孟令旭，賈彩玲，許春雪，張瀟文，呼 和

(內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，能夠廣泛參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)等過程[1]。細(xì)菌群落對草地生態(tài)系統(tǒng)中土壤養(yǎng)分存儲(chǔ)和植物生長等過程起到了重要作用[2]。此外，細(xì)菌群落通常對環(huán)境變化比較敏感，能夠?qū)χ脖缓屯寥赖拳h(huán)境因素變化迅速作出響應(yīng)，因此經(jīng)常被用來指示生態(tài)系統(tǒng)變化[3]。

動(dòng)物覓食能夠通過采食、踐踏和排泄等行為改變土壤理化性質(zhì)，從而影響土壤細(xì)菌群落[4]。研究表明，動(dòng)物采食通過影響地上植被來改變土壤碳和氮的分配[5]；踐踏能夠改變土壤孔隙度以及水的導(dǎo)流能力；動(dòng)物排泄導(dǎo)致的糞便沉積通過循環(huán)利用營養(yǎng)物質(zhì)，改變了土壤氮含量[4]。這些土壤性質(zhì)的改變嚴(yán)重影響了土壤細(xì)菌群落。以往動(dòng)物覓食對生態(tài)系統(tǒng)影響的研究大多集中在地上植物群落[6-7]。例如，荒漠草原放牧通過降低植物多樣性，調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)功能[8]，降低草原生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力[9]；半干旱草原放牧通過改變植物特征，從而保護(hù)生物多樣性并提高植物群落恢復(fù)力[10]；高寒草原放牧通過影響植物多樣性來調(diào)控草地生產(chǎn)力的分配[11]。然而，細(xì)菌對調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性等方面同樣有著重要作用[12]，如，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[13]和荒漠生物結(jié)皮的穩(wěn)定性[14]。此外，Xun等[15]研究表明細(xì)菌群落維持了土壤氮代謝和磷酸鹽代謝等功能，有利于改善生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能。細(xì)菌在生態(tài)系統(tǒng)中通常不會(huì)以單一個(gè)體的形式存在，他們之間存在競爭或互利共生等相互作用。微生物類群間相互作用不僅能夠影響土壤碳礦化速率[16]，還對土壤甲烷循環(huán)等生態(tài)功能起到了重要作用[17]。Cameron等[18]研究表明土壤細(xì)菌類群間相互作用對維持草地生態(tài)系統(tǒng)的多功能性起到了重要作用。越來越多研究表明，共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)是研究微生物類群間相互作用的重要手段[19-20]。共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)不僅能夠反映物種間復(fù)雜的相互作用，還能夠更好的預(yù)測生態(tài)功能多樣性[21]。然而，我們對于動(dòng)物覓食行為導(dǎo)致的高寒草甸土壤細(xì)菌多樣性和共生模式的改變及其調(diào)控因子的認(rèn)識(shí)還不足。

青藏高原是亞歐大陸最大的地貌單元，其草地面積約占全國草地總面積的三分之一，對全球氣候變化調(diào)節(jié)、水源涵養(yǎng)和生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能等方面具有重要作用[22-23]。此外，青藏高原生態(tài)系統(tǒng)比較脆弱，容易受到氣候變化和人為等因素影響[24]，動(dòng)物覓食則是影響青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵因素。本文通過對牦牛不同覓食強(qiáng)度下土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落的變化進(jìn)行分析，探究青藏高原高寒草甸土壤細(xì)菌群落組成、多樣性和共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)對牦牛覓食的響應(yīng)特征，明確不同覓食強(qiáng)度下土壤理化因子的變化規(guī)律以及對細(xì)菌群落產(chǎn)生的影響，以評估生態(tài)系統(tǒng)的變化過程，這對青藏高原的合理利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究場地位于青藏高原東緣的甘肅省甘南州瑪曲縣中部阿孜畜牧科技示范園區(qū)(33°40′ N，101°52′ E)，該地區(qū)海拔3 650 m，主要土壤類型為亞高山草甸土，草地類型屬于典型高寒草甸草原，氣候?yàn)楦咴箨懶约撅L(fēng)氣候，年均氣溫1.2℃，年均降水量620 mm，主要集中在5—9月，年日照時(shí)間約2 580 h，年平均霜日大于270 d，沒有四季，只有冷暖季之分。牧草每年5月初開始返青，9月開始逐漸枯黃。

2009年開始，在甘南瑪曲阿孜畜牧科技示范園區(qū)附近選擇放牧草地做為樣地，長期以來，該樣地都以自由放牧為主，且放牧?xí)r間和管理模式相同。綜合之前的研究方法[25]，為了減少牦牛覓食距離造成的實(shí)驗(yàn)誤差，根據(jù)草地到牛圈的距離、牦牛的行走路徑、牦牛理論采食量、采食時(shí)間、樣地面積和對應(yīng)的牦牛數(shù)量將其劃分為4個(gè)不同覓食強(qiáng)度梯度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)還充分考慮了牦牛行為和放牧?xí)r長等因素，依次選取距離牛圈入口250 m，500 m和1 000 m的區(qū)域分別作為重度覓食(HFI)、中度覓食(MFI)和輕度覓食(LFI)的采樣區(qū)域[25]，圍封1個(gè)禁止采食區(qū)域作為對照(CK)(圖1)。相對放牧強(qiáng)度(yak units·hm-2)=牧戶存欄數(shù)/不同梯度區(qū)域面積(不同半徑的同心圓面積)[25-26]，計(jì)算得到CK，LFI，MFI和HFI的覓食強(qiáng)度分別為0，2.6，3.5和6.5 yak units·hm-2，牦牛每天采食時(shí)間為8 h。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖

1.2 樣品采集及處理

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

1.4 DNA提取和高通量測序

根據(jù)制造商說明，使用土壤FastDNA試劑盒(MP Biomedical，Carlsbad，CA，USA)從0.5 g土壤中提取DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA質(zhì)量。使用細(xì)菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTA-3′)完成細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)段序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按照AxyPrep DNA(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)凝膠提取試劑盒說明書純化。最后使用Illumina Miseq平臺(tái)測序，去除不明確的堿基和低質(zhì)量序列，最終堿基平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能小于25，堿基序列長度不能低于200 bp，以97%的序列相似性將高質(zhì)量的序列聚類定義為操作分類單元(OTUs)。

1.5 共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

OTU相對豐度被用來構(gòu)建不同覓食強(qiáng)度下的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)，選取每個(gè)處理中至少3個(gè)樣本同時(shí)出現(xiàn)的OTU進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。我們使用基于3個(gè)測量值的集成方法，包括Spearman相關(guān)性和OTU兩兩之間的Bray-Curtis和Jaccard差異，當(dāng)相關(guān)閾值|r|大于0.6且P值小于0.01時(shí)，共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為是類群之間統(tǒng)計(jì)上穩(wěn)健的相關(guān)[27]。利用Brown方法對3種統(tǒng)計(jì)值進(jìn)行合并，然后利用FDR方法對P值進(jìn)行校正以減少獲得假陽性結(jié)果的機(jī)會(huì)[27-28]。最終使用Gephi 0.9.2(https://gephi.org)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

表1 不同覓食強(qiáng)度的土壤理化性質(zhì)的ANOVA檢驗(yàn)

2.2 土壤細(xì)菌群落組成

根據(jù)不同覓食強(qiáng)度下細(xì)菌的OTU數(shù)量繪制韋恩圖，由圖2可知，不同覓食強(qiáng)度處理下共檢測到3 427個(gè)細(xì)菌OTUs，CK，LFI，MFI和HFI特有的細(xì)菌OTU數(shù)分別為261，331，291和573個(gè)，可見牦牛覓食增加了土壤中特有的微生物群落。

高寒草甸草原牦牛不同覓食強(qiáng)度下細(xì)菌菌門組成相同，然而豐度不同。門水平相對豐度高于1%的細(xì)菌依次為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，其中變形菌門、放線菌門相對豐度最高，分別為30.66%～33.38%和25.04%～28.99%，2者共占土壤細(xì)菌總reads數(shù)的50%以上(圖2)。利用Kruskal Wallis對不同牦牛覓食強(qiáng)度下土壤細(xì)菌門水平的相對豐度進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明只有疣微菌門(2.46%～5.10%)和芽單胞菌門(1.91%～2.68%)存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量的韋恩圖和不同覓食強(qiáng)度細(xì)菌門水平物種組成的變化

2.3 土壤細(xì)菌群落alpha和beta多樣性

群落多樣性揭示了牦牛不同覓食強(qiáng)度下細(xì)菌群落的分布模式。不同覓食強(qiáng)度下土壤細(xì)菌Shannon-wiener多樣性指數(shù)和chao1指數(shù)均無顯著性差異(圖3)，表明牦牛覓食強(qiáng)度對土壤細(xì)菌alpha多樣性影響較小。

基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)揭示了牦牛不同覓食強(qiáng)度下細(xì)菌群落的分布模式(圖3)。非參數(shù)的多元方差分析(PERMANOVA)表明，牦牛覓食顯著改變了細(xì)菌群落組成(P<0.05)，其中，CK和HFI的細(xì)菌群落組成均與MFI呈現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。

圖3 不同覓食強(qiáng)度細(xì)菌群落的alpha多樣性和beta多樣性

2.4 土壤細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)

為了研究不同覓食強(qiáng)度下細(xì)菌潛在的相互作用以及共發(fā)生模式，本研究基于隨機(jī)矩陣?yán)碚?，采用相同的閾?R>0.6，P<0.01)，使用4種覓食強(qiáng)度下的細(xì)菌群落分別構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)(圖4a)。對各共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)(27.13%～35.09%)、放線菌門(Actinobacteria)(21.81%～24.91%)和酸桿菌門(Acidobacteria)(15.43%～17.67%)是4個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的優(yōu)勢菌門(圖4a)。牦牛覓食能夠增加網(wǎng)絡(luò)中疣微菌門(Verrucomicrobia)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的節(jié)點(diǎn)數(shù)量。其中，隨著共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)中疣微菌門相對豐度的增加，細(xì)菌群落beta多樣性及網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度降低(圖4b)。

圖4 不同覓食強(qiáng)度對細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)及細(xì)菌群落多樣性的影響

牦牛覓食強(qiáng)度能夠顯著改變細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)和邊的數(shù)量以及連接度等多種網(wǎng)絡(luò)屬性(表2)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)、邊和度能夠代表網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度，隨著牦牛覓食強(qiáng)度增加，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊的數(shù)量和連接度均呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，說明牦牛覓食能夠增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度。無論覓食強(qiáng)度如何改變，細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)之間正相關(guān)比例均大于負(fù)相關(guān)。模塊化程度和聚類系數(shù)反映了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)聚在一起的程度，不同處理中網(wǎng)絡(luò)模塊化程度(0.967～0.984)均很高，表明網(wǎng)絡(luò)能夠通過模塊發(fā)揮相應(yīng)功能。CK處理中具有較高的平均聚類系數(shù)，因此該處理中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的聚集程度更高。我們使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)方法對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊和度進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，結(jié)果表明牦牛覓食能夠顯著改變網(wǎng)絡(luò)屬性(P<0.05)(表3)。無論哪個(gè)處理，兩兩網(wǎng)絡(luò)之間的屬性均具有顯著差異(P<0.05)，說明牦牛覓食能夠?qū)?xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生重要影響。

表2 細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)屬性

表3 共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)屬性的Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)

2.5 影響土壤細(xì)菌群落的主要因子

為了確定牦牛覓食過程中對細(xì)菌群落特征變化發(fā)揮主要作用的環(huán)境因子，用細(xì)菌群落的Bray-Curtis距離矩陣與土壤理化參數(shù)的歐式距離矩陣進(jìn)行Mantel test相關(guān)性檢驗(yàn)，如圖5所示，pH值為影響細(xì)菌群落最顯著的環(huán)境因子(P<0.01)。此外，基于細(xì)菌OTU的Bray-Curtis相異度矩陣和細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)的度分別與pH值變化進(jìn)行線性回歸分析(圖6)。結(jié)果表明，隨著土壤pH值的升高，細(xì)菌群落組成(P<0.001)和共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度(P<0.05)都顯著增加，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。

圖5 細(xì)菌群落與理化性質(zhì)的相關(guān)性

圖6 細(xì)菌群落的Bray-Curtis相異度和共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)與pH之間的線性回歸

3 討論

牦牛覓食行為擴(kuò)大了細(xì)菌共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)規(guī)模，增強(qiáng)了物種間的相互作用，提高了網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度。網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度的增加會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)更加穩(wěn)定，從而抵抗外界環(huán)境變化[43]。這可能與牦牛覓食過程中產(chǎn)生的排泄物有關(guān)。草地生態(tài)系統(tǒng)中，牲畜排泄物排泄到地表后，通過降水、踐踏和糞食性動(dòng)物活動(dòng)等作用進(jìn)入土壤，造成土壤物理和化學(xué)等性質(zhì)的改變，從而改變土壤微生物群落[44]。吳憲等[45]同樣表明向土壤中施用外源添加劑能夠擴(kuò)大土壤共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)規(guī)模，提高網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度與穩(wěn)定性。屬于疣微菌門的節(jié)點(diǎn)受牦牛覓食干擾而增加，暗示著疣微菌門類群可能通過其它類群之間的相互作用調(diào)控高寒草甸土壤氮循環(huán)。此外，牦牛覓食行為增加了細(xì)菌類群之間正相關(guān)關(guān)系，表明適當(dāng)?shù)年笈Ｒ捠承袨槟軌蛟鰪?qiáng)細(xì)菌類群間的協(xié)同作用，協(xié)同作用增強(qiáng)有利于形成更多營養(yǎng)級，使土壤養(yǎng)分利用更高效，從而能夠提高細(xì)菌群落物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息傳遞的能力[46]。此外，牦牛覓食干擾導(dǎo)致共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)平均聚類系數(shù)降低，意味著覓食干擾能夠增加土壤異質(zhì)性，從而滿足不同生態(tài)位細(xì)菌的生長[47]，而CK中較高的平均聚類系數(shù)代表土壤細(xì)菌功能的高度一致性。因此，合適的覓食強(qiáng)度有利于擴(kuò)大網(wǎng)絡(luò)規(guī)模，提高網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性與穩(wěn)定性，促使共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮更多的功能來適應(yīng)外界環(huán)境變化。

我們發(fā)現(xiàn)土壤pH值是影響高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)土壤細(xì)菌群落的主要因子。有研究表明，pH值的變化能夠改變土壤酶活性和離子濃度等特征，從而影響硝化和反硝化等功能細(xì)菌的代謝活性[48]。此外，土壤細(xì)菌類群更偏好偏堿性土壤，pH值升高能夠增加碳礦化和產(chǎn)甲烷等功能細(xì)菌的相對豐度[49]。我們發(fā)現(xiàn)，pH值升高引起細(xì)菌群落組成和共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度顯著增加，從而可能影響高寒草甸土壤生態(tài)系統(tǒng)功能[50]。

4 結(jié)論

在高寒草甸，牦牛覓食改變了土壤細(xì)菌群落組成，顯著提高了疣微菌門(Verrucomicrobia)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的豐度。牦牛覓食干擾主要通過改變土壤pH值影響細(xì)菌群落組成，從而提高共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度與穩(wěn)定性。因此，適度的牦牛覓食干擾對改善高寒草甸土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)利用不可忽視。