胸長肌。分光輻射亮度計是一種對固體顏色評價的儀器，該法將脫色后的皂素進行干燥研磨后再進行測定。測得的3個指標L*、a*和b*能形成一個簡化的顏色空間，它在三維色空間的各個方向軸上具有視覺生態(tài)學的等距性，而且在明度指數和色品指數有區(qū)分，越來越受到各行業(yè)的廣泛重視和應用[29]。其中，明度值L*是衡量顏色深淺的一個指標(表4)，因此，將L*值用作脫色率計算的評價指標。與分光光度計法相比，最優(yōu)條件下脫色率依舊達到一個很高的水平，進一步證明了此正交試驗得出的最佳條件是可行的。由表4可知，有些試驗的脫色率與分光光度計法相比較低，脫色率較低(樣品3)的測得的b*值(由1.3.2節(jié)可知b*為正值時樣品的黃色比藍色占優(yōu)勢)明顯高于其他試驗，這有可能是H-K效應[30]導致的，即樣品的明度值會隨著顏色強度的加深而降低，進而影響測量結果。也就是說分光輻射亮度計作為一種顏色測定的補充辦法較為合適，這與陳泠等[31]對小麥顏色測定的結論相一致。與分光光度計相比，分光輻射亮度計不僅可用于茶皂素顏色的定量分析，在此基礎上細分了明度與色品的極差，而且可適用于較小色差情況下的顏色測量、比較和討論。

表4 分光輻射亮度計數據

2.2.4直觀觀察拍照法 直觀觀察拍照法可以直觀地看出物體顏色的深淺，不同光照條件下物質的顏色會發(fā)生變化，所以本研究是在實驗室中同一光照環(huán)境使用相機對樣品進行拍照(圖2)。

圖2 直觀觀察拍照法評價油茶皂素顏色結果

由圖可以看出，原料的顏色較深，而經脫色后的皂素分別呈現不同程度的脫色效果，經最佳條件脫色后的皂素顏色呈現乳白色，不僅證明了本研究的脫色條件的可行性，同時間接佐證了分光光度計法的精確性和量化性。且在實驗中發(fā)現，茶皂素保存時間較長時，其顏色有可能會因為氧化等反應而發(fā)生改變。為了更方便地對茶皂素顏色進行時間和空間上的記錄，相對于普通相機，使用數碼相機能夠達到更完整和更持久的保存目標。

2.2.5色階比色法 色階比色法也是一種較為常用的皂素色澤評價方法[32]。該法通過制備不同濃度的皂素溶液，即色階比色卡，其溶液顏色隨濃度的降低而減淡，利用脫色前和脫色后的溶液與色階比色卡進行比對，找出最接近的色階序列號。王超等[33]利用色階比色法對皂素顏色進行比較，但其僅通過一人試驗即得出結果，誤差較大。本研究為了減小由于人為感官之間的差異性而導致的誤差，通過 3個不同的測試者對脫色皂素試液和原料試液顏色進行比色，色階比色結果見表5。其中測試樣品包含原料、正交試驗1～9號及最優(yōu)條件下的皂素。由表可見，最優(yōu)條件下的比色結果仍然處于優(yōu)勢地位。

與羅維朋比色法類似，色階比色法使用時人為因素影響較大，但與其不同的是，色階比色法不會出現由于長時間眼睛使用產生的視覺疲勞，只需將樣品與比色卡進行短暫地比對便能得出結果，操作簡便，可行性強。當皂素顏色難以用肉眼區(qū)分時，但又亟需一個辨別標準時色階比色法能起到事半功倍的效果。

表5 色階比色結果1)

2.3 幾種方法結果對比

不同色澤評價方法對兩組最優(yōu)脫色條件下得到的脫色皂素評價結果見表6。

表6 最優(yōu)條件色澤評價表

由表可見，在最優(yōu)條件下脫色后的茶皂素，其分光光度計(510 nm)色澤評價結果與分光光度計(480 nm)接近，說明分光光度計法的可視化數據使其準確度更高。羅維朋評價結果相差較大，可能因為是一種目視比色法，導致誤差較大。色階比色法結果相同，這是因為相鄰兩個色階差異明顯，更易比色，這也證明了最優(yōu)條件方案的可行性，且經直接觀察拍照驗證，脫色后的油茶皂素經研磨后呈現乳白色，其脫色效果顯著，證明該優(yōu)化條件可行。雖然幾種方法測的脫色率略低于實際生產中白色皂素的脫色率值，有可能是不同皂素前處理過程的不同和脫色率計算方式差異所導致的，但本研究使用的脫色劑僅有過氧化氫和凹凸棒土，在生產應用中具有成本低廉和操作簡便的優(yōu)勢。Lin等[34]和Chahbane等[35]研究發(fā)現，H2O2可以憑借其強氧化性而用于含有還原性強的活性染料的紡織品廢水的脫色，說明茶皂素中的顯色物質是具有還原性的，而通過乙醇提取的茶皂素通常含有多糖、蛋白質等還原性強的物質[36]，H2O2會與這些物質發(fā)生氧化反應而導致皂素色澤的變淺；凹凸棒土具有吸附茶皂素中色素類物質的作用，色素含量的降低同樣會對茶皂素顏色產生影響。本研究結果證明：過氧化氫/凹凸棒土耦合體系適用于油茶皂素這類五環(huán)三萜類化合物中雜質的顏色去除，并且脫色效果顯著。

3 結 論

3.1 通過水浸提或者醇提的皂素通常含有多酚、多糖和色素等雜質，且色素類物質大多含有共軛雙鍵，本研究利用過氧化氫/凹凸棒土耦合體系對油茶皂素進行脫色，通過正交試驗得出最佳脫色條件：H2O2用量6%，溫度80 ℃，時間3 h，凹凸棒土用量3%。在此條件下可得到顏色為乳白色的脫色皂素，其脫色率達到(79.52±0.53)%(分光光度計510 nm)和(78.33±0.9)%(分光光度計480 nm)。其他色澤評價結果基本相近。

3.2 運用不同色澤評價方法對油茶皂素脫色效果進行評價，結果表明：分光光度計法精確度高、人為因素影響小，能夠達到對茶皂素溶液顏色的定量分析。分光輻射亮度計細分了明度與色品的極差，適用于較小色差情況下的顏色測量、比較和討論。羅維朋比色計是一種目視比色儀，受人為因素影響較大，但在需要對油茶皂素溶液進行較廣泛的色澤分析場景中具有優(yōu)勢。直觀拍照法可以直觀顯現出油茶皂素的顏色深淺，可以作為其他顏色鑒定的直接佐證和依據。色階比色法不易出現視覺疲勞，可行性強。