林 浩，劉 川，張陽(yáng)陽(yáng)，肖全偉，毛 銳，萬渝平，戴 琴

（成都市食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611130）

硝基咪唑類藥物是臨床常用的廣譜抗生素，由于其殺菌作用強(qiáng)、療效好、價(jià)格低廉，被廣泛應(yīng)用于治療原蟲感染、厭氧菌感染等疾病，并具有較好的抗腫瘤、抗病毒、抗結(jié)核等作用[1]。如甲硝唑（metronidazolem，MNZ）、洛硝噠唑、塞克硝唑等在細(xì)菌感染、滴蟲病等方面療效顯著，已成為預(yù)防和治療人類、畜禽等生物體感染該類疾病主要的藥物[2-3]。然而，由于硝基咪唑類藥物對(duì)哺乳動(dòng)物具有致畸、致癌及遺傳毒性等作用，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅[4]，美國(guó)和歐盟等國(guó)家已規(guī)定在食品中禁用該類物質(zhì)[5-6]，我國(guó)已制定GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》等相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其嚴(yán)格監(jiān)管[7-8]。

硝基咪唑類藥物是一類具有咪唑環(huán)和硝基取代基結(jié)構(gòu)的化合物，根據(jù)取代基種類和位置差異可分為不同化合物，主要包括MNZ及其代謝產(chǎn)物羥基甲硝唑、二甲硝咪唑（dimetridazole，DMZ）及其代謝產(chǎn)物羥甲基甲硝咪唑、洛硝噠唑（ronidazole，RNZ）、異丙硝唑等[9]。由于硝基取代基具有生物還原特性，被還原為硝基自由基時(shí)，能與DNA、蛋白質(zhì)等生物分子發(fā)生多種相互作用[10]，使硝基咪唑類衍生物與生物體內(nèi)酶、受體、DNA等許多大分子發(fā)生超分子結(jié)合，產(chǎn)生抗寄生蟲、抗癌、抗感染等醫(yī)藥活性[11]。目前硝基咪唑類殘留物的檢測(cè)方法較多，已有針對(duì)不同基質(zhì)建立的方法，如：GB/T 21318—2007《動(dòng)物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗(yàn)方法》[12]、SN/T 1928—2007《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[13]、SN/T 2624—2010《動(dòng)物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》等[14]，測(cè)定方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、滴定法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[15]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高效、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)[16]，為常用方法。

蜂蜜是由蜜蜂采集的花蜜、蜜露等釀造而成的天然食品，具有改善人體代謝、提高免疫能力等作用，倍受人們青睞[17]。作為有機(jī)生命體，蜜蜂因細(xì)菌、真菌或病毒侵襲而導(dǎo)致疾病，藥物防治是控制蜜蜂病蟲害的主要技術(shù)之一[18]，如MNZ作為抗感染一線藥物，被普遍用于控制和預(yù)防蜜蜂微孢子蟲病等。但蜂群中藥物濫用可能會(huì)導(dǎo)致蜂蜜中藥物積累，增加蜂蜜及相關(guān)制品對(duì)人體的危害性，已有相關(guān)報(bào)道顯示蜂蜜中的確存在氯霉素、MNZ等抗生素蓄積案例[19]。目前蜂蜜中硝基咪唑類物質(zhì)常用檢測(cè)方法為GB/T 23410—2009《蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[20]，該方法使用二甲硝咪唑-D3（dimetridazole-D3，DMZ-D3）作為DMZ和MNZ的內(nèi)標(biāo)，二甲硝咪唑代謝物-D3作為RNZ的內(nèi)標(biāo)，但檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同蜂蜜的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)各目標(biāo)物的影響存在差異，使用以上定量方法會(huì)對(duì)MNZ和RNZ的定量結(jié)果產(chǎn)生偏離，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。該方法前處理中并無凈化過程，導(dǎo)致在定性定量過程中，容易受到蜂蜜雜質(zhì)干擾而影響結(jié)果準(zhǔn)確性，降低檢測(cè)效率。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蜂蜜中MNZ、DMZ、RNZ測(cè)定方法進(jìn)行研究，優(yōu)化前處理工藝和定量方法，建立對(duì)蜂蜜具有普遍適用性的測(cè)定方法，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品均為市購(gòu)。

MNZ（純度99.5%） 北京曼哈格生物科技有限公司；DMZ（純度99.46%）、氘代二甲硝咪唑-D3（99.23%）、氘代洛硝噠唑-D3（100.04 μg/mL）美國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；RNZ（99.0%）、氘代甲硝唑-D4（100.5 μg/mL） 北京曼哈格生物科技有限公司。

PCX陽(yáng)離子交換柱、PEP固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司；C18固相萃取柱 美國(guó)Water公司；甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨、乙酸乙酯（均為色譜純）德國(guó)Merck公司；濃鹽酸、氨水（均為分析純） 重慶川東化工集團(tuán)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP5500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀美國(guó)AB SCIEX公司；Centrifuge 5810 R高速離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；ASPE-24固相萃取儀、MTN-2800W氮吹濃縮儀天津奧特賽恩斯公司；Multi reax全能型振蕩器 德國(guó)Heidolph公司；BP211D型天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取MNZ、DMZ、RNZ標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（準(zhǔn)確至0.01 mg）于3 個(gè)10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存，有效期6 個(gè)月[20]。

準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL于同一10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

分別準(zhǔn)確移取2 mL、200 μL和20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于3 個(gè)10 mL棕色容量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為2 μg/mL、200 ng/mL和20 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.1.2 同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取DMZ-D3標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（準(zhǔn)確至0.01 mg）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的DMZ-D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

準(zhǔn)確移取上述DMZ-D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的DMZ-D3標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

準(zhǔn)確移取上述DMZ-D3標(biāo)準(zhǔn)中間溶液、MNZ-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液、RNZ-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL至同一10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL混合同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制

分別準(zhǔn)確移取20 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50、100、250、500 μL和200 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100、250、500 μL置于1 mL容量瓶中，再分別加入混合同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50 μL，用20%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)終質(zhì)量濃度50 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 樣品提取

1.3.2.2 直接上機(jī)測(cè)定

向1.3.2.1節(jié)中氮吹管中加入1 mL 20%甲醇溶液復(fù)溶，渦旋1 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜測(cè)定。

1.3.2.3 PCX固相萃取小柱凈化

向1.3.2.1節(jié)中氮吹管中加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液復(fù)溶，渦旋1 min，傾入已用5 mL甲醇和5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液活化的PCX固相萃取小柱中，用5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液和5 mL甲醇淋洗，最后用5 mL洗脫液（甲醇-水-氨水，16∶3∶1，V/V）洗脫至接收管中，40 ℃氮吹至近干，1 mL 20%甲醇溶液復(fù)溶，渦旋1 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜測(cè)定。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

1.3.3.1 制備空白基質(zhì)

準(zhǔn)確稱取混合均勻的同一陰性蜂蜜樣品10 份，每份10 g分別置于50 mL具塞離心管中，均加入超純水5 mL，搖勻后加入10 mL乙酸乙酯提取，渦旋5 min，10000 r/min離心5min，取乙酸乙酯層至氮吹管，殘?jiān)屑尤?0 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1 次，合并乙酸乙酯層，40 ℃氮吹至干，向氮吹管中加入1 mL 20%甲醇溶液復(fù)溶，渦旋1 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜，合并10 份濾液，搖勻，即得蜂蜜空白基質(zhì)。分別制備枸杞、野花、洋槐、枇杷、油菜花和益母草6 種不同蜂蜜基質(zhì)。

4.額外量?jī)r(jià)格指導(dǎo)下，煉廠出口成品油將由過去的減利因素反轉(zhuǎn)為增利因素，增加出口的積極性?；A(chǔ)量政策未實(shí)施前，煉廠測(cè)算出口價(jià)格比留國(guó)內(nèi)出廠價(jià)低600 元/噸?；A(chǔ)量政策實(shí)施后，煉廠測(cè)算出口價(jià)格將比額外量?jī)r(jià)格高1000 元/噸，出口遠(yuǎn)好于留國(guó)內(nèi)作額外量。國(guó)內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的經(jīng)驗(yàn)也驗(yàn)證了此結(jié)論：2016 年中化泉州煉廠因出口200 萬噸汽油，較留國(guó)內(nèi)批發(fā)增利20 億元。

1.3.3.2 制備高質(zhì)量濃度混合外標(biāo)溶劑曲線

分別準(zhǔn)確移取200 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50、100、250、500 μL和2 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100、250、500 μL置于1 mL容量瓶中，用20%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，即得高質(zhì)量濃度混合外標(biāo)溶劑曲線，質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL。

1.3.3.3 制備基質(zhì)及溶劑外標(biāo)曲線

分別準(zhǔn)確移取1.3.3.2節(jié)中高質(zhì)量濃度混合外標(biāo)溶劑曲線各質(zhì)量濃度點(diǎn)100 μL置于1 mL容量瓶中，再用1.3.3.1節(jié)中空白基質(zhì)分別稀釋并定容至刻度，搖勻，即得蜂蜜基質(zhì)曲線，質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL。按上述方法分別制備枸杞、野花、洋槐、枇杷、油菜花和益母草6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的混合外標(biāo)（MNZ、DMZ、RNZ）基質(zhì)曲線。以及使用20%甲醇溶液制備同質(zhì)量濃度外標(biāo)溶劑曲線。

1.3.3.4 基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算

考察不同種類蜂蜜的基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱，以曲線斜率計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，按式（1）[21]計(jì)算：

式中：k1為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；k2為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值小于15%時(shí)，則表明不存在基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值超過20%，則表明存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)[22-23]，絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)。若基質(zhì)效應(yīng)值為正值，則存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，若為負(fù)值，則存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。

1.3.4 檢測(cè)條件

1.3.4.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流速0.40 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。流動(dòng)相體系：A為甲醇、B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序見表1。

表1 MNZ、DMZ、RNZ分離的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for the separation of MNZ,DMZ and RNZ

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式；氣簾氣壓力20 psi；離子化電壓5500 V；溫度550 ℃；噴霧氣壓力50 psi；輔助加熱氣壓力60 psi；噴撞氣：中等；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；監(jiān)測(cè)離子參數(shù)見表2。

表2 MNZ、DMZ、RNZ特征離子質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometric parameters for MNZ,DMZ and RNZ

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)響應(yīng)為縱坐標(biāo)作圖，繪制曲線圖，各曲線線性方程相關(guān)系數(shù)R均大于0.99，線性回歸曲線見表3。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式，各蜂蜜基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物的影響見圖1。由圖1可知，6 種蜂蜜對(duì)MNZ、DMZ、RNZ均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，且各目標(biāo)物所受抑制效應(yīng)的強(qiáng)度也存在差異。

表3 各蜂蜜中目標(biāo)物基質(zhì)曲線線性方程Table 3 Calibration equations for MNZ,DMZ and RNZ in honeys from different floral origins

圖1 不同蜂蜜的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物的影響Fig.1 Matrix effect of honeys from different floral origins

2.2 流動(dòng)相考察

由于酸性色譜條件有利于正離子模式下的離子化[24]，對(duì)色譜條件流動(dòng)相進(jìn)行考察，篩選乙腈-水（含0.1%甲酸）系統(tǒng)、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）系統(tǒng)、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）系統(tǒng)和甲醇-水（含0.1%甲酸）系統(tǒng)，并優(yōu)化流動(dòng)相梯度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 種流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)物的測(cè)定并無明顯影響。因此，選擇對(duì)色譜柱損耗較小的甲醇-水（含0.1%甲酸）流動(dòng)相系統(tǒng)，優(yōu)化后的圖譜見圖2。

圖2 目標(biāo)化合物離子通道圖Fig.2 Chromatograms of MNZ,DMZ and RNZ using methanol-0.1%formic acid solution as mobile phase

2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限結(jié)果

配制目標(biāo)化合物溶劑曲線，以MNZ-D4、DMZ-D3、RNZ-D3分別作為MNZ、DMZ、RNZ的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析，MNZ、DMZ、RNZ在1.0～100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.99。通過梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液法[25]，獲得色譜信噪比為3時(shí)的目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度作為儀器檢出限（limit of detection，LOD），信噪比為10時(shí)的目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度作為儀器定量限（limit of quantitation，LOQ）。通過儀器檢測(cè)，LOD為0.7 ng/mL，即0.07 μg/kg。LOQ為2 ng/mL，即0.2 μg/kg。

2.4 前處理優(yōu)化

蜂蜜中含有氨基酸、糖類、有機(jī)酸和少量蛋白質(zhì)等成分，不但會(huì)污染質(zhì)譜離子源，而且會(huì)影響目標(biāo)化合物的測(cè)定[26]。在日常檢測(cè)中，蜂蜜的基質(zhì)干擾對(duì)硝基咪唑類目標(biāo)物的測(cè)定具有較大影響，需要不斷更改流動(dòng)相系統(tǒng)或梯度優(yōu)化分離效果，并用標(biāo)準(zhǔn)溶液重新校正，使測(cè)定工作變得繁瑣。為了提高檢測(cè)效率，節(jié)約成本，在乙酸乙酯提取基礎(chǔ)上，設(shè)置凈化流程降低蜂蜜中雜質(zhì)干擾，以雜質(zhì)干擾較為嚴(yán)重的枇杷蜂蜜作為基質(zhì)，考察用C18、PEP、PCX三種固相萃取小柱對(duì)蜂蜜基質(zhì)0.5 μg/kg加標(biāo)的乙酸乙酯提取液中目標(biāo)化合物的凈化效果，篩選最佳凈化方法。各固相萃取柱凈化情況見圖3。

由圖3可知，3 種凈化小柱對(duì)蜂蜜中MNZ和RNZ均有一定的凈化效果，但經(jīng)C18和PEP小柱凈化所得圖譜依然存在較為明顯的雜峰干擾，而PCX小柱凈化對(duì)MNZ、DMZ和RNZ的蜂蜜雜峰消除更為明顯，已基本無任何雜質(zhì)干擾。這可能與固相萃取柱填料性質(zhì)及吸附作用有關(guān)。C18柱為十八烷基鍵合硅膠柱，對(duì)脂類、色素及芳香族化合物成分具有明顯吸附作用[27-28]。PEP柱為官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，表面同時(shí)具有親水性和憎水性基團(tuán)，對(duì)各類極性、非極性化合物具有較均衡的吸附作用。PCX柱為混合型陽(yáng)離子交換柱，是以陽(yáng)離子交換混合機(jī)理的水可浸潤(rùn)型聚合物為基質(zhì)的固相萃取柱，能提供雙重保留模式：即離子交換與反相保留，填料為C18非極性/丙基苯磺酸基聚合而成，在pH 0～14.0范圍內(nèi)都很穩(wěn)定，具有較大的結(jié)合容量[29]。與C18柱和PEP柱相比，PCX柱兼有吸附和反相吸附混合作用力，在離子交換作用力的基礎(chǔ)上還增加了非極性作用力，具有更好的凈化效果[30]，因此，本方法設(shè)計(jì)PCX固相萃取柱凈化有利于提升檢驗(yàn)方法的專屬性。

圖3 目標(biāo)化合物定量離子通道圖Fig.3 Effect of different solid phase extraction cartridges on the purification of MNZ,DMZ and RNZ

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

以MNZ、DMZ、RNZ檢測(cè)均為陰性且基質(zhì)抑制效應(yīng)較為明顯的枇杷蜂蜜為基質(zhì)，設(shè)定回收加標(biāo)量0.2、1.0、2.0、5.0 μg/kg，每組每個(gè)添加水平平行6 份，按1.3.2.1節(jié)和1.3.2.3節(jié)方法進(jìn)行前處理。實(shí)驗(yàn)回收率和精密度測(cè)定結(jié)果見表4。MNZ回收率范圍為95.0%～101.0%，DMZ回收率范圍為95.7%～101.4%，RNZ回收率范圍為96.0%～100.7%。以MNZ-D4、DMZ-D3、RNZ-D3分別作為MNZ、DMZ、RNZ的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析，受基質(zhì)效應(yīng)的影響更小，測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，具有良好的精密度。

表4 實(shí)驗(yàn)回收率和精密度Table 4 Recoveries and precision for spiked loquat honey

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

2021年10—12月，本實(shí)驗(yàn)組用此方法對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買的蜂蜜樣品進(jìn)行MNZ、DMZ、RNZ殘留量檢測(cè)，共計(jì)50 批次，結(jié)果均為未檢出，定性結(jié)果與平行實(shí)驗(yàn)室相同。50 批次蜂蜜檢測(cè)圖譜均無明顯雜質(zhì)峰干擾，無需更換流動(dòng)相系統(tǒng)或梯度，既提高檢測(cè)效率，又確保了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立一種蜂蜜中MNZ、DMZ、RNZ的測(cè)定方法，在GB/T 23410—2009《蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》方法的基礎(chǔ)上，選用混合陽(yáng)離子交換柱凈化提取液，并優(yōu)化液相條件。以MNZ-D4和RNZ-D3分別作為MNZ和RNZ的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定性定量測(cè)定，該方法在1.0～100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，LOD為0.07 μg/kg，LOQ為0.2 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)添加量在0.2、1.0、2.0、5.0 μg/kg時(shí)，MNZ、DMZ、RNZ的加標(biāo)平均回收率為95.0%～101.4%，表明測(cè)定結(jié)果受蜂蜜基質(zhì)效應(yīng)影響較小，結(jié)果更加準(zhǔn)確。且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.7%，具有良好的精密度。結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，能夠滿足蜂蜜中MNZ、DMZ和RNZ的日常檢測(cè)。