吳 松

(大唐東北電力試驗(yàn)研究院有限公司,吉林 長(zhǎng)春 130102)

大豆油在精煉過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)負(fù)荷比較高的廢水，此類(lèi)廢水直接排放會(huì)降低水中溶解氧，加重水體自凈化負(fù)擔(dān)，使水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化，嚴(yán)重污染環(huán)境，對(duì)人們生活造成危害[1-3]。精煉大豆油廢水的特點(diǎn)：一是有機(jī)物含量較高，其中油脂難溶于水且黏度較高，易生成乳化液，難生物降解；二是有毒物質(zhì)少，可生化性好[4]。因此，目前針對(duì)大豆油精煉過(guò)程中產(chǎn)生的廢水，國(guó)內(nèi)一般通過(guò)預(yù)處理去除懸浮物和乳化態(tài)油，再通過(guò)生化處理去除溶解態(tài)油和剩余有機(jī)物，使其達(dá)標(biāo)排放[5]，但是該處理工藝存在投資成本高、占地面積廣、工藝復(fù)雜且會(huì)造成二次污染等缺點(diǎn)。為了解決傳統(tǒng)生物處理技術(shù)存在的問(wèn)題，近年來(lái)采用固定化技術(shù)，通過(guò)一定的技術(shù)手段(如載體材料，包埋材料或合理控制水力條件)固定微生物。固定化微生物技術(shù)是利用物理或化學(xué)手段將微生物固定在載體上，使其高度致密并保持其生物活性，在適當(dāng)條件下也可擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模以滿足生物技術(shù)應(yīng)用的需要[6]。微生物固定化方法一般分為吸附法[7]、交聯(lián)法、包埋法[8]、介質(zhì)保留法和多種固定化組合方法如復(fù)合固定化方法[9]等。Pai等[10]研究了在高負(fù)荷條件下固定化微生物濾床對(duì)苯酚的降解，結(jié)果表明：與顆粒狀活性炭相比，以海藻酸鈣為載體的固定化活性炭顆粒對(duì)苯酚具有較高的降解率。周相林等[11]比較了游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞降解氰的某些特征，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)固定化后熱穩(wěn)定性明顯提高。因固定化微生物穩(wěn)定性高、重復(fù)利用性好，故固定化微生物技術(shù)有望成為處理含油廢水的新型高效方法。磁性載體又稱磁性微球或磁種，是由超順磁性納米粒子與高分子或其它無(wú)機(jī)材料復(fù)合形成的膠態(tài)顆粒。磁性微粒作為一種磁性載體在酶固定、細(xì)胞分離與固定、靶向載藥治療及核酸的純化與分離等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[12]。近幾年來(lái)，對(duì)于磁場(chǎng)效應(yīng)在廢水生物降解中的應(yīng)用研究有大量的報(bào)導(dǎo)。水經(jīng)磁化處理后，其物理與化學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，磁場(chǎng)的作用能提高微生物的生物活性，增加微生物對(duì)廢水有機(jī)污染物的吸附和利用能力，因而提高了污水生物凈化效果[13]。固定在磁性載體上的酶和微生物細(xì)胞存在較大的pH值和溫度范圍，且穩(wěn)定性更高。多種酶活生物細(xì)胞的共固定化也可以通過(guò)基于磁性載體的固定方法來(lái)完成[14]。磁分離技術(shù)可以使磁性載體與被吸附物質(zhì)更易分離，該吸附劑是由微生物、海藻酸鈉、聚乙烯醇和四氧化三鐵組成，該吸附劑在去除和回收廢水中的重金屬方面具有潛在價(jià)值[15]。本研究利用磁性載體和海藻酸鈉固定的酵母菌對(duì)精煉大豆油廢水進(jìn)行處理，并對(duì)廢水處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，以期為精煉大豆油廢水的生物處理提供新思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

發(fā)酵性絲孢酵母(TrichoporonfermantansCICC 1368)，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純。

為了實(shí)驗(yàn)的可控性和操作簡(jiǎn)便，本研究使用的廢水是根據(jù)取自吉林省某豆油生產(chǎn)加工廠的精煉大豆油廢水水質(zhì)分析結(jié)果而配制的模擬廢水。精煉大豆油原廢水和模擬廢水水質(zhì)分析情況見(jiàn)表1。

表1 精煉大豆油產(chǎn)生的廢水和模擬廢水水質(zhì)

571型COD測(cè)定儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；722型分光光度計(jì)，渡揚(yáng)精密儀器(上海)有限公司；D8Advance XRD衍射儀，廣州創(chuàng)儀欣儀器有限公司。

1.2 酵母菌的磁性載體固定化

1.2.1培養(yǎng)基的制備 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，作為液體種子培養(yǎng)基。在液體種子培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g/L作為固體培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基均在1×105Pa飽和蒸汽下滅菌20 min。

1.2.2菌種的保藏和活化 菌種保藏：從培養(yǎng)菌種的固體YPD中挑取單菌落，接種到裝有100 mL 液體YPD的250 mL搖瓶中，30 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)24 h；然后將菌種液保存于濃度為20%的甘油中，于-80 ℃下凍存。

菌種活化：從冰箱中取出保藏菌種，劃線接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基，30 ℃ 下恒溫培養(yǎng)24～48 h，為本研究提供酵母菌。

1.2.3磁性載體的制備 采用化學(xué)共沉淀法制備水溶性的磁性載體Fe3O4納米顆粒，具體步驟如下：用去離子水分別配制1.0 mol/L的FeCl2和1.75 mol/L的FeCl3水溶液各50 mL，加入到500 mL的三口瓶中，通入氮?dú)膺M(jìn)行保護(hù)，持續(xù)機(jī)械攪拌，當(dāng)水浴加熱至60 ℃時(shí)快速滴加氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%～28%)至pH值10～11，溶液由棕色變?yōu)楹谏纯?。再升溫?0 ℃恒溫保持1 h后室溫冷卻，用永久磁體將產(chǎn)物從溶液中分離，用蒸餾水反復(fù)洗至中性，在室溫下真空干燥24 h，制得Fe3O4納米顆粒。

1.2.4酵母菌的固定化 酵母菌懸液的配置：用接種環(huán)將固體培養(yǎng)基上發(fā)酵性絲孢酵母的一株單菌落接入到100 mL無(wú)菌的YPD中，在30 ℃ 搖床上以180 r/min培養(yǎng)1天，得到培養(yǎng)好的酵母菌懸液，存放在4 ℃ 冰箱中，備用。

海藻酸鈉固定化酵母菌：用100 mL蒸餾水加熱溶解10 g海藻酸鈉，將10 mL酵母菌懸液與100 mL配制好的海藻酸鈉溶液充分混合均勻，形成海藻酸鈉-酵母菌懸液[16]。然后稱取3.00 g無(wú)水氯化鈣，溶于150 mL蒸餾水中，配制成所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%)的氯化鈣溶液，將其置于設(shè)定溫度(20 ℃)的電子恒溫水浴鍋中，將100 mL海藻酸鈉-酵母菌懸液滴入150 mL氯化鈣溶液中造粒，并恒溫維持2 h，使酵母充分固定化。傾去上清液，用蒸餾水沖洗固定化酵母3次，然后重新置于150 mL 2%的氯化鈣溶液中平衡24 h后，懸液備用[16]。

磁性載體固定化酵母菌：取10 mL酵母菌懸液，加入5 g的磁性載體Fe3O4納米顆粒，于搖床中恒溫(30 ℃、 150 r/min)搖動(dòng)一定時(shí)間，懸液備用[17]。

1.3 精煉大豆油產(chǎn)生的廢水處理

本研究中所有廢水處理均在250 mL搖瓶中進(jìn)行，分別將適量酵母菌、磁性載體、海藻酸鈉固定化酵母菌和磁性載體固定化酵母菌與100 mL模擬廢水在溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min下培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)中分別考察了處理時(shí)間(0～48 h)對(duì)廢水水質(zhì)以及酵母菌生長(zhǎng)情況的影響，廢水的pH值(5.0～7.5)對(duì)廢水中酵母菌的生產(chǎn)情況以及酵母菌接種量(0～10%)對(duì)廢水的COD值的影響。

1.4 分析與測(cè)試

OD600的測(cè)定：利用可見(jiàn)分光光度計(jì)722型測(cè)量濕菌體在600 nm處的吸光度，以判斷酵母菌生長(zhǎng)情況。

廢水COD值的測(cè)定：由于COD測(cè)定儀的上限為150 mg/L，待測(cè)樣品需要用去離子水稀釋至適宜濃度。取2 mL稀釋后的待測(cè)樣品放入COD消解管中，加入3 mL重鉻酸鉀專(zhuān)用氧化劑，擰緊管帽將液體搖勻，將消解管放入消解裝置中，165 ℃消解10 min，冷卻至室溫，把消解結(jié)束后的樣品倒入石英比色皿中，放入COD測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)量。

XRD分析：對(duì)磁性載體的結(jié)構(gòu)組成采用XRD進(jìn)行定性分析。測(cè)量時(shí)稱取15～25 mg磁性載體置于樣品臺(tái)上，用蓋玻片和稱量紙壓平，擦去樣品臺(tái)表面多余的磁性載體粉末后放至衍射儀的上樣器上測(cè)量。衍射儀的發(fā)生器功率為40 kV，其射線源為Cu Kα射線，掃描范圍(2θ)為20～80°，掃描速度5 (°)/min，掃描步長(zhǎng)0.05°。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性載體的表征

采用化學(xué)共沉淀法制備的Fe3O4的XRD圖譜見(jiàn)圖1。可以看出，在2θ為18.2°、 30.0°、 35.4°、 43.0°、 56.9°及62.5°處均出現(xiàn)強(qiáng)衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于Fe3O4的(111)、(220)、(311)、(400)、(511)及(440)晶面，說(shuō)明所得的產(chǎn)物為立方晶系結(jié)構(gòu)的Fe3O4，即FeO(Fe2O3)。結(jié)合其衍射峰尖銳且半峰寬窄，證明所制備的Fe3O4結(jié)晶度高，具有尖晶石結(jié)構(gòu)，晶型好，無(wú)其他衍射峰存在。

圖1 四氧化三鐵納米晶體粒子的XRD圖譜Fig.1 XRD pattern of Fe3O4 nanocrystalline particles

2.2 精煉大豆油廢水的固定化酵母菌處理

2.2.1不同處理時(shí)間對(duì)廢水水質(zhì)的影響

2.2.1.1酵母菌處理廢水 酵母菌(1.2.4節(jié)酵母菌懸液)處理精煉大豆油廢水時(shí)，在接種量10%，其它條件同1.3節(jié)，不同處理時(shí)間對(duì)廢水pH值和COD值，以及酵母菌OD600值的影響情況見(jiàn)表2。

由表可以看出，隨著酵母菌處理時(shí)間的增加，廢水的pH值先減小后增加，在0～12 h范圍內(nèi)pH值的減小是因?yàn)榻湍妇谔幚砗蛷U水時(shí)產(chǎn)生了脂肪酸，而12 h后廢水pH值隨著廢水中脂肪酸被消耗逐漸增大，在36 h后保持穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，當(dāng)廢水中的菌體濃度較高時(shí)，發(fā)酵性絲孢酵母可以直接利用廢水中的物質(zhì)。酵母菌的OD600值隨處理時(shí)間增加呈上升趨勢(shì)，12 h之后酵母菌的OD600值迅速增大，這是因?yàn)榻湍妇@時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體的增長(zhǎng)量急速上升而導(dǎo)致酵母菌的OD600值增大。廢水的COD值在24～36 h急速下降，36 h時(shí)廢水的COD值為3 630 mg/L。一般來(lái)說(shuō)，COD值小于5 000 mg/L，就是理想的處理效果。可見(jiàn)這個(gè)時(shí)間段酵母菌對(duì)廢水處理的效果最好。

2.2.1.2磁性載體處理廢水 利用磁性載體對(duì)精煉大豆油廢水進(jìn)行處理時(shí)不考慮酵母的生長(zhǎng)情況(OD600值)。在1.3節(jié)條件下，5 g磁性載體處理精煉大豆油廢水時(shí)，不同處理時(shí)間對(duì)廢水pH值和COD值的影響情況見(jiàn)表2。

表2 處理時(shí)間對(duì)精煉大豆油廢水水質(zhì)的影響

由表可以看出，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值變化不大。這是因?yàn)榻湍妇纳L(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生脂肪酸從而導(dǎo)致廢水的pH值發(fā)生大幅度變化，而磁性載體處理廢水過(guò)程中無(wú)酵母菌參與，因此，廢水的pH值變化不大。通過(guò)分析COD值可知：0～24 h磁性載體對(duì)廢水的處理幾乎沒(méi)有效果，而24～36 h廢水的COD值急速下降，這是因?yàn)樵诖藭r(shí)間段內(nèi)，由于攪拌作用，磁性載體經(jīng)過(guò)一段時(shí)間搖瓶振動(dòng)混合，對(duì)廢水中的物質(zhì)有一定吸附能力，經(jīng)磁性載體處理36 h，廢水的COD值為6 530 mg/L。

2.2.1.3固定化酵母菌處理廢水 按照1.3節(jié)操作，不同處理時(shí)間下，接種量10%的海藻酸鈉固定化酵母菌和磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水的結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 固定化酵母菌處理對(duì)精煉大豆油廢水水質(zhì)的影響

由表可看出, 不管是海藻酸鈉固定化酵母菌處理還是磁性載體固定化酵母菌處理，廢水的pH值均隨著酵母菌處理時(shí)間的增加先減小后增加。0～12 h廢水的pH值減小，這是因?yàn)榻湍妇诖穗A段處理含油廢水時(shí)產(chǎn)生了脂肪酸。而12 h后pH值逐漸上升，在36 h后保持穩(wěn)定，這是因?yàn)樵撾A段酵母菌的生長(zhǎng)量急劇上升，會(huì)消耗脂肪酸，當(dāng)菌體生長(zhǎng)量一定時(shí)，pH值變化緩慢。由此可見(jiàn)，初始菌體濃度較高時(shí)，發(fā)酵性絲孢酵母可以直接利用廢水中的物質(zhì)。酵母菌的OD600值變化在0～24 h增長(zhǎng)速度較為緩慢，24 h之后迅速增長(zhǎng)。這是因?yàn)?4 h屬于酵母菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體的增長(zhǎng)量急速上升，從而導(dǎo)致OD600值的迅速變大。而廢水的COD值，經(jīng)過(guò)海藻酸鈉固定化酵母菌處理的廢水，在0～36 h，由于酵母菌對(duì)廢水的降解能力稍微緩慢，COD值變化不大，而在36～48 h，廢水的COD值急速下降，48 h時(shí)COD值為4 580 mg/L。而經(jīng)過(guò)磁性載體固定化酵母菌處理的廢水，在0～24 h，由于酵母菌對(duì)廢水的降解能力稍微緩慢，COD值變化不大；在24～36 h，廢水的COD值急速下降，36 h時(shí)COD值為2 430 mg/L。由此可見(jiàn)，相同條件下磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水效果最佳，且合適的處理時(shí)間為36 h。

2.2.2不同pH值對(duì)廢水水質(zhì)的影響 由于酵母的生長(zhǎng)與廢水的pH值密切相關(guān)，因此本節(jié)主要考察pH值對(duì)酵母菌OD600值的影響。在1.3節(jié)條件下，接種量10%的酵母菌和固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水的結(jié)果見(jiàn)圖2。

a.酵母菌處理treated by yeast; b.海藻酸鈉固定化酵母菌處理treated by sodium alginate immobilized yeast;

由圖2(a)可以看出，無(wú)論廢水pH值如何變化，酵母菌的OD600值總是隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增大。在pH值為5.0和5.5時(shí)，處理12 h的廢水中的酵母菌的OD600值較大，但是處理24和36 h時(shí)的廢水中的酵母菌的OD600值均小于pH值為6.0時(shí)的酵母菌的OD600值。且隨著pH值的增加，12 h的OD600值是逐漸減小的，也就是說(shuō)酵母菌生長(zhǎng)前期廢水的pH值越高，會(huì)影響酵母的正常生長(zhǎng)；而24和36 h的OD600值先略有增大而后減小，這是因?yàn)樵诮湍傅纳L(zhǎng)中期和生長(zhǎng)末期，過(guò)小和過(guò)大的pH值都會(huì)影響酵母的正常生長(zhǎng)。pH值為6.0時(shí)，廢水處理12、 24和36 h時(shí)，廢水中的酵母菌的OD600值較高，分別為5.88、 13.74和19.20，可見(jiàn)絲孢酵母菌適合在此pH值下生長(zhǎng)。

由圖2(b)可以看出，經(jīng)海藻酸鈉固定化酵母菌處理12和24 h的廢水中的酵母菌，在pH值大于6.5或小于6.0時(shí)的生長(zhǎng)情況都要優(yōu)于pH值為6.0～6.5，但是處理36 h的廢水中的酵母菌的OD600值卻是先增大后減小。這是因?yàn)榻湍妇?jīng)過(guò)海藻酸鈉固定化后生長(zhǎng)性質(zhì)發(fā)生了變化。由此可見(jiàn)，對(duì)于海藻酸鈉固定化酵母菌，在其生長(zhǎng)前期，廢水呈弱酸性會(huì)影響12和24 h的酵母菌的正常生長(zhǎng)，而在酵母菌的生長(zhǎng)初期和生長(zhǎng)中期，廢水呈酸性或者堿性，則對(duì)36 h的酵母菌的正常生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。由此可見(jiàn)，海藻酸鈉固定化酵母菌處理36 h的廢水中，酵母菌在pH值5.5時(shí)生長(zhǎng)量最大，OD600值為19.12。

由圖2(c)可以看出，經(jīng)磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水中的酵母菌，隨著pH值的增加，12 h的酵母菌的OD600值是波動(dòng)變化的，也就是說(shuō)生長(zhǎng)前期廢水的pH值變化對(duì)酵母的正常生長(zhǎng)影響較??；而24和36 h的酵母菌的OD600值，變化總趨勢(shì)是先增大后減小，即在酵母的生長(zhǎng)中期和生長(zhǎng)末期，過(guò)小和過(guò)大的pH值都會(huì)影響酵母菌的正常生長(zhǎng)。pH值6.0比較適合磁性載體固定化酵母菌的生長(zhǎng)，12、 24和36 h的酵母菌的OD600值分別為5.14、 10.25和19.78。

綜上，處理精煉大豆油廢水36 h時(shí)，廢水中磁性載體固定化酵母菌的OD600值最高，達(dá)到19.78，而發(fā)酵性絲孢酵母和海藻酸鈉固定化酵母菌的OD600值分別為19.20和19.12。

2.2.3不同接種量對(duì)廢水水質(zhì)的影響 由于廢水的處理效果與酵母菌的接種量密切相關(guān)，因此本節(jié)主要考察酵母菌接種量對(duì)廢水COD值的影響。

在1.3節(jié)條件下，酵母菌和固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水(pH值6)時(shí)，接種量對(duì)廢水COD值的影響情況見(jiàn)圖3。

a.酵母菌處理treated by yeast; b.海藻酸鈉固定化酵母菌處理treated by sodium alginate immobilized yeast;

由圖3(a)可知,酵母菌接種量大于4%時(shí)，廢水的COD值隨著處理時(shí)間的增加，出現(xiàn)先減小后增加的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大，影響酵母處理廢水的效果。而當(dāng)接種量為4%，經(jīng)酵母菌處理的廢水COD值隨時(shí)間增大而減小，處理時(shí)間為36 h時(shí)，COD值最小，為3 630 mg/L。

由圖3(b)可知, 廢水COD值隨著海藻酸鈉固定化酵母菌接種量的增加發(fā)生變化。接種量為4%和6%時(shí)，廢水的COD值隨著處理時(shí)間的增加均為先減小后增加。接種量為8%時(shí)，廢水的COD值雖然隨著處理時(shí)間的增加逐漸減小，但是COD值仍然較大，廢水處理效果不佳。而當(dāng)接種量為10%、處理時(shí)間為12 h時(shí)，廢水的COD值最小，為4 580 mg/L。

由圖3(c)可知, 磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水時(shí)，廢水COD值隨著接種量的增加，除處理時(shí)間12 h的之外，24和36 h的均整體呈下降趨勢(shì)。接種量為8%時(shí)，精煉大豆油廢水的COD值隨處理時(shí)間的增加逐漸減小，處理36 h的廢水COD值為9 840 mg/L，但是仍然較大，廢水處理效果不佳。當(dāng)接種量為10%、處理時(shí)間為36 h時(shí)，磁性載體固定化后的酵母菌對(duì)廢水的處理效果最好，廢水COD值最小，為2 430 mg/L。

綜上，通過(guò)對(duì)比分析可知，相同條件下磁性載體固定化酵母菌處理精煉大豆油廢水的COD值最佳。

3 結(jié) 論

3.1 先采用化學(xué)共沉淀法制備四氧化三鐵納米磁性材料，再對(duì)酵母菌進(jìn)行固定化，并用磁性載體固定化酵母菌對(duì)精煉大豆油廢水進(jìn)行處理，并與海藻酸鈉固定化酵母菌和絲孢酵母菌處理廢水結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示：在相同條件下，酵母菌、磁性載體、海藻酸鈉固定化酵母菌和磁性載體固定化酵母菌4種物質(zhì)中，磁性載體固定化酵母菌對(duì)精煉大豆油廢水處理36 h時(shí)效果最佳。廢水中酵母菌的生長(zhǎng)量最大，OD600值為19.12。pH值6.0比較適合磁性載體固定化酵母菌的生長(zhǎng)，處理36 h的廢水中的酵母菌的OD600值為19.78。

3.2 磁性載體固定化酵母菌對(duì)精煉大豆油廢水進(jìn)行處理的較優(yōu)條件為pH值6.0，處理時(shí)間36 h，接種量10%。此條件下，廢水的COD值為2 430 mg/L。