李秋樺，尹 敏，裴 妍，陳 秀，任 禛**，夏體淵，徐勝光

(1.昆明學院 農(nóng)學與生命科學學院 云南省高校生物炭工程研究中心，云南 昆明 650214；2.云南大學 醫(yī)學院，云南 昆明 650091；3.昆明學院 醫(yī)學院，云南 昆明 650214)

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）為球囊菌亞門，是土壤中生物量最大、作用最顯著的有益真菌，可以侵染80%以上的陸生植物[1]，對植物的生長生理、營養(yǎng)吸收以及土壤生態(tài)系統(tǒng)的調節(jié)具有重要作用[2].AMF群落多樣性及物種組成受多種因素影響，宿主、地理位置以及環(huán)境因子等都會使AMF類型發(fā)生變化[3].董甜等[4]對長白山4種赤楊根際AMF群落多樣性進行探究發(fā)現(xiàn)，不同品種赤楊根內AMF具有一定的宿主專一性，在4個品種中AMF多樣性存在差異.曹敏等[5]發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)不同種植基地的茅蒼術根際AMF群落結構不同.蔡曉布等[6]發(fā)現(xiàn)土壤活性有機碳含量會顯著影響植物AMF的發(fā)育、分布與侵染.目前關于病原菌侵染對植物AMF群落多樣性的影響鮮有報道.AMF在植物抗病方面具有巨大潛力，在植物根際與病原菌競爭生態(tài)位點是其提高植物對土傳病害抗性的重要機制之一[7]，然而土傳病害的存在有可能影響AMF對宿主的侵染，進而影響AMF對植物的功能作用.進一步探明AMF-植株-土傳病害間的相互關系，可為AMF在緩解植物土傳病害方面的應用奠定基礎.煙草（Nicotiana tabacumL.）是茄科煙屬植物，在經(jīng)濟作物中占有重要地位.AMF可與煙草建立互惠共生體[8]，其在煙草生長生理方面具有積極作用，同時部分AMF可以緩解煙草病害.Subhashini等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AMF可以與腐霉屬產(chǎn)生競爭關系，占據(jù)侵染位點，從而提高煙草抗病能力.劉先良等[10]在煙草中分別接種兩類AMF菌劑（Glomus intraradices和Glomus mosseae），結果發(fā)現(xiàn)兩種菌劑均可緩解煙草青枯病的發(fā)生.Giovannetti等[11]對煙草根腐病研究發(fā)現(xiàn)，接種Glomus monosporum后可以提高煙草對根腐病的抵抗能力，因此AMF在煙草抗病方面具有積極作用.目前AMF在農(nóng)作物中的抗病應用仍處于起步階段，尚未突破對其大規(guī)模純培養(yǎng)的技術難題，同時AMF的防病效果會受到pH、溫濕度以及土壤養(yǎng)分狀況等因素條件的影響，且在生產(chǎn)中這些條件難以控制，這些因素極大地限制了AMF在農(nóng)作物抗病方面的開發(fā)與利用[12-13].寄生疫霉（Phytophthora nicotianae）是誘發(fā)煙草黑脛病的主要土傳病害，其病原菌可以通過厚垣孢子和休眠菌絲在發(fā)病區(qū)域長期存在，并且依靠土壤和病殘體進行傳播，危害嚴重且難以根治[14].鑒于AMF在土傳病害防治方面的作用，探究煙株根內AMF-土傳病害-根際土壤間的相互作用具有重要意義.研究以云南煙草主栽品種K326和云煙87作為研究對象，對兩個品種健康與患黑脛病煙株根內AMF侵染特征進行探究，分析感染黑脛病對煙株根內AMF侵染率和群落多樣性的影響，為進一步摸清AMF與煙株共生關系建立的影響因素奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 樣本采集樣本采集時間為2020年8月，供試煙草品種為K326和云煙87，由云南省煙草公司紅河州分公司橄欖坡煙草綠色防控示范基地提供，該地區(qū)海拔約1 451 m，地理坐標為103°27′34″E，24°22′35″N，種植K326和云煙87的煙田之間距離約200 m.在K326煙田（病情指數(shù)約為38.86%）中隨機選擇3株健康煙株和3株患黑脛病煙株，健康與患黑脛病煙株如圖1所示，重復煙株間距離5～10 m.取出完整煙株后，立刻帶回實驗室，對煙株根及根際土壤進行采集，首先將附著在根的根際土壤抖落至密封袋中保存?zhèn)溆茫髮熤旮窟M行清洗，保存?zhèn)溆?健康煙株（K326-JK）標記為K326-JK-1、K326-JK-2和K326-JK-3；患病煙株(K326-B)標記為K326-B-1、K326-B-2和K326-B-3；云煙87（病情指數(shù)約為42.67%）根系和根際土壤取樣方法同K326，健康煙株（Y87-JK）標記為Y87-JK-1、Y87-JK-2和Y87-JK-3；患病煙株（Y87-B）標記為Y87-B-1、Y87-B-2和Y87-B-3.樣品存放于-80 ℃?zhèn)溆?

圖1 健康與患黑脛病煙株Fig.1 Health and black shank tobacco

1.2 土壤理化性質檢測對樣品土壤進行理化性質的監(jiān)測：pH值采用pH計進行測定；有機質測定采用重鉻酸鉀法；土壤全氮測定采用凱氏定氮法；堿解氮測定采用堿解擴散法；土壤全磷測定采用高氯酸-硫酸法；速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；土壤全鉀測定采用堿溶-原子吸收分光光度計法；速效鉀測定采用乙酸銨-火焰光度計法.

1.3 菌根侵染狀況和土壤孢子密度測定菌根侵染狀況采用Koske等[15]的方法進行檢測，將煙株根部剪成1 cm的根段放入試管中，加入2.5%的KOH，煮沸1 h后倒掉堿液加10% H2O2漂白30 min，自來水沖洗后加1%鹽酸酸化1 h，之后加入0.05%的曲利苯藍在90 ℃水浴20 min.取出浸泡于乳酸甘油中脫色12 h，取出根段制片鏡檢.將數(shù)據(jù)輸入Mycocalc軟件，對菌根侵染數(shù)據(jù)進行計算.土壤孢子密度測定采用濕篩-傾析法和蔗糖離心法進行分離，在解剖鏡下觀察統(tǒng)計.

1.4 根部樣品測序稱取煙草根部樣品各2 g，用75%乙醇滅菌1 min后浸泡在3% NaClO中消毒2 min，最后用去離子水洗干凈，置于無菌研缽中，加入適量液氮，研磨成粉末.采用CTAB法[16]對煙草根部總DNA進行提??；運用巢式PCR擴增AMF 18S rRNA基因部分片段，PCR反應采用1×T3 Super PCR Mix（擎科生物），按照說明書對樣品及引物進行添加，反應體系為25 μL，第1輪引物為AML1（5′-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3′）和AML2（5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′），第2輪引物為AMV4-5NF（5′-AAGCTCGTAGT TGAATTTCG-3′）和AMDGR（5′-CCCAACTATCCC TATTAATCAT-3′），PCR擴增程序均為95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min.擴增產(chǎn)物送至美吉生物公司進行Illumina Miseq高通量二代測序；并根據(jù)測序結果進行分析.

1.5 數(shù)據(jù)處理使用fastp軟件對原始測序序列進行質控，并應用FLASH軟件進行拼接；使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體，并選取每個中最長的OTU序列作為代表序列；利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對maarjam081/AM數(shù)據(jù)庫，設置比對閾值為70%；利用Mothur（version v.1.30）軟件計算樣品α多樣性指數(shù)；偏最小二乘法判別分析應用R語言mixOmics包中plsda分析和作圖；Venn圖使用R語言工具統(tǒng)計和作圖；使用Excel 2003軟件對各分類單元數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析；應用Canoco 4.5軟件對實驗結果進行RDA分析.

1.6 序列登錄K326-JK-1、K326-JK-2、K326-JK-3、K326-B-1、K326-B-2、K326-B-3、Y87-JK-1、Y87-JK-2、Y87-JK-3、Y87-B-1、Y87-B-2和Y87-B-3上傳在NCBI SRA數(shù)據(jù)庫中的登錄號分別為SRR13091087、 SRR13091086、 SRR13091083、SRR13091082、 SRR13091081、 SRR13091080、SRR13091079、 SRR13091078、 SRR13091077、SRR13091076、SRR13091085、SRR13091084.

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質煙株土壤理化性質分析見表1.整體來看，兩個煙草品種根際土壤pH值均呈酸性，其中K326健康土壤酸性最強，達到5.41.各煙草品種根際土壤有機質含量為中等水平，而云煙87患病樣品中的含量更為豐富.所有樣品根際土壤的全氮質量比差異不顯著，但K326患病土壤樣品的堿解氮質量比最高，顯著高于其它樣品.土壤磷質量比結果表明，K326健康樣品質量比最高，并顯著高于云煙87患病樣品；K326健康樣品根際土壤鉀質量比亦最高，其全鉀質量比顯著高于其它樣品.

分析健康與患病樣品根際土壤間理化性質差異，從根際土壤的全磷和速效磷質量比的結果可以看出(表1)，兩個煙草品種患病樣品均明顯低于健康樣品，其中云煙87患病樣品中全磷質量比顯著低于健康樣品，表明感染黑脛病可降低煙草根際土壤磷質量比.此外，K326患病樣品土壤堿解氮質量比顯著高于健康樣品，但其全鉀和速效鉀含量均顯著低于健康樣品，而云煙87患病煙草根際土壤pH值和全鉀質量比均顯著高于健康樣品，可見感染黑脛病對土壤全鉀質量比的影響與煙草品種相關.

2.2 煙草根內AMF侵染狀況及土壤孢子密度對煙株根部內生菌根的侵染狀況進行檢測，可以發(fā)現(xiàn)兩個品種健康和患病煙株根內均存在AMF的侵染（表2），侵染率均達到70%以上.其中K326健康煙株侵染率最高，達到82.22%；云煙87患病煙株侵染率最低，僅為70%.整體來看，兩個煙草品種健康和感病植株根內間菌根侵染率、侵染強度和叢枝豐富度均無顯著差異，但患病煙草樣品AMF的侵染狀況低于健康煙草樣品.此外，孢子密度結果表明（表2），K326和云煙87健康樣品孢子密度均高于患病樣品，此變化趨勢與菌根侵染狀況結果相一致.根據(jù)結果可以推測，由于病原菌與AMF在煙株根內和根際土壤中競爭生態(tài)位點，影響到煙株根際土壤AMF孢子的單位量，進而降低其對煙株根內的侵染.K326和云煙87健康及患病植株根系內AMF的侵染水平均未達到顯著水平，可能是因為在病原菌侵染之前，AMF對煙株根系的侵染已達到較高水平，占據(jù)了穩(wěn)定的生態(tài)位，導致后面病原菌侵染對根內AMF的變化影響較小.

表1 K326、云煙87健康和患病樣品根際土壤理化性質Tab.1 Physicochemical properties of rhizosphere soil from healthy and diseased samples of K326 and Yunyan87

表2 K326和云煙87健康和患病樣品AMF侵染率與孢子密度Tab.2 Colonization rate and spore density of AMF from healthy and diseased samples of K326 and Yunyan87

2.3 煙株根部AMF高通量測序結果分析

2.3.1 序列統(tǒng)計分析 K326健康、K326患病、云煙87健康和云煙87患病煙株根部高通量測序結果經(jīng)過質控并去除嵌合體后（表3），分別獲得的原始序列為64 285、70 561、71 911條和71 742條，排除線粒體和葉綠體干擾后得到的有效序列分別為62 938、68 947、70 524條和70 142條，按照97%相似性進行歸類后分別獲得629、592、620和727個OTUs.其中，云煙87健康煙株根內測得的AMF有效序列數(shù)最多，K326健康煙株根內AMF有效序列數(shù)最少，云煙87患病煙株根內AMF的OTUs高于其它樣品，K326患病煙株根內AMF的OTUs最低.從整體來看，云煙87根內AMF的有效序列和OTUs數(shù)量均高于K326.根據(jù)Shannon指數(shù)稀釋曲線（圖2）可以看出，當測序深度大于10 000時，所有樣品的稀釋曲線逐漸趨于平行，表明測序數(shù)量足夠，種群多樣性不再變化，測序結果可真實地反映煙草根內AMF群落組成.

表3 K326和云煙87健康和患病樣品根內AMF群落測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果及相關序列指數(shù)Tab.3 The statistical results of sequencing data of AMF community in roots between healthy and diseased samples of K326 and Yunyan87

圖2 Shannon指數(shù)稀釋曲線Fig.2 Shannon index dilution curve

2.3.2 煙草根內AMF多樣性指數(shù)分析 多樣性指數(shù)結果（表4）表明各煙草樣品根部AMF的Ace、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)均無顯著差異.云煙87患病樣品AMF的Ace和Chao指數(shù)最高，說明其根內AMF較為豐富，K326健康樣品AMF的Shannon指數(shù)最高，Simpson指數(shù)最低，說明其根內的多樣性最高.總體來看，云煙87品種的AMF豐富度較高，多樣性較低，K326樣品的AMF多樣性較高而豐富度較低.同時各個樣品中AMF的OTU覆蓋率（Coverage）均高于99%，說明本次測序結果可靠.

2.3.3 煙草根內AMF群體聚類分析 基于偏最小二乘回歸模型對樣本進行PLS-DA（partial least squares discriminant analysis）分析.如圖3所示，在不同品種中患病與健康煙株AMF群落存在差異，且K326與云煙87健康煙株的AMF群落有較高的相似性，感病煙株根內AMF群落相似性較高.

2.3.4 煙草AMF種群歸類分析 排除不可歸類的類型后對AMF種群組成進行統(tǒng)計（表5），發(fā)現(xiàn)煙草根內AMF均為Glomeromycetes（球囊菌綱）.在目水平，AMF歸屬于4個目，包括Archaeosporales（原囊霉目）、Diversisporales（多孢囊霉目）、Glomerales（球囊霉目）和Paraglomerales（類球囊霉目）；在科水平，AMF歸屬于5個科，包括Archaeosporaceae（原囊霉科）、Diversisporaceae（多孢囊霉科）、Gigasporaceae（巨孢囊霉科）、Glomeraceae（球囊霉科）和Paraglomeraceae（類球囊霉科）.

表4 多樣性指數(shù)統(tǒng)計Tab.4 Diversity index statistics

圖3 煙株根內AMF群落聚類分析Fig.3 The cluster analysis of AMF community in root of tobacco.

對兩個品種煙株健康和患病樣品AMF種群在屬水平上進行歸類，如圖4所示，排除不可歸類的類型后在各個樣品中豐度水平前3的AMF均為Paraglomus（類球囊霉屬，33.73%～57.86%）、Glomus（球囊霉屬，26.42%～54.41%）和Diversispora（多孢囊霉屬，11.59%～21.29%），但相對豐度不同.此外，云煙87健康煙株中Glomus占比高于Paraglomus，其余樣品均為Paraglomus占比高于Glomus.Gigaspora和Scutellospora僅存在于K326健康煙株中，分別占比4.46%和0.39%.可見，不同品種煙株根內AMF類型存在差異，患病與健康煙株根內AMF類型亦存在差異.

2.3.5 煙株根內AMF的OTU分析 通過OTUs聚類繪制的Venn圖（圖5）可較為直觀地看出煙株根內AMF的OTUs組成情況.所有樣品中共存在1 655個OTUs，其中共有的OTUs為558個，占比為33.72%.云煙87患病煙株根內獨有的OTUs較多，約占全部的12.93%；其次為K326和云煙87健康煙株，分別占比8.04%和7.92%；患病的K326煙株根內獨有的OTUs較少，約占全部的7.67%.整體來看，云煙87所含AMF的OTUs多于K326，在K326中健康煙株所含OTUs高于患病煙株，而云煙87中患病煙株存在的OTUs高于健康煙株.

表5 煙株根內 AMF 種群組成統(tǒng)計Tab.5 The AMF population composition in tobacco root

圖4 AMF在屬水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance ratio of AMF at genus level

圖5 K326和云煙87健康與患病煙株之間獨有和共有的OTU數(shù)Fig.5 The number that unique and shared OTUs between healthy and diseased tobacco strains of K326 and Yunyan87

2.4 土壤理化性質對煙草AMF的影響應用冗余度分析（redundancy analysis，RDA）可探究煙草根際土壤理化性質與AMF侵染特征的相關性.根際土壤理化性質對AMF多樣性指數(shù)影響的冗余分析結果顯示（圖6（a）），第1排序軸解釋信息量達70.3%，第2排序軸解釋信息量達11.7%.從整體來看pH為AMF多樣性的主要影響因子，其次為全氮和有機質.相關性結果表明土壤全磷、速效磷、全鉀和速效鉀質量比與Shannon和Chao指數(shù)呈正相關，其它指標與兩指數(shù)均呈負相關.其中，全磷、速效磷對Shannon指數(shù)影響較大，而全鉀和速效鉀對Chao指數(shù)影響較大.全氮、堿解氮、有機質和pH與群落多樣性Simpson指數(shù)呈正相關，其它土壤指標與之呈負相關；堿解氮、有機質和pH與均勻度Ace指數(shù)呈正相關，其它指標與其呈負相關.可見，根際土壤理化性質對AMF多樣性指數(shù)產(chǎn)生影響，但不同土壤理化指標對各AMF多樣性指數(shù)影響并不一致.

根際土壤理化性質對煙草AMF侵染狀況影響的冗余分析見圖6（b），兩軸累積解釋信息量達69.8%.從整體來看全鉀為AMF侵染狀況的主要影響因子，其次為速效磷和全磷.相關性結果表明全氮、堿解氮、有機質和pH值與AMF侵染率（F）呈正相關，其它土壤指標與之呈負相關；全氮、全鉀、速效鉀、全磷和速效磷均與菌根侵染密度（M）和從枝豐富度（A）呈正相關；pH和全磷含量與土壤孢子密度呈正相關，其余根際土壤性質均與其為負相關.綜上，根際土壤理化性質與土壤中的AMF孢子密度及煙草根內的AMF侵染狀況均存在一定的相關性，但其對AMF的侵染狀況的影響更為明顯.

圖6 煙株根際土壤理化性質對AMF多樣性（a）、侵染狀況（b）和屬水平相對豐度（c）影響的RDA分析Fig.6 RDA analysis about effects of physical and chemical properties of tobacco rhizosphere soil on AMF diversity(a) infection status (b) and relative abundance at genus level (c)

根際土壤理化性質對煙草AMF在屬水平相對豐度影響的結果見圖6（c）.從整體來看速效鉀為AMF屬水平相對豐度的主要影響因子，其次為全鉀和速效磷.相關性結果表明Diversispora與速效鉀和堿解氮呈正相關，與其它土壤理化性質呈負相關；Glomus與速效磷、全磷和有機質呈正相關；Archaeospora與全磷、速效磷、pH和有機質呈正相關；Gigaspora和Scutellospora與全鉀、全氮、pH、全磷、速效磷和有機質呈正相關，與速效鉀和堿解氮呈負相關；Paraglomus與有機質呈負相關，與其它指標均呈正相關.可見煙草AMF的群落組成與土壤理化性質密切相關，其中土壤中鉀含量影響最為明顯.

3 討論

3.1 煙株根內存在豐富的AMF資源AMF作為一種寄生真菌，可以通過與植物根部結合在土壤中形成龐雜的菌絲網(wǎng)絡，使植物對土壤營養(yǎng)物質的吸收更加具有優(yōu)勢[17].AMF在提高煙草生長生理以及抗病抗逆方面具有巨大潛力[18-20]，探究煙株根部AMF類型具有重要意義，但目前對煙草AMF多樣性的研究相對較少.李昕竺[21]使用DGGE法對煙草根部AMF多樣性進行檢測，共獲得28個AMF類型.本實驗室先前應用分子克隆文庫構建法對4個煙草品種根部AMF多樣性進行調查，共檢測到21個OTUs[22]，其中云煙87、K326分別檢測到9個和8個OTUs.目前已有研究采用傳統(tǒng)分子生物學手段在煙草根內只獲得較少的AMF類型，但本研究采用高通量測序技術對煙草K326和云煙87根內AMF多樣性進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)了極為豐富的AMF資源.在兩個煙草品種根內共得到1 655個OTUs，其中，在K326中發(fā)現(xiàn)了1 240個OTUs，在云煙87檢測到1 348個OTUs.可見，應用高通量測序技術可打破傳統(tǒng)分子生物學手段的局限，檢測到更多的AMF類型.同時與K326相比，云煙87根內AMF種類更為豐富，這與本實驗室先前研究結果相一致[22].此外，本研究所測得的OTUs在可歸類的分類階元中歸屬于1綱4目5科6屬.整體來看，在本研究的煙草根部樣品中，排除不可歸類的AMF，Paraglomus相對豐度最高，占總AMF的42.56%；其次為Glomus，占比39.64%，該結果與先前報道的Glomus為煙草優(yōu)勢AMF類型的結果并不同[21-22]，這可能與不同檢測方法敏感度不同有關.

3.2 患 病 與 健 康 煙 株 間 的 根 際 土 壤 和 根 內AMF存在差異植株根部在受到病原菌侵染時AMF可與病原物產(chǎn)生強烈競爭，阻礙病原菌進入植株[23]，同時病原菌的存在有可能對AMF孢子及其對植物根部的定殖產(chǎn)生影響.本研究結果表明，K326和云煙87健康煙株根際土壤孢子密度高于患病煙株，這可能由于患病植株根際土壤中存在大量的病原菌，這些病原菌可與AMF孢子爭奪生存空間及營養(yǎng)物質[24]，導致AMF的生存環(huán)境受到破壞，進而降低了AMF的孢子數(shù)量.本研究進一步發(fā)現(xiàn)，患病煙株根內AMF的菌根侵染率和菌根侵染密度明顯下降，推測可能的直接原因除與根際土壤中AMF孢子密度降低相關外，還與病原菌入侵根部與AMF競爭生態(tài)位點相關[25]，在雙重直接因素影響下導致AMF對患病煙株根部的定殖下降.

此外，本研究還證實，感染黑脛病會改變煙株根內AMF的侵染類型.一方面，煙株患病后根內AMF的OTUs數(shù)量會發(fā)生變化，K326中健康煙株所含有的OTUs高于患病煙株，而云煙87健康煙株所含類型低于患病煙株，感染黑脛病對煙株根內AMF種類數(shù)量的影響與煙草品種有關.另一方面，患黑脛病亦會引起煙株根內AMF類型發(fā)生改變，在K326健康煙株根內存在Gigaspora和Scutellospora的AMF，而患病煙株并未檢測到；云煙87的健康煙株與患病煙株根內AMF最主要屬類型出現(xiàn)不同，健康煙株主要屬為Glomus，而Paraglomus為患病煙株的主要屬.非常有趣地是，本研究發(fā)現(xiàn)盡管患病對K326和云煙87根內AMF帶來的影響不一致.但在群體聚類分析中發(fā)現(xiàn)，兩個品種的健康植株根內AMF群落結構具有較高的相似性，推測患病后可改變了煙草根圈微生態(tài)環(huán)境，導致根內AMF群落結構發(fā)生改變.可見，在植煙大田中，土傳病害-煙株根內-AMF之間的關系較為復雜.本研究只能初步證實，感染黑脛病能夠改變煙株根際的AMF孢子密度及其對煙株的侵染特征，引起煙株根內AMF群落結構發(fā)生變化，但在煙株根圈黑脛病及AMF之間存在著怎樣的動態(tài)關系？哪些AMF在煙株遭受黑脛病侵襲后能還能更好地侵染根部？以及感染黑脛病是否影響到AMF對煙株的抗病能力還有待進一步證實.

3.3 土壤理化性質對煙株根際和根內AMF產(chǎn)生影響AMF作為土壤習居菌，主要存在于植物根內及根際土壤中，與土壤環(huán)境關系密切，其孢子密度及其對植物的侵染水平受到多種因素的影響，其中土壤養(yǎng)分的影響最為重要[26].本研究發(fā)現(xiàn)，土壤全鉀質量比是影響AMF孢子密度及對煙株侵染狀況的主要驅動因子，其次為速效磷質量比和全磷質量比.土壤中的全鉀、速效鉀、全磷和速效磷質量比均與菌根侵染密度和從枝豐富度呈正相關，且土壤全磷質量比與土壤孢子密度呈正相關.鉀和磷同為土壤中的大量元素，但磷元素與AMF的關系更為密切[27].大量研究結果表明，土壤磷質量比過高往往會抑制AMF的生長、發(fā)育和功能[28]，降低了AMF的根內侵染能力和根外菌絲密度[29].這與本研究結果不同，可能是本研究采樣煙田土壤中的磷質量比背景值不高，未達到抑制AMF生長的上限.在一定范圍內增加土壤全磷和速效磷含量可增加土壤中AMF的孢子密度，并能促進AMF與煙株形成更好地侵染.

植物根內AMF多樣性及群落結構可受到宿主植物、土壤因子、地理位置以及氣候條件等因素的影響[30]，其中土壤理化性質的影響較為廣泛[31].本研究發(fā)現(xiàn)土壤pH值對煙株根內AMF多樣性影響最大，且與AMF多樣性呈負相關.目前土壤pH值被認為是影響AMF多樣性非常重要的土壤因子，受到越來越多研究者的關注.李雪靜等[32]發(fā)現(xiàn)土壤pH是影響荒漠和草原生態(tài)系統(tǒng)AMF多樣性的最主要驅動因子.代心靈等[33]研究認為土壤pH對內蒙古典型草原的AMF影響最為明顯，可顯著影響其群落結構.這些研究結果與本研究結果一致，均證實了pH在AMF生長和繁殖環(huán)境中的重要性.我們認為AMF可能是一類對酸堿環(huán)境比較敏感的微生物，pH值的高低可直接影響AMF孢子萌發(fā)、菌絲生長、孢子繁殖[34-35]以及種類分布[36].

植株AMF群落組成會受到土壤理化性質的影響，眾多研究表明磷元素為AMF群落組成的主要影響因子.汪志琴等[37]對免耕覆蓋栽培管理下的冬麥根部AMF研究發(fā)現(xiàn)，影響優(yōu)勢屬豐度的土壤理化性質主要為土壤速效磷與全磷.王化秋等[38]對石山香根草的AMF研究發(fā)現(xiàn)，速效磷質量比是AMF群落的主要影響因子.但本研究與上述結果不同，發(fā)現(xiàn)速效鉀是影響煙株根系AMF屬水平相對豐度的主要影響因子，其次為全鉀和速效磷.可見，鉀與磷均為土壤中的大量元素，其對植物AMF群落的影響亦不可忽略.

3.4 土傳病害對煙株AMF的影響與其改變土壤理化性質相關土壤理化性質與植物是否感病之間存在密切關系，土傳病害會使土壤營養(yǎng)平衡失調[39].丁亞茹等[40]分析了四川涼山州成熟期健康與易感病煙田土壤理化性質差異，結果發(fā)現(xiàn)盡管全鉀和速效鉀指標在兩種煙田土壤中無顯著差異，但全鉀和速效鉀、全氮和速效氮等指標均表現(xiàn)為易感病煙田>健康煙田.陳海念等[41]研究結果表明，患病煙田土壤中的全氮和速效氮、全磷和速效磷、全鉀和速效鉀的含量均大于健康煙田.已有報道都認為對比健康煙田，感染病害可提升土壤的養(yǎng)分含量.本研究結果發(fā)現(xiàn)，兩個品種健康與患病根際土壤的全氮與堿解氮含量均呈現(xiàn)患病>健康，這與上述研究結果一致.可能的原因是由于煙草黑脛病為維管束系統(tǒng)性病害，患病后煙株根部和莖基部的維管束壞死[42]，氮元素無法從植株地下部運輸?shù)降厣喜浚沟迷诨疾⊥寥乐袣埩袅枯^大.

但對于磷和鉀元素，本研究結果與上述報道并不一致.本文發(fā)現(xiàn)煙草K326和云煙87根際土壤的全磷和速效磷質量比均呈現(xiàn)為健康>患病，這與前人對煙田的研究結果相反.Bian等[43]報道感染根銹腐病使得人參根際土壤中全磷和速效磷質量比明顯降低，這與本研究結果一致.同時，本研究還發(fā)現(xiàn)全鉀和速效鉀在兩個品種患病與健康煙株根際土壤中雖存在顯著差異，但在兩個品種中表現(xiàn)不同，其中K326健康樣品全鉀和速效鉀質量比顯著高于患病樣品，而云煙87則表現(xiàn)為健康低于患病.在感染根銹腐病人參的根際土壤中，其全鉀和速效鉀的質量比明顯降低[43]，這與本研究煙草K326的結果一致.可見，關于感病對植株根際土壤理化性質的影響并無定論.土壤-病害-植物間關系復雜，并且相關研究較少，但我們可以肯定的是植株感染病害與根際土壤養(yǎng)分含量關聯(lián)密切，土壤養(yǎng)分含量的改變和失衡也可能是引發(fā)或加重植株病害的原因之一.

AMF在促進植物對磷素吸收方面具有積極作用，同時土壤中磷元素質量比與AMF的群落結構和豐度關聯(lián)密切[44-46].本研究在RDA分析中表明土壤全磷和速效磷含量與菌根侵染密度和從枝豐富度呈正相關，且患病后煙株根內AMF侵染率下降，根際土壤孢子密度降低，可以推測煙株感染黑脛病可通過改變土壤中磷含量進而對根際和根內AMF產(chǎn)生影響.綜上所述，由于土壤理化性質會影響AMF的多樣性，煙株感染黑脛病可引發(fā)土壤理化性質發(fā)生改變，從而間接地對AMF群落產(chǎn)生影響.

煙草根際土壤富含豐富的AMF資源，病原菌和土壤理化性質均與AMF群落組成相關.煙株感染黑脛病會使土壤理化性質發(fā)生改變，進而對根內AMF多樣性產(chǎn)生影響.可見，病原菌的侵染可直接或間接地影響AMF群落結構，同時AMF在煙草根內定殖亦會對病原菌產(chǎn)生一定地拮抗作用[47].深入研究AMF-土傳病害-土壤理化性質-煙株根部的相互關系，可為后續(xù)AMF在緩解煙草土傳病害方面的應用奠定基礎.