李桂蓮 方敏 姜靖偉 王瑞歡 錢程宇,3 于晉杰,4 曹濱,4許達 趙秀芹 李馬超 劉海燦 孫琳 朱渝 萬康林

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2021年全球兒童結(jié)核病發(fā)病和死亡例數(shù)分別占總發(fā)病例數(shù)和總死亡例數(shù)的11%和14%[1]。兒童結(jié)核病的流行情況不僅反映一個國家或地區(qū)近期人群結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的感染現(xiàn)狀，還可以作為遠期結(jié)核病疫情的預測指標。因此，應加強對兒童結(jié)核病的預防、診斷、治療和管理。近年來，以MTB核酸為檢測靶標的分子生物學檢測技術(shù)及以機體特異性結(jié)核免疫應答為檢測靶標的γ-干擾素釋放試驗的廣泛應用大大提高了兒童結(jié)核病的檢出率。但應注意到，培養(yǎng)獲取MTB依然是兒童結(jié)核病診斷的“金標準”及開展后續(xù)檢測和研究的基礎(chǔ)。耐藥監(jiān)測，傳染源、暴發(fā)和流行的認定，以及研究兒童結(jié)核病的發(fā)病機制均依賴于MTB的獲得。由于肺結(jié)核患兒不會咳痰或痰菌載量小，以及低齡患兒往往將痰液吞咽至消化道中等原因，致使胃液替代痰液成為兒童特別是學齡前兒童肺結(jié)核患者進行病原學檢測的重要樣本類型。但目前兒童結(jié)核病的培養(yǎng)陽性率普遍偏低，因此，優(yōu)化胃液樣本MTB培養(yǎng)和鑒定的實驗流程，有助于提高兒童結(jié)核病病原學確診率。

傳統(tǒng)的MTB培養(yǎng)方法包含堿處理步驟，該步驟可起到殺滅雜菌和釋放樣本中MTB的作用，同時，可以起到中和胃酸的作用。盡管樣本-堿處理混合液經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS；pH=6.80)中和離心后再進行接種，但堿處理過程可能會導致樣本中的MTB失活或丟失進而影響檢出率。因此，筆者設(shè)計了MTB培養(yǎng)的“兩步法”，即：先直接進行MTB培養(yǎng)，在培養(yǎng)基上增菌后再行堿處理，以期提高MTB的陽性檢出率。同時，樣本-混合液經(jīng)PBS調(diào)節(jié)后的pH值可能會影響分離培養(yǎng)的陽性率及新型菌種鑒定方法(MTB抗原-膠體金法)的結(jié)果準確率。為進一步驗證，筆者通過模擬樣本探討pH值改變對MTB抗原-膠體金檢測卡判讀結(jié)果的影響，以及PBS緩沖液對樣本-堿性前處理混合液pH值的調(diào)節(jié)作用，以期優(yōu)化當前肺結(jié)核患兒胃液標本的MTB培養(yǎng)和鑒定流程。

資料和方法

一、研究對象

采用回顧性研究方法，搜集2019年7月至2020年7月就診于四川省涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院、四川大學華西第二醫(yī)院和首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院入院治療的疑似肺結(jié)核患兒作為研究對象，其中，經(jīng)臨床綜合診斷為肺結(jié)核者68例(病例組)，其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病者2例(對照組)。研究對象的納入和排除標準參考文獻[2]。患兒于入院第2天晨起空腹采集胃液。胃管經(jīng)鼻進入胃中，采用注射器抽取2～8 ml胃液，分裝后于-80 ℃保存，用于后續(xù)細菌培養(yǎng)。本研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會批準(2018-96)，所有研究對象的監(jiān)護人均簽署知情同意書。

二、主要試劑

1.主要試劑：Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)管、OADC營養(yǎng)添加劑和PANTA抑菌劑購自美國BD公司。MTB抗原-膠體金檢測卡購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaOH和HCl分別購自廣東省精細化學品工程技術(shù)研究開發(fā)中心、國藥集團化學試劑有限公司、北京市通廣精細化工公司和北京化工廠。Xpert Ultra購自美國賽沛公司。

2.主要試劑配制：(1)OADC-PANTA混合液：按說明書將15 ml OADC營養(yǎng)添加劑與適量 PANTA抑菌劑混合，使用前新鮮配制，每支MGIT 960培養(yǎng)管分裝0.8 ml。(2)PBS溶液(pH=6.8)：稱取KH2PO44.559 g，Na2HPO4·12H2O 11.9977 g，定容至1000 ml蒸餾水，用梅特勒-托利多FE20酸度計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]檢測pH值為6.84，高壓滅菌配用。(3)3%或4%NaOH溶液：稱取3 g或4 g NaOH，定容至100 ml，高壓備用。(4)1%HCl：取1 ml純HCl，加入到99 ml去離子水中。

三、研究方法

1.分枝桿菌培養(yǎng)：每份2 ml胃液樣本中分別取1.8 ml用于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，0.2 ml用于兩步培養(yǎng)法。以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為標準，評價兩步法的檢出效率。(1)分枝桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法：即臨床上常用的堿處理-中和離心法。1.8 ml胃液樣本用等體積的4%NaOH-2.9%枸櫞酸鈉-0.5% N-乙酰半胱氨酸混合液處理15～20 min后，加入適量PBS緩沖液(pH=6.8)定容至45 ml；4 ℃，4000×g離心15 min。棄掉上清，加入2 ml PBS緩沖液(pH=6.8)混勻，分別取0.2 ml和0.5 ml接種于改良羅氏培養(yǎng)基和7H9培養(yǎng)管中。羅氏培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至肉眼可見菌落生長，陰性者觀察滿8周；7H9培養(yǎng)管置BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)至系統(tǒng)報陽，陰性者觀察滿38 d。(2)分枝桿菌兩步培養(yǎng)法：0.2 ml胃液直接接種于改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至20～30 d，如有可疑菌落生長，挑取菌落按照傳統(tǒng)培養(yǎng)法繼續(xù)培養(yǎng)。

2.兩步培養(yǎng)法在不同菌載量樣本中陽性率的確定：為分析兩步培養(yǎng)法在不同含菌量樣本中的陽性檢出率的差異，本研究還對胃液樣本進行Xpert Ultra 檢測，以其報告的結(jié)果作為樣本菌載量的標準。實驗在北京兒童醫(yī)院進行，根據(jù)產(chǎn)品說明書進行操作。取胃液2 ml于無菌離心管中，加入等量3%NaOH溶液進行中和。充分振蕩10～15 s后室溫放置15 min，期間每5 min再充分振蕩混勻1次。置于離心機中4000×g離心15 min。棄上清，離心管中加入2 ml處理液，將剩余的沉淀吹打混勻后加入檢測盒中上機檢測。當MTB DNA檢測陽性時，依據(jù)MTB的Ct值間接反映所檢測樣本中的菌載量，分為高、中、低、非常低、微量。

四、MTB抗原-膠體金檢測

采用MTB抗原-膠體金檢測卡參照說明書對分枝桿菌菌株進行菌種鑒定。采用鹽酸和去離子水配制pH值分別為5、6、7、8、9和10的溶液作為模擬樣本，取100 μl加入檢測孔中，靜置15 min后觀察質(zhì)控線和檢測線顯色情況，以確定檢測卡檢測效果最佳時樣本的最適pH值。實驗重復2次，比較結(jié)果的一致性。

五、樣本-堿性前處理混合液pH值的調(diào)節(jié)

由于堿處理法是進行MTB分離培養(yǎng)樣本前處理的常規(guī)方法，樣本經(jīng)堿處理后通常采用PBS緩沖液(pH=6.8)進行中和及離心后的樣本重懸。合適的樣本-堿性前處理混合液的pH值有利于提高樣本的分離培養(yǎng)陽性率，同時，液體培養(yǎng)基的pH值可能會影響MTB抗原-膠體金檢測卡的結(jié)果判斷。為保證樣本-堿性前處理混合液的pH值在可接受范圍內(nèi)，分別配制4.0%和3.0%的NaOH溶液，并用1%的HCl溶液(pH=0.6)和去離子水分別模擬胃液樣本和中性的痰樣本，將不同濃度的堿溶液與模擬樣本等量混合后，用PBS緩沖液進行不同倍數(shù)稀釋，并用梅特勒-拖利多FE20酸度計檢測不同稀釋倍數(shù)下的pH值(溶液溫度為22.0～23.5 ℃)，以確定堿處理樣本混合液的最佳稀釋倍數(shù)。實驗重復2次，取平均值。

六、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以“百分率/構(gòu)成比(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、兩種方法陽性檢出情況

68份病例組樣本中，18份經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測為陽性，其中，3份樣本分離獲得菌株較早，認為無開展兩步法的必要而未進行兩步法的第二步檢測。病例組其余65份樣本中15份經(jīng)兩步法檢測為陽性。2份對照組的樣本兩種方法檢測均未發(fā)現(xiàn)陽性。兩種方法共分離菌株22株，其中，傳統(tǒng)培養(yǎng)法單獨培養(yǎng)陽性7株(含從未進行兩步法檢測的樣本中分離到的3株菌株)，兩步法單獨培養(yǎng)陽性4株。傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽性檢出率為26.5%(18/68)，兩步法陽性檢出率為23.1%(15/65)，未發(fā)現(xiàn)兩種方法的陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=0.125，P>0.05)。兩步法在傳統(tǒng)培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上將陽性檢出率從26.5%(18/68)提高到32.4%(22/68)。

二、不同菌載量標本兩種方法陽性檢出情況

以Xpert Ultra檢測菌載量為標準進行標本分類，傳統(tǒng)培養(yǎng)法和兩步法在菌載量低級及以上分級樣本中的陽性檢出比例均明顯高于菌載量極低級及以下標本的陽性檢出比例，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為13.082和7.896，P值分別為0.000和0.005)。僅在兩步法中培養(yǎng)陽性的樣本其菌載量在低級及以下。具體見表2。

表1 不同菌載量分級標本經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法和兩步法的陽性檢出情況

三、菌種鑒定結(jié)果及pH值改變對MTB抗原-膠體金檢測卡判讀結(jié)果的影響

共培養(yǎng)出22株菌株，經(jīng)MTB抗原-膠體金檢測卡鑒定，其中，21株被鑒定為MTB，1株被鑒定為非結(jié)核分枝桿菌。在使用MTB抗原-膠體金檢測卡進行鑒定的過程中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)控線和檢測線的顏色深淺不一。進一步用不同pH值的模擬樣本進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當pH值在6～9之間時，膠體金檢測卡質(zhì)控線陽性(顯色強度正常)，檢測線為陰性，和預期結(jié)果一致；當pH值為4和5時，除質(zhì)控線顯示陽性外，檢測線亦顯示出弱陽性，此時判斷結(jié)果容易發(fā)生假陽性現(xiàn)象；當pH值為10時，質(zhì)控線顯色較弱，呈弱陽性，此時判斷結(jié)果容易發(fā)生假陰性現(xiàn)象。具體見圖1。

注 當pH值在6～9之間時，膠體金檢測卡質(zhì)控線陽性(顯色強度正常)，檢測線為陰性，和預期結(jié)果一致；當pH值為4和5時，除質(zhì)控線顯示陽性外，檢測線亦顯示出弱陽性，此時判斷結(jié)果容易發(fā)生假陽性現(xiàn)象；當pH值為10時，質(zhì)控線顯色較弱，呈弱陽性，此時判斷結(jié)果容易發(fā)生假陰性現(xiàn)象圖1 pH值改變對結(jié)核分枝桿菌抗原-膠體金檢測卡判讀結(jié)果的影響

四、樣本-堿性前處理混合液pH值的調(diào)節(jié)

將2 ml模擬胃液樣本(1% HCl)與等量3%或4%的NaOH溶液混合后，用PBS緩沖液(pH=6.8)進行系列倍數(shù)的稀釋，當稀釋倍數(shù)達到原來的10倍或14倍時，混合液的pH值降到10以下；當達到原來的12倍或16倍時，pH值降到8以下。將2 ml 模擬痰樣本(去離子水)與等量3%或4%的NaOH溶液混合后，同樣進行稀釋，當稀釋倍數(shù)達到原來的12倍或16倍時，混合液的pH值降到10以下；當分別達到原來的14倍或18倍時，pH值降到8以下。結(jié)果見表2。

表2 磷酸鹽緩沖液稀釋堿處理樣本混合液(4 ml)后的pH值改變情況

為驗證樣本初始體積對中和混合液的pH值的影響，進一步將4 ml HCl(濃度為1%)與等體積的4% NaOH溶液混勻后，同樣用PBS緩沖液進行系列稀釋，pH值依次為13.08(2倍)、12.63(4倍)、12.08(6倍)、11.60(8倍)、11.21(10倍)、10.65(12倍)、8.73(14倍)、7.89(16倍)、7.62(18倍)、7.46(20倍)、7.36(22倍)、7.29(24倍)、7.23(26倍)、7.18(28倍)和7.14(30倍)，不同稀釋倍數(shù)的pH值分布與2 ml HCl(濃度為1%)+2 ml NaOH(濃度為4%)混合液的相似。

討 論

本研究根據(jù)胃液的特性，設(shè)計了一種利用胃液樣本進行分離培養(yǎng)的兩步法，盡管其陽性檢出率未優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法且工作量和試劑費用高于后者，但觀察到其能分離到傳統(tǒng)培養(yǎng)法未分離到的菌株，可作為傳統(tǒng)培養(yǎng)法的補充應用于高度懷疑但難以診斷的兒童結(jié)核病患者或科學研究中。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)MTB抗原-膠體金檢測卡使用的最適pH值范圍介于6～9之間；證實胃液模擬樣本經(jīng)3%或4%的NaOH處理后，若調(diào)節(jié)其pH值至7～9時，需使用PBS緩沖液(pH=6.8)稀釋至少10或14倍，而痰液模擬樣本經(jīng)3%或4%的NaOH處理后，若調(diào)節(jié)其pH值至7～9時，需使用PBS緩沖液(pH=6.8)稀釋至少12或16倍。這些研究結(jié)果為規(guī)范我國MTB的分離培養(yǎng)提供了科學依據(jù)。

肺結(jié)核是危害兒童健康的嚴重疾病。兒童咳嗽反射弱，排痰量少，經(jīng)常將呼吸道分泌物直接吞咽；嬰幼兒在入睡時，呼吸道的纖毛運動將含有MTB的痰液送至喉部，然后吞咽至胃內(nèi)，在整個夜間會咽下大量呼吸道分泌物，而且夜間胃液分泌量明顯減少，因此，胃液被認為是較好的診斷兒童肺結(jié)核的樣本類型[2]。胃是消化道微生態(tài)系統(tǒng)中的一個特別區(qū)域，由于胃酸的分泌形成了其獨特的生態(tài)環(huán)境和特征性的微生物群落。宏基因組檢測顯示胃液樣本中存在約200多種細菌[3-4]，遠低于呼吸道樣本的369種[5]。雖然宏基因組測序結(jié)果顯示臨床樣本中微生物的種類較多，但在分離培養(yǎng)時由于受到培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件、培養(yǎng)溫度及菌株的生長特性等影響，分離到的細菌種類遠小于宏基因組測序獲得的結(jié)果。本研究采用的羅氏培養(yǎng)基含有5%的孔雀綠，具有一定的抑制雜菌生長的作用。而且結(jié)核可疑樣本的處理通常采用堿處理法，在處理過程中會造成MTB的丟失或失活，從而造成假陰性結(jié)果。綜合以上因素，本研究建立了直接將胃液接種于羅氏培養(yǎng)基進行選擇性增菌后，再將培養(yǎng)基上可疑MTB培養(yǎng)物進行堿處理-中和離心處理的兩步法。

分離培養(yǎng)兩步法的實驗結(jié)果顯示，其陽性檢出率和傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，差異未見統(tǒng)計學意義，而且在傳統(tǒng)培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上使所有結(jié)核病患兒樣本的陽性檢出率提高了5.9%。但兩步法在4份傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測陽性的樣本中檢測結(jié)果為陰性，推測是由于其他的細菌生長快速旺盛，對MTB的生長形成競爭性抑制作用，導致MTB無法生長所致。本研究還發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)培養(yǎng)法和兩步法在菌載量級別為低級及以上的樣本中的陽性檢出比例均高于菌載量極低級及以下的樣本，說明兩步法和其他方法一致，菌載量越高的樣本越容易被檢出。雖然本研究中兩步法的陽性檢出率未見優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，但因其能分離到傳統(tǒng)培養(yǎng)法未分離到的菌株，特別是在菌載量低的樣本中單獨分離到菌株，說明該法在結(jié)核病診斷中有一定的使用價值。但兩步法檢測過程較傳統(tǒng)培養(yǎng)法復雜，工作量及試劑消耗費用等增加，結(jié)果報告時間延長，不適合臨床常規(guī)使用。因此，筆者推薦對臨床難以診斷的高度可疑患者或科研工作中亟需分離到菌株時用兩步法進行檢測，或?qū)εR床中傳統(tǒng)培養(yǎng)法未分離到菌株的結(jié)核病患者將傳統(tǒng)培養(yǎng)法和兩步法結(jié)合，進行MTB的分離培養(yǎng)。這時在兩步法的第一步中，也可嘗試將羅氏培養(yǎng)基換成BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管的方法。本研究的不足之處在于未能比較兩步法在不同胃液形態(tài)、保存時間點和保存溫度下的胃液樣本的陽性檢出率以確定胃液樣本的最佳保存條件，因此，還需要作進一步研究。

在臨床檢驗過程中，采用MTB抗原-膠體金檢測卡對培養(yǎng)物進行菌種鑒定簡便易行。然而，膠體金法是一種對pH值改變極為敏感的方法，過高或過低的pH值可能會使實驗結(jié)果產(chǎn)生假陽性或假陰性[6-7]。在對陽性的BACTEC MGIT 960管的培養(yǎng)液進行菌種鑒定時，筆者發(fā)現(xiàn)不同樣品的檢測卡質(zhì)控線深淺不一，推測這可能因個人胃液中的pH值不盡相同，經(jīng)堿處理后的胃液樣本接種使BACTEC MGIT 960管中培養(yǎng)液的pH值不同所致。筆者也對部分胃液樣本直接接種到BACTEC MGIT 960管后的培養(yǎng)液進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有這些樣本的膠體金檢測卡的質(zhì)控線和檢測均出現(xiàn)了弱陽性。以上這些原因促使筆者采用模擬樣本確定MTB抗原-膠體金檢測卡的最適pH值范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當模擬樣本的pH值<6時，膠體金試紙條的質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)較弱的雜交反應，易導致假陽性的判斷結(jié)果；當pH值>9時，質(zhì)控線的雜交反應較弱，此時易導致假陰性的判斷結(jié)果。由于結(jié)核可疑樣本通常采用堿性前處理法，如果用PBS緩沖液中和的程度不足，在用BACTEC MGIT 960管的菌液進行菌種鑒定時容易導致假陰性結(jié)果，造成漏診。而對于上述提到的胃液樣本直接接種到BACTEC MGIT 960管引起的檢測卡弱陽性事件，由于本研究用的均是結(jié)核病患者的胃液，尚不能分清是MTB導致還是胃液pH值低導致，這僅是促使筆者開展此項研究的原因之一。無論如何，MTB抗原-膠體金檢測卡正確結(jié)果的判讀依賴于菌液的pH值范圍，需要保證菌液在合適的pH值范圍之內(nèi)(介于6～9之間)或?qū)Σ淮_定的結(jié)果用其他方法輔助確定。

結(jié)核樣本接種前通常采用堿溶液進行處理，然后采用pH值為6.8的PBS緩沖液進行中和。中和NaOH終濃度為1.5%或2.0%的胃液或痰液樣本，所需要的PBS緩沖液體積不同。本研究發(fā)現(xiàn)，將2 ml的 3%NaOH或2～4 ml的4%NaOH和胃液樣本等體積混合后，用PBS緩沖液調(diào)節(jié)混合液的pH值到10以下，前者至少需要稀釋至初始混合液的10倍體積，而后者至少需要14倍。同樣，用3%或4%的NaOH處理痰樣本時，則至少需稀釋至初始混合液的12或16倍。結(jié)合臨床應用，筆者認為，若使7 ml的BACTEC MGIT 960培養(yǎng)管添加0.5 ml樣本懸液(此處樣本被稀釋約15倍)后pH值在7～9之間，則酸性樣本無論用3%或4%的NaOH處理、痰液樣本經(jīng)3%的NaOH溶液處理，中和離心倒掉上清后均可取少量沉淀重懸液直接接種；若用4%的NaOH溶液處理痰液(pH≈7)樣本，則應先用PBS緩沖液進行至少3倍稀釋和離心倒掉上清后，再取少量沉淀重懸液接種。如果接種的是羅氏培養(yǎng)基，由于通常使用的50 ml離心管最多使樣本處理液稀釋至12倍，而且最后倒掉上清這一步液體通常倒不干凈，因此，建議無論是何種樣本、何種濃度的NaOH處理均采用酸性羅氏培養(yǎng)基進行接種。本研究的不足之處在于未能對不同pH值的樣本-堿處理混合液的分離培養(yǎng)陽性率進行比較。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，分離培養(yǎng)兩步法的陽性檢出率雖然未見優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，但可作為傳統(tǒng)培養(yǎng)法的補充，以提高胃液樣本總的陽性檢出率，尤其推薦對難以確診的高度可疑肺結(jié)核患兒使用該方法進行檢測。此外，本研究還提供了MTB抗原-膠體金檢測卡使用的最佳pH值范圍，以及不同臨床樣本經(jīng)堿處理后調(diào)到合適pH值時需要用PBS緩沖液(pH=6.8)進行稀釋的體積倍數(shù)。這些研究結(jié)果將為我國改進MTB培養(yǎng)技術(shù)提供基礎(chǔ)科學依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻李桂蓮：醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計分析、獲取研究經(jīng)費；方敏：采集數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、支持性貢獻；姜靖偉、于晉杰、曹濱、許達、趙秀芹和李馬超：實施研究、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、支持性貢獻；王瑞歡和錢程宇：實施研究、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、統(tǒng)計分析；劉海燦：分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、行政/技術(shù)/材料支持；孫琳和朱渝：采集數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導；萬康林：醞釀和設(shè)計實驗、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費、指導