何江波，王 瑩，康大偉，牛燕芬，王紀(jì)愛，陳 秀，畢曉旭，欒 杰，曹艷茹**

(1.昆明學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省疾病預(yù)防控制中心 理化檢測中心，云南 昆明 650022)

特殊生境的微生物具有較高的創(chuàng)造能力，可以產(chǎn)生多種多樣結(jié)構(gòu)新穎的活性成分，這些活性化學(xué)物質(zhì)可以成為研究藥物的先導(dǎo)化合物，有的甚至可以成為生物農(nóng)藥[1].在特殊生境微生物的研究中，鏈霉菌研究受到廣大學(xué)者的較高關(guān)注.鏈霉菌屬于好氧革蘭氏陽性菌，廣泛分布于土壤、海洋、極端環(huán)境和一些生物體內(nèi)[2-5].鏈霉菌基因組特有的生物合成基因簇，可以產(chǎn)生具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物被應(yīng)用于抗病毒、抗真菌、抗腫瘤藥物開發(fā)等[6].李惠玲等[7]從海洋鏈霉菌Streptomycessp.S598的次生代謝產(chǎn)物中分離得到抗菌活性物質(zhì)纈氨霉素，對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制活性.在現(xiàn)代農(nóng)用抗生素開發(fā)方面，鏈霉菌也具有較大的優(yōu)勢，李萍等[8]從黃抗霉素鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物中分離得到一種殺線蟲活性化合物TDD，該化合物對線蟲48 h的致死率為40%.國產(chǎn)的殺稻瘟菌素就是從有色產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces griseochromogenes）的代謝產(chǎn)物中分離得到[9].因此鏈霉菌是一類應(yīng)用前景廣闊的微生物資源，研究鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物，對挖掘藥物資源具有重要的意義.

本課題組一直從事微生物資源開發(fā)，Streptomyces plumbidurans[10]是我們從昆明東川銅礦中分離得到，并經(jīng)16S rRNA基因鑒定為鏈霉菌（GenBank號：MW526995）.為深入研究該菌，尋找可利用的天然產(chǎn)物，我們采用PDB培養(yǎng)基發(fā)酵該菌，對發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，然后采用乙酸乙酯萃取，并對乙酸乙酯部分進(jìn)行系統(tǒng)分離與化學(xué)成分鑒定.從中分離得到3個新脂肪酰胺類化合物，分別命名為kcacylamide A～C （1～3） （圖1）.我們對化合物1～3進(jìn)行體外抗腫瘤活性和體外抑菌活性評價，3個化合物在50 μmol/L濃度下均無明顯的抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞 （HCT116）、人宮頸癌細(xì)胞 （Hela）、肝癌細(xì)胞 （LM-3）腫瘤細(xì)胞生長活性和抑制大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）以及枯草芽孢桿菌（ATCC6051）活性.本文主要報道Streptomyces plumbidurans代謝產(chǎn)物中的3個脂肪酰胺類化合物分離鑒定及初步活性篩選結(jié)果.

圖1 化合物1～3的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1～3

1 材料與方法

1.1 材料菌株鑒定：自云南昆明東川銅礦中分離，16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明KC 17012為鏈霉菌屬（Streptomyces）菌株, GenBank號：MW526995.菌種目前保存于昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院菌種庫（編號為KC 17012）.

Streptomyces plumbidurans活化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，土豆 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL，微量鹽 1 mL，121 ℃，滅菌30 min.

Streptomyces plumbidurans發(fā)酵培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基，土豆200 g，葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，微量鹽1 mL，121 ℃，滅菌 30 min.

指示菌培養(yǎng)基：LB 固體培養(yǎng)基，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL.

1.2 菌株活化與種子液的培養(yǎng)將保存于4 ℃的菌株Streptomyces plumbidurans接種于PDA平板，28 ℃培養(yǎng)7 d以進(jìn)行活化.然后將單菌落接種至改良ISP 2培養(yǎng)基 （1 L）：恒溫?fù)u床28 ℃，180 r/min，培養(yǎng) 3 d，作為種子液.

1.3 菌株發(fā)酵將種子液接種至PDB培養(yǎng)基25 L，培養(yǎng)8 d，28 ℃，180 r/min，發(fā)酵液采用紗布過濾，收集濾液，得發(fā)酵液25 L，然后將發(fā)酵液減壓濃縮至2 L.

1.4 儀器與試劑質(zhì)譜儀（美國Agilent 6500系列Q-TOF LC/MS）；核 磁 共 振 儀（Avance 600 MHz，TMS作為內(nèi)標(biāo)）；萬分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；搖床（上海智城分析儀器制造有限公司，ZWY-2102）；柱色譜用硅膠、薄層色譜用硅膠GF254（青島海洋化工廠有限公司）；Sephadex LH-20（美國GE公司）； D101大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；色譜試劑（上海星可高純度試劑公司）；石油醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有機溶劑均為工業(yè)純，經(jīng)重蒸后使用.顯色劑為H2SO4（10%）的乙醇溶液.

1.5 發(fā)酵代謝產(chǎn)物的提取與分離發(fā)酵液濃縮液采用等體積的乙酸乙酯萃取3次，濃縮萃取液，得乙酸乙酯浸膏43 g.將乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，過濾，除去不溶物，然后采用D101大孔樹脂柱（φ80 mm×500 mm）初步分離，洗脫劑為10%～100%乙醇水梯度洗脫；根據(jù)薄層色譜（TLC），10%濃硫酸乙醇溶液顯色合并相似成分，得6個組分Fr A～F.

Fr A組分（1.3 g），經(jīng)Sephadex LH-20柱（MeOH）純化，根據(jù)TLC合并相似組分，得到Fr A 1～3.Fr A-2（132 mg）部分，采用硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚-丙酮（體積比20∶1～3∶1），得到化合物1（11 mg）和化合物2（6 mg）.FrA-3（78 mg） 部分結(jié)晶后的母液，通過硅膠柱色譜分離，洗脫劑為石油醚-丙酮（體積比15∶1～3∶1），得到化合物3（2.8 mg）.

1.6 體外抗腫瘤和抑菌活性評價

1.6.1 體外抗腫瘤細(xì)胞毒活性 實驗采用MTT法檢測人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、肝癌細(xì)胞（LM-3）存活率，按照使用說明書用MTT [3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法檢測細(xì)胞存活率.全自動酶標(biāo)儀（波長570 nm）測定各孔OD值（A）；空白對照加等體積DMSO處理，以紫杉醇為陽性對照藥（4 μmol/L），每組重復(fù)3個復(fù)孔.將A值作為反映細(xì)胞活性及代謝狀況的參數(shù)，各實驗重復(fù)3次，抑制率按公式進(jìn)行計算.

1.6.2 體外抑菌實驗 采用微量稀釋法檢測化合物的體外抑菌活性.分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及枯草芽孢桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落2～3個于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)6 h，用LB液體培養(yǎng)基稀釋成1×105CFU/mL菌懸液.稱取適量的化合物1～3，用DMSO配制成100 μmol/L的儲存液，并用0.22 μm微孔濾膜過濾.取無菌的96孔板，外周36孔分別加入100 μL無菌水，其余每孔加入100 μL 1×105CFU/mL菌懸液.同時，選取環(huán)丙沙星作為陽性對照，DMSO作空白對照，且每個梯度設(shè)3個復(fù)孔，微板觀察法檢測其最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）值.

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定無色油狀物，易溶于甲醇、氯仿.HR-ESI-MS顯示分子式為C10H15NO3（m/z198.112 0 [M+H]+，計算值為 C10H15NO3[M+H]+198.112 5），不飽和度為4.化合物1的1H NMR譜（表1）顯示含有2個含氧的次甲基氫[δH4.07（t，J=5.4 Hz，H-6），3.95（t，J=6.0 Hz，H-7）]，6個烯氫[δH6.02（d，J=14.4 Hz，H-2），7.17（dd，J=15.0，11.4 Hz，H-3），6.41（dd，J=15.6，11.4 Hz，H-4），6.16（dd，J=15.6，6.0 Hz，H-5），5.52（ddd，J=15.6，7.2，1.8 Hz，H-8），5.72 （1H，dq，J=15.0，6.6 Hz，H-9）]，根據(jù)耦合常數(shù)確定3個雙鍵為E式，1個甲基信號[δH1.71，d，J=6.6 Hz，H-10]，共10個 氫 信 號.13C NMR和DEPT譜顯示該化合物有10個碳信號（表1），包括1個酮羰基[δc171.2]，2個次甲基的碳信號[δc76.7，76.0]，1個甲基信號[δc18.0]，其余為雙鍵碳信號，因此由3個雙鍵和1個羰基構(gòu)成該化合物的4個不飽和度，推測該化合物為鏈狀不飽和脂肪酰胺.根據(jù)1H-1H COSY相關(guān)，我們可以得到H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9/H-10相關(guān)（圖2）.二維HMBC圖譜給出H-10與C-9，C-8相關(guān)，H-8與C-7，C-9相關(guān)，H-5與C-6，C-4相關(guān)，H-2與C-1，C-3相關(guān).由此確定化合物1的平面結(jié)構(gòu)，因該類成分為長鏈化合物，故未鑒定其絕對構(gòu)型，因此本文報道其平面結(jié)構(gòu)為（2E，4E，8E）6，7-二羥基-癸酸酰胺，并命名為kcacylamide A.

2.2 化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定無色油狀物，易溶于甲醇、氯仿.HR-ESI-MS顯示分子式為C10H15NO3（m/z198.112 2 [M+H]+，計算值為 C10H15NO3[M+H]+198.112 5），不飽和度為4.化合物2的1H NMR譜（表1）顯示含有2個含氧的次甲基氫[δH4.67（t，J=6.0 Hz，H-6），4.25（t，J=5.1 Hz，H-9）]，6個烯氫[δH6.04（d，J=15.0 Hz，H-2），7.16（dd，J=15.0，10.8 Hz，H-3），6.38（dd，J=15.0，11.4 Hz，H-4），6.09（dd，J=15.6，6.0 Hz，H-5），5.65（dd，J=15.6，6.0 Hz，H-7），5.74（dd，J=15.6，6.0 Hz，H-8）]，根據(jù)耦合常數(shù)確定3個雙鍵為E式，1個甲基信號[δH1.22，d，J=6.6 Hz，H-10]，共10個氫信號.13C NMR和DEPT譜顯示該化合物有10個碳信號（表1），包括1個酮羰基[δc171.2]，2個次甲基的碳信號[δc76.7，76.0]，1個甲基信號[δc18.0]，其余為雙鍵碳信號，因此由3個雙鍵和1個羰基構(gòu)成該化合物的4個不飽和度，推測該化合物為化合物1的類似物.根據(jù)1H-1H COSY和HMBC圖譜推測該化合物的平面結(jié)構(gòu)（圖2），為（2E，4E，7E）6，9-二 羥 基-癸 酸 酰 胺，并 命 名 為kcacylamide B.

表1 化合物1～3的1H NMR（600 MHz）和13C NMR（150 MHz） 數(shù)據(jù)Tab.1 1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) data of compounds 1-3

圖2 化合物1～3的重要1H-1H COSY和HMBC相關(guān)Fig.2 The key 1H-1H COSY and HMBC of compounds 1-3

2.3 化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定無色油狀物，易溶于甲醇、氯仿.HR-ESI-MS顯示分子式為C10H17NO3（m/z200.127 8 [M+H]+，計算值為 C10H17NO3[M+H]+200.128 1），不飽和度為3.化合物3的1H NMR譜（表1）顯示含有2個含氧的次甲基氫[δH4.02（t，J=6.0 Hz，H-6），3.51（m，H-7）]，4個烯氫[δH6.02（d，J=15.6 Hz，H-2），7.20（dd，J=15.0，10.8 Hz，H-3），6.43（dd，J=15.6，11.4 Hz，H-4），6.24（dd，J=15.6，6.6 Hz，H-5）]，根據(jù)耦合常數(shù)確定3個雙鍵為E式，1個甲基信號[δH1.71，d，J=6.6 Hz，H-10]，共10個氫信號.13C NMR 和DEPT 譜顯示該化合物有10個碳信號（表1），包括1個酮羰基[δc171.2]，2個次甲基的碳信號[δc76.7，76.0]，1個甲基信號[δc18.0]，其余為雙鍵碳信號，因此由3個雙鍵和1個羰基構(gòu)成該化合物的4個不飽和度，推測該化合物為鏈狀不飽和脂肪酰胺.根據(jù)1H-1H COSY相關(guān)，我們可以得到H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9/H-10相關(guān)（圖2）.二維HMBC圖譜給出H-10與C-9，C-8相關(guān)，H-8與C-7，C-9相關(guān)，H-5與C-6，C-4相關(guān)，H-2與C-1，C-3相關(guān).由此確定化合物3的平面結(jié)構(gòu)，為（2E，4E，8E）6，7-二羥基-癸酸酰胺，并命名為kcacylamide C.

2.4 活 性 鑒 定 結(jié) 果通 過MTT法 檢 測 化 合 物1～3的體外抗腫瘤活性，檢測人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）、肝癌細(xì)胞（LM-3）存活率；采用微板觀察法檢測枯草桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）MIC值（陽性對照環(huán)丙沙星MIC為2 μmol/L），結(jié)果顯示3個化合物在50 μmol/L濃度下均無顯著的抗腫瘤細(xì)胞毒活性及抑菌活性.

3 討論與結(jié)論

在普通微生物研究達(dá)到一定程度后，越來越多的研究者們將研究目標(biāo)鎖定在特殊環(huán)境微生物，例如：海洋微生物、高溫溫泉微生物、內(nèi)生菌等.這些特殊環(huán)境微生物具有產(chǎn)生豐富代謝產(chǎn)物的潛力，可以利用其次級代謝產(chǎn)物開發(fā)創(chuàng)新型殺菌劑、新藥等.鏈霉菌本身就是一個具有較高代謝能力的菌株，國內(nèi)外較多學(xué)者均在不遺余力地深入挖掘該類菌株.Streptomyces plumbidurans自云南昆明東川銅礦中分離，采用PDB培養(yǎng)基發(fā)酵得到次生代謝產(chǎn)物.采用高效液相檢測發(fā)現(xiàn)，該菌的代謝產(chǎn)物較為豐富，而且較為復(fù)雜.于是我們在沒有優(yōu)化培養(yǎng)基的條件下進(jìn)行該菌株的大規(guī)模發(fā)酵，采用經(jīng)典的植物化學(xué)分離鑒定方法，對其發(fā)酵液進(jìn)行研究，獲得3個新的脂肪酰胺類成分.關(guān)于該類成分的研究報道較少，我們利用目前實驗室現(xiàn)有的活性篩選平臺，對其進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞毒和抑菌活性篩選，目前暫時沒有發(fā)現(xiàn)以上3個新成分具有顯著的生理活性，因此我們將繼續(xù)開發(fā)其他方面的生理活性.脂肪酰胺類成分在鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物中被報道較少，2019年Hou等[11]從海洋鏈霉菌Strptomyces youssoufiensis的基因突變體的分離得到一個新的脂肪酰胺類化合物.土壤來源的鏈霉菌Strptomyces maoxianensis中曾報道分離得到2個新的脂肪酰胺類成分，通過細(xì)胞毒測試發(fā)現(xiàn)化合物1和2存在較弱的抗人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2和白血病K562細(xì)胞的活性[12].關(guān)于這類成分的活性研究報道，C20長鏈脂肪酰胺具有類似大麻素的生理活性，具有開發(fā)成抗抑郁和抗焦慮藥物的潛力[13].同時還認(rèn)為脂肪酰胺雖然結(jié)構(gòu)較為簡單，但是卻是一類重要的信號分子，影響我們的痛覺、炎癥、睡眠等重要的生理功能[14].由此可見，對于該菌的開發(fā)，還可以進(jìn)一步深入研究，通過優(yōu)化培養(yǎng)基以提高代謝產(chǎn)物的多樣性，為先導(dǎo)化合物的開發(fā)提供資源.

本文從東川銅礦中分離得到一株Streptomyces plumbidurans，采用PDB培養(yǎng)基發(fā)酵該菌，并研究其次生代謝產(chǎn)物，從中分離得到3個全新的脂肪酰胺類化合物，并利用核磁、質(zhì)譜、紅外光譜等確定其平面結(jié)構(gòu).對3個新化合物進(jìn)行了初步的抗腫瘤細(xì)胞毒活性測試和抗菌活性測試，為深入研究該菌的次生代謝產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ).