楊子江，張麗紅，廖國周，田 梅，呂東霖，何 穎，葛長榮，王桂瑛,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201）

諾鄧火腿產(chǎn)于云南省大理州云龍縣諾鄧古村，是我國的傳統(tǒng)美食之一，其以當(dāng)?shù)厣B(yǎng)的諾鄧黑豬為原料，采用獨特的諾鄧井鹽腌制，經(jīng)過復(fù)雜的加工工序腌制發(fā)酵成熟，具有獨特的風(fēng)味和質(zhì)地，與宣威火腿、鶴慶圓腿并稱為云南三大著名火腿[1-2]。發(fā)酵成熟的諾鄧火腿醇厚馨香，切口新鮮嫩紅，口感純正，深受消費者的喜愛[3]。

肌肉顏色是評價干腌火腿食用品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是消費者對于干腌火腿可接受性的最直觀指標(biāo)，影響干腌火腿的可銷售性[4-5]。因此，在加工和貯藏過程中如何保持干腌火腿良好的色澤狀態(tài)一直是研究熱點[6]。干腌火腿的色澤主要由肌紅蛋白（myoglobin，Mb）和血紅蛋白（hemoglobin，Hb）的含量決定，特別是Mb的化學(xué)形式和含量[7]。硝鹽（亞硝酸鹽和硝酸鹽）是國家認(rèn)可并允許在肉制品中使用的一種食品添加劑，人們常常將其應(yīng)用于干腌火腿的加工過程中以促進其發(fā)色[8-9]。Skibsted[10]報道，在加硝干腌火腿中，其紅色色澤的主要化學(xué)成分為亞硝基肌紅蛋白（nitroso myoglobin，NOMb）。然而，殘留在干腌火腿中的亞硝酸鹽在一定條件下會與仲胺反應(yīng)生成亞硝胺，容易致畸致癌，這引起了人們的廣泛關(guān)注[11-12]。因此，國外的著名火腿，如帕爾瑪塞拉諾和伊比利亞火腿等在腌制過程中都不添加硝鹽，但仍然表現(xiàn)出誘人的鮮紅色[13]。Parolari等[14]研究發(fā)現(xiàn)，無硝帕爾瑪火腿紅色素的紫外-可見光光譜顯著不同于加硝干腌火腿。Wakamatsu等[15]提取純化帕爾瑪火腿紅色素，通過熒光光譜、高相液相色譜和質(zhì)譜檢測，結(jié)果證實無硝帕爾瑪火腿中紅色素的主要化學(xué)成分為Zn-原卟啉IX（Zn protoporphyrin IX，ZnPP）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)無硝伊比利亞火腿紅色素的主要化學(xué)成分也為ZnPP，由此推斷，在無硝干腌火腿中，紅色色澤的主要貢獻者為ZnPP[16]。

目前國內(nèi)生產(chǎn)干腌火腿也不添加硝鹽，但有關(guān)國內(nèi)無硝干腌火腿紅色色澤的主要化學(xué)成分還鮮見報道。干腌火腿的色澤受到其獨特的加工方式、加工時間、原料豬品種、添加劑和微生物等多種因素的影響[17]。根據(jù)產(chǎn)地氣候條件和文化傳統(tǒng)不同，各干腌火腿的加工工藝略有差異[18]。Bou等[19]報道，干腌火腿的加工工藝和選取的原料肉可能對紅色素的形成產(chǎn)生影響。Stani?i?等[20]以不同原料豬種為研究對象，發(fā)現(xiàn)在不同豬種中，其肌紅蛋白的各化學(xué)形態(tài)有所不同。李享等[21]以三元豬肉和長白山黑豬肉為原料肉，加工廣式臘腸，結(jié)果表明臘腸瘦肉部分的紅度值（a*）受原料肉來源的影響。Liu Hui等[22]報道，在肉制品中添加NaCl會對肌紅蛋白的構(gòu)象產(chǎn)生影響。Liu Hui等[23]也研究報道，不同的NaCl處理會導(dǎo)致肌紅蛋白中血紅素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。國內(nèi)生產(chǎn)的干腌火腿與國外相比，所采用的加工工藝、原料豬品種和NaCl添加量等都有所差異，因此有必要鑒定國內(nèi)無硝干腌火腿中紅色素的化學(xué)本質(zhì)?；诖?，本研究旨在通過紫外-可見光光譜（ultraviolet spectroscopy，UVVis）、熒光光譜、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）及傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析諾鄧火腿紅色素的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，闡明諾鄧火腿中紅色素的化學(xué)本質(zhì)，以期為諾鄧火腿的色澤調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用3 頭同批次飼養(yǎng)、日齡相同、體質(zhì)量相近的諾鄧黑豬，屠宰后取6 條后腿，按照諾鄧當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)加工工藝（鮮腿的選擇、修整、去血水、噴酒、上鹽、抹鹽泥、腌制和上掛發(fā)酵8 道工序）在云南省瑞通牧業(yè)科技開發(fā)有限公司進行加工，腌制發(fā)酵時間為2018年10月—2020年10月。

ZnPP 美國Enzo公司；原卟啉IX 上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)藥品和試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；固相萃取儀 天津市富城達科技有限公司；Classic C18型固相萃取小柱（1000 mg/6 mL） 德國西蒙-奧德里奇生物與化學(xué)制品有限公司；UV-1800雙光束紫外分光光度計 日本島津公司；Synergy H1型全波長熒光酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；Vanquish Q Exactive HFX LC-MS 美國賽默飛世爾科技公司；ALPHA型紅外光譜儀、Avance NEO 600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

諾鄧火腿經(jīng)洗霉、修割后，取下股二頭肌部分，去除肉眼可見的脂肪和結(jié)締組織，放入斬拌機攪碎，將斬拌后的肉糜樣品真空包裝，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，實驗前將樣品置? ℃緩慢解凍，樣品進行3 次重復(fù)分析測定。

1.3.2 鄧火腿紅色素的提取

稱取5.00 g絞碎火腿肉糜樣品于50 mL離心管中，加入25 mL 75%丙酮溶液，將離心管浸入冰中，使用高速分散器以10000 r/min高速勻漿30 s，在冰浴條件下，靜置提取20 min，整個提取過程在避光條件下進行。然后以4 ℃、10000 r/min離心5 min，所得上清液通過濾紙過濾并收集到避光離心管中，樣品殘渣再加入25 mL 75%丙酮溶液重復(fù)上述步驟提取1 次，合并2 次提取所得上清液并搖勻。

1.3.3 諾鄧火腿紅色素的分離純化

使用微固相萃取裝置對75%丙酮溶液提取所得的紅色素粗提液進行純化。將粗提液用蒸餾水1∶1（V/V）稀釋，隨后轉(zhuǎn)移到一次性C18柱上進行純化，先依次加入10 mL甲醇和10 mL蒸餾水預(yù)洗活化C18固相萃取小柱，然后使待凈化液以1 mL/min的速率過柱，待樣品溶液流盡后，再加入15 mL蒸餾水洗滌柱子，最后用10 mL 75%丙酮溶液洗脫截留在C18固相萃取小柱上的紅色物質(zhì)，收集純化洗脫液。

1.3.4 諾鄧火腿紅色素的UV-Vis測定

純化紅色素提取液通過UV-1800雙光束紫外分光光度計檢測。以75%丙酮溶液作為參比溶液，掃描速率為中速，掃描間隔為0.2 nm，在190～900 nm的波長范圍內(nèi)進行全波段掃描，確定紅色素的特征吸收峰。再向純化所得紅色素提取液中添加1%的HCl溶液（HCl∶溶液紅色素提取液，V/V，下同），重復(fù)上述操作記錄紫外吸收光譜。

1.3.5 諾鄧火腿紅色素的熒光光譜測定

移取純化后的紅色素提取液200 μL，加樣到96 微孔板上，以75%丙酮溶液作為空白，使用Synergy H1型全波長熒光酶標(biāo)儀記錄紅色素的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)波長420 nm，掃描間隔1 nm，溫度20 ℃，記錄500～700 nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。再向純化所得紅色素提取液中添加不同比例（0.5%、0.7%、1%）的HCl溶液，重復(fù)上述操作記錄熒光發(fā)射光譜。

為了衡量算法的檢測精度，定義均方根誤差(Root Mean Square Error,RMSE)，其數(shù)學(xué)表達式如下：

1.3.6 諾鄧火腿紅色素的UPLC-MS/MS測定

1.3.6.1 樣品前處理

取1 mL紅色素純化樣品，去除丙酮后進行冷凍干燥，向凍干樣中加入400 μL 80%甲醇溶液，渦旋30 s混勻，4 ℃冰浴超聲30 min，-40 ℃靜置1 h，然后4 ℃靜置0.5 h，于4 ℃、12000 r/min離心15 min。最后移取200 μL上清液，加入內(nèi)標(biāo)（0.14 mg/mL二氯苯丙氨酸）5 μL，轉(zhuǎn)入進樣小瓶中待檢測。

1.3.6.2 UPLC-MS/MS分析

基于UPLC-MS/MS分析平臺（Waters,UPLC;Thermo,Q Exactive），通過ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）液相色譜柱對目標(biāo)化合物進行色譜分離。柱溫40 ℃；流動相：A為水+0.05%甲酸，B為乙腈；流速0.3 mL/min；進樣量6 μL；自動進樣器溫度4 ℃。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫程序Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

質(zhì)譜檢測參數(shù)：正模式：加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速45 arb；輔助氣流速15 arb；尾氣流速1 arb；電噴霧電壓3.0 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；S-Lens RF Level，30%。負(fù)模式：加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速45 arb；輔助氣流速15 arb；尾氣流速1 arb；電噴霧電壓3.2 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；S-Lens RF Level，60%。掃描模式：一級全掃描（m/z70～1050）與數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率：70000（一級質(zhì)譜）；17500（二級質(zhì)譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離。

1.3.7 諾鄧火腿紅色素的FTIR測定

1.3.8 諾鄧火腿紅色素的NMR測定

使用Bruker AV-600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，配備5 mm反向幾何1H/13C探頭進行檢測。將紅色素樣品（20 mg）溶于0.5 mL氘代DMSO試劑中，使用超聲溶解，高分辨率1H-NMR和13C-NMR分別在600 MHz和150 MHz下被記錄，工作溫度為25 ℃。以1H的內(nèi)部DMSO-D6信號（δH=2.09）和13C的內(nèi)部DMSO-D6信號（δC=30.89）為參考。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與圖表繪制

采用Origin 2019和Mestre Nova 11.0.0軟件分析數(shù)據(jù)及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾鄧火腿紅色素的UV-Vis光譜分析

如圖1所示，諾鄧火腿紅色素在Soret帶附近有一個強吸收峰（416 nm），在可見光區(qū)（Q帶）有兩個吸收峰（546 nm和584 nm），并且Q帶的兩個吸收峰具有高度對稱性。與75%丙酮溶液中的ZnPP標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜（416、547、585 nm）比對后，二者的吸收峰高度相似，此研究結(jié)果與Wakamatsu等[15]報道相似。用75%丙酮溶液提取的帕爾瑪火腿紅色素，在417 nm處有最大吸收峰，546 nm和584 nm處有兩個對稱吸收峰。將諾鄧火腿紅色素提取液用1% HCl溶液處理后，相比于75%丙酮溶液提取的火腿紅色素，酸處理后的火腿紅色素在Soret帶的吸收峰發(fā)生藍移，在396 nm附近處有最大吸收峰，并且Q帶的吸收峰由高度對稱的兩個峰變?yōu)椴粚ΨQ的4 個峰（498、538、579、624 nm）。Q帶的4 個吸收峰是卟啉配體的特征紫外-可見吸收峰，并且4 個峰的相對強度隨著波長的增加而逐漸減弱[24-25]。強酸處理會導(dǎo)致金屬離子從卟啉環(huán)中解離出來，當(dāng)金屬離子脫離后，使卟啉分子的不對稱性提高，表現(xiàn)為Q帶吸收峰的個數(shù)增加，Soret帶發(fā)生位移，這是卟啉配合物脫除金屬離子的光譜特征[26]。與酸化丙酮溶液中原卟啉IX（protoporphyrin IX，PPIX）標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜（394、490、525、561、617 nm）比對，發(fā)現(xiàn)其吸收峰高度相似，都有1 個大吸收峰和4 個小吸收峰，但相對于標(biāo)準(zhǔn)品，酸處理后的火腿紅色素吸收峰整體發(fā)生了紅移，這可能是由于添加的酸含量不足以使所有金屬卟啉都脫去金屬離子變?yōu)檫策潴w（PPIX）[27]。

圖1 諾鄧火腿紅色素的UV-Vis光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra of red pigment in Nuodeng dry-cured ham

2.2 諾鄧火腿紅色素的熒光光譜分析

熒光是一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象，激發(fā)的熒光波長與物質(zhì)的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)相關(guān)，從而可以對如卟啉類化合物等的不同熒光物質(zhì)進行快速有效地鑒別[28-29]。如圖2A所示，75%丙酮溶液中諾鄧火腿紅色素的熒光光譜圖，以420 nm波長激發(fā)，在590 nm處有一個強熒光發(fā)射峰，644 nm處有一個弱熒光發(fā)射峰，這兩個熒光峰是ZnPP的特征熒光發(fā)射峰，與75%丙酮溶液中的ZnPP標(biāo)準(zhǔn)品熒光發(fā)射峰高度重合（590、644 nm）。這與M?ller等[30]的研究報道相似。Bou等[31]也報道，ZnPP在590 nm的發(fā)射波長下有最強熒光發(fā)射峰，與本研究結(jié)果相同。卟啉本身也會發(fā)出強烈的紅色熒光，其熒光發(fā)射峰如圖2B所示。卟啉與金屬配位后（比如鋅離子），仍然會發(fā)射強烈熒光，但與部分金屬離子配位（比如鐵離子），其熒光發(fā)射峰會減弱，甚至熒光消失，有研究認(rèn)為鐵卟啉是非熒光活性的，也有研究認(rèn)為鐵卟啉可以發(fā)射597 nm的熒光[15,32]。但鐵卟啉的熒光現(xiàn)象顯著不同于本研究所得到的結(jié)果，表明該紅色素化合物的結(jié)構(gòu)不是鐵卟啉。當(dāng)添加不同比例的HCl溶液處理后，紅色素提取液的熒光光譜發(fā)生顯著變化。隨著HCl溶液比例的增加，590 nm處熒光發(fā)射峰的熒光強度逐漸降低，644 nm處熒光發(fā)射峰向短波長方向移動并且熒光強度逐漸減低，這是由于強酸的處理使得金屬離子不斷從卟啉環(huán)中解離出來，從而導(dǎo)致熒光發(fā)射峰發(fā)生變化。當(dāng)添加1% HCl溶液時，其在590 nm處的熒光發(fā)射峰消失，在633 nm處有單一熒光發(fā)射峰，與PPIX標(biāo)準(zhǔn)品的熒光發(fā)射峰相似。Parolari等[33]報道，可以用激發(fā)波長400 nm，發(fā)射波長630 nm處的熒光強度定量PPIX的含量，本研究得到的PPIX最大熒光發(fā)射波長在633 nm，稍有偏差，可能是由儀器誤差造成。

圖2 諾鄧火腿紅色素的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of red pigment in Nuodeng dry-cured ham

2.3 諾鄧火腿紅色素的UPLC-MS/MS鑒定

采用Compound discoverer軟件對UPLC-MS/MS檢測數(shù)據(jù)進行提取分析，通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息推導(dǎo)可能的分子式，利用主要碎片離子信息在數(shù)據(jù)庫中檢索匹配，并搜索公共數(shù)據(jù)庫Metlin及HMDB進行補充。如表2所示，在正、負(fù)離子模式下（一級質(zhì)譜）均檢測出ZnPP的存在。在正離子模式下，保留時間為11.710 min的組分，其分子離子峰為m/z625.1779[M+H]+，通過分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息，鑒定得出此化合物為ZnPP，其二級質(zhì)譜圖如圖3A所示，m/z566.1638[M-58]+處的碎片離子峰表明ZnPP中—CH2COO的丟失，m/z506.1468[M-118]+處的碎片離子峰由ZnPP中側(cè)鏈2分子的—CH2COOH丟失形成，在m/z165.2512和m/z149.0260處分別發(fā)現(xiàn)ZnPP卟啉環(huán)中—C9H11N O2和—C8H7N O2的特征碎片離子峰，在m/z59.0501處發(fā)現(xiàn)ZnPP側(cè)鏈—CH2COOH的碎片離子峰。在負(fù)離子模式下，保留時間為11.706 min的組分，其分子離子峰為m/z623.1614[M-H]-，比對后也鑒定為ZnPP，其二級質(zhì)譜圖如圖3B所示，在m/z165.1929處發(fā)現(xiàn)ZnPP中—C9H11NO2的碎片離子峰，在m/z59.6335處發(fā)現(xiàn)ZnPP側(cè)鏈—CH2COOH的碎片離子峰。M?ller等[30]報道，Zn以5 種同位素的形式存在，分別為64Zn：45.89%，66Zn：27.81%，67Zn：4.11%，68Zn：18.57%，70Zn：0.62%，同時在伊比利亞火腿紅色素負(fù)離子模式質(zhì)譜圖中觀察到m/z623.1614的最強離子峰，認(rèn)為此為ZnPP去質(zhì)子化的結(jié)果，與本研究結(jié)果相同。

表2 諾鄧火腿紅色素的UPLC-MS/MS分析結(jié)果Table 2 Analysis of red pigment in Nuodeng ham by UPLC-MS/MS

圖3 諾鄧火腿紅色素的二級質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of red pigment in Nuodeng dry-cured ham

2.4 諾鄧火腿紅色素的FTIR分析

FTIR是一種重要的非破壞性分析方法，它可以提供樣品中的官能團信息，已被廣泛用于研究色素的結(jié)構(gòu)特征[34]。由圖4可知，紅色素在3008.69、2924.20、2852.60、1709.84、1553.75、1464.96、1411.98、1377.61、937.98、721.74 cm-1處有吸收峰，這些吸收峰反映了紅色素的官能團信息。在特征頻率區(qū)：3008.69 cm-1處的吸收峰歸屬為烯烴（C＝C—H）上的C—H伸縮振動[35]；2924.20 cm-1和2852.60 cm-1處的吸收峰是由甲基（—CH3）和亞甲基（—CH2—）的不對稱和對稱伸縮振動形成的[36]；在1709.84 cm-1處還有一個吸收峰，歸屬為羧基（—COOH）中C＝O的伸縮吸收[37]。FTIR指紋區(qū)的譜帶對于鑒定分子結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[38]。在指紋區(qū)：1553.75 cm-1處的吸收峰為卟啉環(huán)上C＝N的伸縮吸收；1411.98～1464.96 cm-1的吸收歸屬為吡咯環(huán)的骨架振動或芳香族的C＝N伸縮振動；1377.61 cm-1是—CH3彎曲振動所形成的特征吸收峰[39]；1245.86 cm-1和1285.96 cm-1的吸收峰歸屬為—COOH中—C—OH的伸縮；烷基鏈C-C的伸縮導(dǎo)致在1058.27 cm-1和1088.34 cm-1處形成吸收峰；937.98 cm-1處是—COOH中—C—OH的面外彎曲振動吸收峰；在721.74 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，可以歸屬為—CH2—的搖擺振動[40]。諾鄧火腿紅色素的紅外光譜結(jié)果具有卟啉特征官能團的吸收振動，并且在紅外光譜中并未發(fā)現(xiàn)卟啉環(huán)上的N—H伸縮振動（大約在3412.00 cm-1處有較寬的吸收峰）[41]，這表明已有金屬離子進入到卟啉環(huán)中，與卟啉環(huán)配位形成金屬卟啉配合物，結(jié)合前面研究結(jié)果，該配合物很可能為ZnPP。

圖4 諾鄧火腿紅色素的FTIR光譜圖Fig.4 FTIR spectrum of red pigment in Nuodeng dry-cured ham

2.5 諾鄧火腿紅色素的NMR譜峰歸屬

圖5為ZnPP的化學(xué)結(jié)構(gòu)，對諾鄧火腿紅色素的核磁數(shù)據(jù)進行歸屬如下：1H-NMR（600 MHz，DMSO-D6）分析如下：δ5.32～5.30（m,3H,H-45,46,47）歸屬為卟啉環(huán)上的3 個H信號，δ5.29～5.24（m,6H,H-48,49,50,51,52,53）是卟啉環(huán)側(cè)鏈2 個乙烯基上的6 個H信號，δ2.13～2.11（m,6H,H-35,36,37）歸屬為卟啉環(huán)側(cè)鏈3 個亞甲基上的6 個H 信號，δ1.53（t,3H,J=9.0 Hz,H-34,44）歸屬為卟啉環(huán)上的1 個H 和側(cè)鏈1 個亞甲基上的2 個H 信號，δ1.28～1.21（m,12H,H-23,24,32,33）歸屬為卟啉環(huán)側(cè)鏈4 個甲基上的12 個H 信號，沒有檢測到卟啉環(huán)側(cè)鏈羧基中的核磁H 信號，羧基中的H 屬于活潑H，在N M R 檢測時可能沒有信號出現(xiàn)[42]；13C-NMR（150 MHz,DMSO-D6）分析如下：δ174.63（C-39），δ129.46（C-3），δ129.42（C-2），δ34.05（C-37），δ28.86（C-34），δ22.27（C-35），δ13.82（C-23,24）。諾鄧火腿紅色素的1H-NMR歸屬與目標(biāo)化合物ZnPP結(jié)構(gòu)一致，13C-NMR歸屬后發(fā)現(xiàn)有部分13C信號峰的丟失。

圖5 ZnPP化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structure of Zn protoporphyrin IX

3 結(jié)論

采用75%丙酮溶液提取，結(jié)合C18固相萃取小柱對諾鄧火腿紅色素進行分離純化。UV-Vis檢測結(jié)果表明在416 nm處有1 個強吸收峰，546 nm和584 nm處有2 個弱對稱吸收峰，這是金屬卟啉（具有高度對稱性）的特征吸收峰；經(jīng)強酸處理后，由于金屬離子解離，對稱吸收峰消失，出現(xiàn)4 個弱吸收峰（498、538、579、624 nm）。以420 nm波長激發(fā)，紅色素在590 nm處有1 個強熒光發(fā)射峰，644 nm處有1 個弱熒光發(fā)射峰，與ZnPP標(biāo)準(zhǔn)品的熒光光譜比對后，高度重合，證明卟啉環(huán)中的金屬離子為Zn2+，經(jīng)強酸處理后，隨著Zn2+解離，590 nm處熒光發(fā)射峰消失，633 nm處出現(xiàn)單一熒光發(fā)射峰，與PPIX熒光發(fā)射峰高度相似。進一步經(jīng)UPLC-MS/MS檢測，在正離子（m/z625.1779[M+H]+）和負(fù)離子（m/z623.1614[M—H]-）模式下均鑒定出ZnPP的存在。在FTIR中檢測到—CH3、—CH2—、C＝O、卟啉環(huán)C＝N、羧基中—C—OH和烯烴上的C—H等的伸縮振動，這些都是卟啉環(huán)上的特征官能團。解析諾鄧火腿紅色素1H-NMR發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)化合物ZnPP匹配完整，綜上所述，諾鄧火腿紅色素的化學(xué)本質(zhì)為ZnPP。