張薺丹，孫振琪，岳建英，王海娟，趙倩倩，楊向東，趙明敏，1b*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) a.園藝與植物保護(hù)學(xué)院，b.生物農(nóng)藥創(chuàng)制與資源利用內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實驗室，呼和浩特 010019；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，b.吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，長春 130033）

煙草種植常常受到不同病毒病的影響［1-3］。馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus）病毒是目前已知的最大的植物病毒病原體類群，是所有煙草傳染性病毒中破壞性最大、傳播最廣的病毒［4］。馬鈴薯Y 病毒屬病毒約占植物病毒總數(shù)的30%，該屬病毒寄主范圍廣，可通過蚜蟲以非持久方式傳播。因此，普通的種子處理、清潔田園、輪作和化學(xué)防治等疾病防治措施對其無效。馬鈴薯Y 病毒屬病毒的基因組RNA 為正義單鏈RNA，長為10 kb。基因組兩端分別為5'-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）和3'-UTR。它的基因組包含一個大的開放閱讀框，編碼一個由3 000～3 300 個氨基酸組成的多聚蛋白，然后被自身的蛋白酶加工成10 個成熟的蛋白［5］。1972 年，Gooding 等［1］報道了美國北卡羅來納州一種發(fā)生在白肋煙上的新病毒——煙草脈斑駁病毒（tobacco vein mottling virus，TVMV），且發(fā)現(xiàn)該病毒在自然界中通過特定的媒介——蚜蟲傳播。其侵染癥狀表現(xiàn)為花葉及系統(tǒng)斑駁，葉脈兩側(cè)組織呈深綠色帶狀斑，稱為“脈斑駁”。TVMV 的侵染可顯著降低煙草的產(chǎn)量及品質(zhì)，改變煙草內(nèi)部化學(xué)成分［6］。病毒侵染造成的產(chǎn)量損失取決于多種因素，包括病毒株系的致病性強(qiáng)弱以及侵染時間等［7-8］。

與馬鈴薯Y病毒屬家族的其他RNA病毒一樣，TVMV 基因組最初被翻譯成一個大的多聚蛋白，然后被3種病毒蛋白酶加工成10 個單個蛋白［9］。2000年，Pirone 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，TVMV 的基因組由大約9 400 個堿基的單鏈正義RNA 組成，包括205 nt 的5'-UTR、340 kD 的多聚蛋白和250 nt 的3'-UTR［不包括poly（A）尾］。其中，多聚蛋白在蛋白水解過程中生成病毒外殼蛋白（coat protein，CP）和至少6 個非結(jié)構(gòu)蛋白［11］。

高通量測序又稱第二代測序技術(shù)或者深度測序（deep-sequencing），其最突出的特點(diǎn)是單次運(yùn)行可獲得的序列數(shù)據(jù)量極大［12-13］，能一次對多達(dá)幾百萬條的DNA 分子進(jìn)行序列測定。目前，第二代測序技術(shù)己被廣泛應(yīng)用于生物基因組及表達(dá)研究的各個領(lǐng)域，例如，物種全基因組的從頭測序（denovo sequencing）、RNA 測序（RNA-seq）技術(shù)等，為挖掘基因表達(dá)水平和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。高通量測序以及新轉(zhuǎn)錄元的注釋、差異基因的表達(dá)分析等技術(shù)的推廣應(yīng)用，為病毒與寄主植物之間的相互作用關(guān)系和致病機(jī)制研究提供了依據(jù)。目前，利用第二代測序技術(shù)對病毒侵染寄主后轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析的報道已有很多，其不僅在模式植物煙草或者擬南芥中進(jìn)行了研究，還用于一些農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物［14-21］。2019 年，許躍語［22］以甘蔗抗病品種ROC24 和感病品種CP72-1210 為供試材料，研究了兩個甘蔗品種在黃葉病毒侵染后轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)情況，并對抗病基因進(jìn)行了進(jìn)一步的分析研究。2021 年，雷陽等［23］報道了辣椒在黃瓜花葉病毒侵染下的分子響應(yīng)機(jī)制，并發(fā)掘了抗病相關(guān)基因，對接種黃瓜花葉病毒的葉片進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序，利用生物信息學(xué)方法對基因表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。2023 年，蘇偉華等［24］為了探究大豆抵抗大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV）侵染的分子調(diào)控機(jī)制，挖掘抗病相關(guān)基因，對侵染病毒后的大豆品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。

本研究將侵染了TVMV 的本氏煙（Nicotianabenthamiana）葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘了其差異表達(dá)基因，對差異表達(dá)基因進(jìn)行了基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）基于途徑的通路富集分析，揭示了與抗TVMV 基因相關(guān)的代謝及信號通路，為進(jìn)一步開展與抗TVMV 相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及功能研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究方法

本氏煙在溫度為23℃、光照16 h 和黑暗8 h 的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，挑選5～6 葉期、大小一致的植物用于試驗。試驗所用病毒為TVMV。

采用機(jī)械摩擦接種法接種病毒。將冷凍保存的TVMV 侵染的本氏煙葉片與磷酸緩沖液（pH ＝7.2）混勻，得到病毒粗提液。每棵植株接種2片葉，接種前先撒少許二氧化硅，再將20 μL 病毒粗提液滴在接種葉片上，左手托住葉片背面，用右手食指在接種葉片上輕輕摩擦。摩擦?xí)r注意力度，使葉片表皮細(xì)胞造成微傷口。摩擦完成后在23℃條件下培養(yǎng)，10 d 后觀察其發(fā)病情況，拍照記錄發(fā)病癥狀。14 d 時取上部系統(tǒng)發(fā)病葉片，以未接種TVMV 的健康本氏煙為陰性對照，各設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，使用2 mL離心管保存于實驗室超低溫冰箱（-80℃）。

利用Western blot 檢測病毒積累量。將煙草植株發(fā)病葉片采集后，研磨成粉末，對其葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，然后用Western blot 法檢測病毒含量。具體步驟如下：使用包涵體蛋白提取液（含尿素）［inclusion Body Protein Buffer（with Urea），UREA］緩沖液提取蛋白質(zhì)，并在12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS/PAGE）中進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移至免疫印跡（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜中。通過麗春紅染色10 min，檢查蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移情況，然后通過蒸餾水洗滌將膜完全脫色。將膜放在封閉溶液中，在室溫下?lián)u床上封閉2 h。用通用型Western blot 抗體稀釋液（Tris Buffer Saline，TBS）短暫沖洗膜3 次，每次10 min，然后添加一抗，在4℃過夜孵育。用TBS緩沖液洗滌3次，每次10 min后，在室溫下將膜在二抗中孵育1 h。用TBS 緩沖液洗滌3 次，每次10 min，最后加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液，在近紅外雙色激光和化學(xué)發(fā)光雙功能成像系統(tǒng)上觀察蛋白條帶。

1.2 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及高通量測序

以侵染TVMV 的本氏煙葉片和健康葉片為材料，通過Trizol 法提取總RNA。先進(jìn)行勻漿處理。植物組織經(jīng)過液氮速凍處理后，稱取大約0.1 g，并加入1 mL Trizol，將其旋渦充分混勻，室溫放置5 min；然后4℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清，棄沉淀（需在冰上操作），加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min，以除去蛋白；接著4℃，12 000 r/min 離心10～15 min。取水相（約500 μL）轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 無酶離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，在冰上放置25 min；4℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清（得到膠狀沉淀），然后加入1 mL 75%乙醇（需用無酶水配制）；4℃，5 000 r/min 離心3 min，倒出收集管中液體，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸到沉淀，室溫放置2 min 以晾干乙醇，加50 μL無酶水用槍頭反復(fù)吹打混勻，充分溶解RNA，最后保存于-80℃冰箱中。

用Oligo-dT 磁珠富集帶有polyA 的mRNA。隨后將完整的mRNA 進(jìn)行片段化，即測序數(shù)據(jù)中的Reads。對RNA 片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建，使用Illumina Novaseq 6000測序平臺進(jìn)行高通量測序，最終獲取RNA-seq數(shù)據(jù)。

1.3 主要試劑和儀器

主要試劑：異丙醇、氯仿、無水乙醇等購自園益鑫科研用品經(jīng)銷部；Trizol RNA 提取試劑購自天根生化科技有限公司。

主要儀器：超低溫冰箱（海爾、DW-86LJ）、臺式高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司5424R）、移液器（德國Eppendorf 公司）、超微量核酸蛋白濃度測定儀（中國賽默飛世爾科技有限公司Nano Drop One/One C）。

1.4 生物信息學(xué)分析

首先，使用Cutadapt 軟件［25］以及本地perl 腳本去除低質(zhì)量序列、污染序列以及測序儀接頭序列，得到CleanData。然后，使用FastQC軟件（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/）對CleanData 進(jìn)行質(zhì)控，使用HISAT2 序列比對軟件［26］的默認(rèn)參數(shù)將Reads 比對到參考基因組上（拉丁文：Nicotiana benthamiana，基因組版本：V1.0.1）；使用exomePeak 序列分析軟件［27］和ChIPseeker 生信數(shù)據(jù)分析R 包［28］進(jìn)行Peak calling 分析和Peak 注釋。最后，使用MEME［29］和HOMER 軟件［30］對富集區(qū)域進(jìn)行motif 分析?；蚨寇浖镾tringTie［31］，歸一化方式為每千個堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）。基因差異分析采用R 包edgeR［32］。采用的數(shù)據(jù)庫信息如表1 所示。采用的數(shù)據(jù)分析軟件如表2所示。

表1 數(shù)據(jù)庫信息Tab.1 Database information

表2 數(shù)據(jù)分析軟件Tab.2 Data analysis software

2 結(jié)果與分析

2.1 TVMV侵染本氏煙癥狀及其病毒檢測

對生長至5～6 葉齡的本氏煙植株摩擦接種TVMV。接種一周后，對本氏煙進(jìn)行癥狀觀察，發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，接種TVMV 的植株葉片呈花葉以及系統(tǒng)斑駁，葉脈兩側(cè)組織呈深綠色帶狀斑。采用TVMV 的α-CP 特異性抗體對侵染TVMV 樣品進(jìn)行Western blot 檢測，結(jié)果顯示，接種TVMV 的本氏煙葉片樣品中均檢測到TVMV的CP蛋白（圖1），表明TVMV成功侵染本氏煙。

圖1 TVMV侵染本氏煙癥狀及其病毒檢測Fig.1 Symptom of TVMV infection in N.benthamiana and virus detection

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計

對測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行預(yù)處理，使用cutadapt 過濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù)（clean data），再進(jìn)行下一步分析。具體處理步驟如下：1）去除帶接頭（adaptor）的Reads；2）去除含有N（N 表示無法確定堿基信息）的比例大于5%的Reads；3）去除低質(zhì)量Reads（質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個Reads 的20%以上）；4）統(tǒng)計原始測序量、有效測序量、Q20、Q30、GC含量，并進(jìn)行綜合評價。

由表3 可以看出，測序序列有效Reads 的占比在健康樣本1 和2 中分別為98.11%和97.76%，在侵染TVMV 樣本1 和樣本2 中分別為98.15%和97.96%，都在97.00%以上，表明參考數(shù)據(jù)真實可靠，可用于進(jìn)一步分析。

表3 測序序列統(tǒng)計與質(zhì)控Tab.3 Sequence statistics and quality control

2.3 參考基因組比對

使用比對軟件HISAT2 或tophat 對預(yù)處理后的有效數(shù)據(jù)（valid data）進(jìn)行參考基因組比對，同時根據(jù)基因組注釋文件gtf 指定的基因位置信息對其分別進(jìn)行統(tǒng)計，包括測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對Reads 統(tǒng)計、Reads 在外顯子和內(nèi)含子比例統(tǒng)計以及Reads分布等信息。

2.4 差異表達(dá)基因分析

為了分析TVMV 侵染本氏煙后內(nèi)源的抗病相關(guān)基因的表達(dá)差異，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序檢測了TVMV 侵染的本氏煙與健康植物的基因表達(dá)情況，并繪制了火山圖。根據(jù)log2（fold change）以及-lg（Pvalue）值判斷出TVMV 侵染可顯著影響寄主基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，與健康本氏煙相比，TVMV侵染的樣品中有4 593個差異表達(dá)基因，其中3 564個基因上調(diào)表達(dá)，1 029個基因下調(diào)表達(dá)（圖2）。

圖2 TVMV侵染的本氏煙樣本差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano picture of differentially expressed genes in TVMV infected N.benthamiana

進(jìn)一步分析與抗病相關(guān)的基因以及富集于代謝途徑的主要差異表達(dá)基因（表4），共篩選出6 個上調(diào)差異表達(dá)基因，在侵染TVMV 植株中高表達(dá)。基因Niben101Scf06275g03011 的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）為12.09，具有防御素蛋白相關(guān)功能；基因Niben101Scf00436g05003 的FC 為10.05，具有超氧化物歧化酶［Cu-Zn］相關(guān)功能；基因Niben101Scf09876g00011 的FC 為6.83，具有組蛋白H2A.1 相關(guān)功能；基因Niben101Scf09741g00010的FC 為3.77，具有蛋白酶抑制劑相關(guān)功能；基因Niben101Ctg11463g00002 的FC 為2.85，具有30S核糖體（ribosome）蛋白S4 相關(guān)功能；基因Niben-101Scf09268g00007 的FC 為2.73，具有富含甘氨酸的RNA 結(jié)合蛋白3 相關(guān)功能。篩選出4 個下調(diào)差異表達(dá)基因，在健康植株樣本中高表達(dá)?；騈iben101Scf18347g00012 的FC 為0.46，屬未知蛋白；基因Niben101Ctg06879g00004 的FC 為0.41，具有葉綠素a-b 結(jié)合蛋白相關(guān)功能；基因Niben-101Scf05692g00006 的FC 為0.28，具有PG1 蛋白相關(guān)功能；基因Niben101Scf00390g01010 的FC 為0.48，具有S-腺苷甲硫代脫羧酶蛋白酶相關(guān)功能。

表4 TVMV侵染的本氏煙樣本主要差異表達(dá)基因Tab.4 Main differentially expressed genes after TVMV infection of N.benthamiana

綜合上述分析可知：TVMV 的侵染極大地促進(jìn)了本氏煙防御素蛋白的表達(dá)，F(xiàn)C 達(dá)12.09；同時，其抑制了S-腺苷甲硫代脫羧酶蛋白酶的表達(dá)，F(xiàn)C 達(dá)0.48（表4）。

2.5 聚類熱圖分析

比對差異表達(dá)基因繪制熱圖，結(jié)果顯示：共有60 個差異表達(dá)基因在侵染TVMV 的植株樣本中高表達(dá)，而在健康植株樣本中低表達(dá)；有40 個差異表達(dá)基因在侵染TVMV 的植株樣本中低表達(dá)，而在健康植株樣本中高表達(dá)?；騈iben-101Scf05813g03001、Niben101Scf03849g00014、Niben101Scf06686g00001 在樣本TVMV1 中表達(dá)水平最高，基因Niben101Scf04918g02009、Niben-101Scf02909g02010、Niben101Scf03834g00005在樣本TVMV2 中表達(dá)水平最高，基因Niben-101Scf02132g00027 在樣本Healthy1 中表達(dá)水平最高，基因Niben101Scf03839g05003、Niben101Ctg13152g00001、Niben101Scf07188g02011在樣本Healthy2中表達(dá)水平最高（圖3）。

圖3 TVMV侵染的本氏煙樣本差異表達(dá)基因熱圖Fig.3 Differential expression gene heatmap of TVMV infection of N.benthamiana

2.6 基因的GO功能注釋

對差異基因進(jìn)行GO 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)過程大類中，關(guān)于翻譯所涉及的差異基因數(shù)最多最顯著（257 個差異基因）。在細(xì)胞組分大類中，關(guān)于細(xì)胞內(nèi)部的差異基因數(shù)最多且最顯著（266 個差異基因）。在分子功能大類中，蛋白質(zhì)結(jié)合（501 個差異基因）（P＞0.05）以及ATP 結(jié)合（453 個差異基因）、DNA 結(jié)合（293 個差異基因）所涉及的差異基因數(shù)最多且最顯著（圖4）。

圖4 TVMV侵染的本氏煙樣本差異表達(dá)基因GO 富集柱狀圖Fig.4 GO enrichment histogram of differentially expressed genes in TVMV infected N.benthamiana

上調(diào)差異基因Niben101Scf06275g03011 主要富集在防御反應(yīng)過程，隸屬于生物學(xué)過程大類；基因Niben101Scf00436g05003 主要富集在氧化減少過程、超氧化物歧化酶活性、超氧化物代謝過程以及金屬離子結(jié)合過程，其中，氧化減少過程、超氧化物代謝過程隸屬于生物學(xué)過程大類，超氧化物歧化酶活性、金屬離子結(jié)合過程隸屬于分子功能大類；基因Niben101Scf09876g00011 主要富集在核小體、DNA 結(jié)合、核以及蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性過程，其中，核小體、核隸屬于細(xì)胞組分大類，DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性隸屬于分子功能大類；基因Niben101Scf09741g00010 主要富集在絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性以及對傷害的反應(yīng)過程，其中，絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性隸屬于分子功能大類，對傷害的反應(yīng)隸屬于生物學(xué)過程大類；基因Niben101Ctg11463g00002 主要富集在RNA 結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞內(nèi)部、翻譯、小核糖體亞基以及rRNA 結(jié)合過程中，其中，RNA 結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分以及rRNA 結(jié)合隸屬于分子功能大類，細(xì)胞內(nèi)部、小核糖體亞基隸屬于細(xì)胞組分大類，翻譯隸屬于生物學(xué)過程大類；基因Niben-101Scf09268g00007 主要富集在核苷酸結(jié)合以及核酸結(jié)合，其中，核苷酸結(jié)合和核酸結(jié)合都隸屬于分子功能大類（表5）。

表5 TVMV侵染的本氏煙樣本中上調(diào)差異基因富集分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.5 Statistics of up-regulation differential gene enrichment data in TVMV infected N.benthamiana

下調(diào)差異基因Niben101Ctg06879g00004 主要富集在光合作用（photosynthesis）、收獲光以及膜過程，其中，光合作用、收獲光隸屬于生物學(xué)過程大類，膜隸屬于細(xì)胞組分大類；基因Niben-101Scf00390g01010 主要富集在腺苷甲硫代脫羧酶活性、精胺生物合成過程以及亞精胺生物合成過程，其中，腺苷甲硫代脫羧酶活性隸屬于分子功能大類，精胺生物合成過程、亞精胺生物合成過程隸屬于生物學(xué)過程大類（表6）。

表6 TVMV侵染的本氏煙樣本中下調(diào)差異基因富集分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.6 Statistics of down-regulation differential gene enrichment data in TVMV infected N.benthamiana

2.7 基因的KEGG功能注釋

對差異基因進(jìn)行KEGG 功能注釋，可以確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，將有助于我們更加系統(tǒng)地分析和破譯基因的功能。以顯著性富集或富集差異基因數(shù)量最多為條件，列出前20 個Pathway 進(jìn)一步分析。結(jié)果如圖5所示，TVMV 侵染的本氏煙植株中，差異基因富集在芪類化合物、二芳基庚烷與姜酚生物合成（stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、真核生物核糖體的生物發(fā)生（ribosome biogenesis in eukaryotes）、核糖體、嘌呤代謝（purine metabolism）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、光合作用、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)（phosphatidylinositol signaling system）、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（pentose and glucuronate interconversions）、核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair）、錯配修復(fù)（mismatch repair）、亞油酸代謝（linoleic acid metabolism）、肌醇磷酸代謝（inositol phosphate metabolism）、同源重組（homologous recombination）、葡萄糖苷生物合成（glucosinolate biosynthe-sis）、類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、胞吞作用（endocytosis）、DNA復(fù)制、甜菜素生物合成（betalain biosynthesis）以及角質(zhì)、木栓素和蠟的生物合成（cutin,suberine and wax biosynthesis）。

圖5 TVMV侵染的本氏煙樣本差異表達(dá)基因KEGG富集性散點(diǎn)圖Fig.5 KEGG enrichment of differentially expressed genes in TVMV infected N.benthamiana

此外，本研究還注釋到：核糖體途徑的差異基因富集程度最高，差異表達(dá)基因數(shù)為307 個（Pvalue=0）；真核生物核糖體生物反應(yīng)的差異表達(dá)基因數(shù)為92（Pvalue=0）；注釋到“DNA 復(fù)制”途徑的差異表達(dá)基因數(shù)為55（Pvalue=0）。核糖體代謝途徑的富集因子（rich factor）最高，接近0.3，表明富集此通路中的基因多數(shù)差異表達(dá)。

3 討論

近年來，關(guān)于TVMV 的研究主要集中在核內(nèi)蛋白酶等方面，尚未有關(guān)于其侵染本氏煙轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究報道。本文采用Illumina Novaseq 6000 高通量測序平臺對侵染了TVMV 的本氏煙進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，獲得了高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為挖掘本氏煙抗TVMV 相關(guān)基因以及信號和代謝通路篩選出具有重要生物學(xué)意義的差異基因及信號和代謝通路提供了依據(jù)。本研究共篩選出10 個具有抗病功能的顯著差異表達(dá)基因，并且分析了其GO 和KEGG富集通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、核糖體、真核生物核糖體的生物反應(yīng)、DNA 復(fù)制等通路可能在調(diào)控本氏煙抗TVMV 病毒中起著重要作用。

通過對發(fā)現(xiàn)的抗病相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，2008 年，趙樸等［35］研究發(fā)現(xiàn)，防御素是一類由粒性白細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生、富含半胱氨酸的內(nèi)源陽離子抗微生物肽。近年來，越來越多的證據(jù)表明，哺乳動物防御素在抗病毒免疫中不僅能直接抗病毒，而且能調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)。2009 年，王猛等［36］發(fā)現(xiàn)，防御素具有較高的抗菌活性，并且已被證實對病毒具有殺傷作用，這些防御素對單皰疹病毒、流感病毒等衣殼病毒有較強(qiáng)的殺傷力。另外，防御素不僅作為抵御微生物入侵的首道屏障發(fā)揮重要作用，而且也是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要組成部分。孫勇如等［37］將兔子的防御素基因NP-1基因構(gòu)建成植物表達(dá)載體質(zhì)粒，將該質(zhì)粒導(dǎo)入植物后，可以在植物體內(nèi)表達(dá)，在植物體內(nèi)產(chǎn)生防御素，從而賦予植物抗病毒的能力。1989 年，袁勤生［38］研究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是含有Cu、Zn 的金屬酶，它能夠催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，并且其具有抗病毒的作用。2014 年，曾秀存等［39］研究發(fā)現(xiàn)，SOD 是一種逆境條件下清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的關(guān)鍵酶，而銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）是該酶系中最主要的活性氧清除劑，與植物的抗逆性密切相關(guān)。2020 年，張明達(dá)等［40］研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白可以通過特殊的沉積和清除機(jī)制參與基因的表達(dá)調(diào)控，其在特定的條件下可通過調(diào)控細(xì)胞衰老和代謝抑制腫瘤增殖。2003 年，曲曉華等［41］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶抑制劑可以抑制昆蟲的生長和發(fā)育。有研究表明，蛋白酶抑制劑與植物的抗病性也有一定的關(guān)系。例如：2003 年，楊靜等［42］發(fā)現(xiàn)，蛋白酶抑制劑泛指具有蛋白酶抑制作用的一類物質(zhì)，它既可以是大分子的蛋白質(zhì)、寡核苷酸，又可以是小分子的有機(jī)物，目前其應(yīng)用于抗炎、抗感染、抗病毒感染、抗腫瘤等方面；2020 年，馬寧等［43］克隆了一個番茄蛋白酶抑制劑基因，研究發(fā)現(xiàn)，其在抗土傳病害和葉部病害方面具有重要作用；2010 年，盧秀萍等［44］克隆煙草富含甘氨酸RNA 結(jié)合蛋白基因，并進(jìn)行原核表達(dá)，為制備抗體和研究煙草抗逆性分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)；2020 年，吳廷全等［45］首次公開了黃瓜捕光葉綠素a/b 結(jié)合蛋白在抗瓜類疫病中的應(yīng)用，特別是對侵染瓜類的瓜類疫霉具有抗病功能。

本研究通過對侵染TVMV 的本氏煙轉(zhuǎn)錄組分析揭示了與其相關(guān)聯(lián)的基因和信號通路，為今后研究主要關(guān)聯(lián)基因及信號通路的功能，闡明抗TVMV機(jī)理奠定了重要的基礎(chǔ)。