楊雪婷，郭可欣，孫 陽，王蓉蓉*，馬東來，張 學(xué)

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 麥庫西克-張孝騫協(xié)和遺傳醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京100005；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 皮膚科疑難重癥及罕見病國家重點實驗室 國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100730

遺傳性對稱性色素異常癥(dyschromatosis symmetrica hereditaria, DSH, MIM#127400)是一種罕見的、呈常染色體顯性遺傳的色素性皮膚病。DSH多發(fā)于中國、日本等東亞地區(qū)，此外，在亞洲其他地區(qū)如印度、以及歐洲地區(qū)如西班牙等地也有報道[1-2]。日本人群發(fā)病率約為 1.5/10萬，中國人群發(fā)病率不詳，約73%的患者于7歲前發(fā)病[3-4]。DSH的主要臨床特點是手背和足背的色素沉著減少斑及色素沉著過度斑，部分患者面部表現(xiàn)出雀斑樣斑點[5]。DSH的病理表現(xiàn)為色素減少斑皮膚基底層內(nèi)黑色素細(xì)胞減少，電鏡檢查可見黑色素細(xì)胞變性[6]。2003年，學(xué)者將DSH致病基因確定為位于1q21.3的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶(adenosine deaminase acting on double-stranded RNA，ADAR)基因[3, 7]。

本研究結(jié)合臨床表型、全外顯子組測序技術(shù)(whole exome sequencing， WES)、Sanger測序以及生物信息分析軟件等，運(yùn)用相關(guān)分子診斷技術(shù)和遺傳學(xué)分析方法，對3個中國DSH家系進(jìn)行研究，為該病的基因診斷、遺傳咨詢以及精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

家系1：先證者1，男，18歲，雙手背側(cè)皮膚色素異常8年余。家系2：先證者2，男，12歲，雙手、足背側(cè)皮膚色素異常2年余。家系3：先證者3，女，5歲，面部、雙手、雙足皮膚色素異常3年余。

3名先證者均于北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科門診就診。在獲得患者及其家庭成員知情同意并簽訂知情同意書后，收集患者及其家系成員臨床資料、家族史，進(jìn)行臨床診斷及家系分析(圖1)。該研究遵循赫爾辛基宣言(Helsinki Declaration)，并獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會的審查批準(zhǔn)(2022170)。

1.2 研究方法

1.2.1 采集樣本與DNA的提?。韩@取知情同意后采集患者及其父母外周靜脈血各2 mL，EDTA抗凝，-20 ℃低溫保存，使用全血細(xì)胞DNA提取試劑盒(Qiagen公司，51106)提取樣本基因組DNA。

1.2.2 WES檢測與變異的篩選：取患者外周血基因組DNA 1 μg 送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行WES檢測，使用Illumina平臺PE150高通量測序系統(tǒng)進(jìn)行人類全外顯子組測序，利用ANNOVAR軟件對檢測出的基因變異進(jìn)行功能注釋。致病變異的分析篩選策略如下：1)按照遺傳方式關(guān)注呈常染色體顯性遺傳的變異；2)選擇最小等位基因頻率≤ 0.001的變異；3)關(guān)注位于基因編碼區(qū)的變異以及位于非編碼區(qū)但可能影響剪接的變異；4)針對已報道的候選致病基因，利用生物信息軟件對候選基因上的變異進(jìn)行致病性預(yù)測。

The squares represent males, the circles represent females, the blackened symbols represent affected individuals,and the probands are indicated by the arrows

1.2.3 Sanger測序驗證變異位點：對WES結(jié)果中篩選出的變異位點進(jìn)行家系驗證，從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取基因序列信息，利用Primer3web在線軟件(https://primer3.ut.ee/)針對變異位點設(shè)計引物，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。對患者及其父母基因組DNA樣本進(jìn)行變異位點的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行Sanger測序。

1.2.4 蛋白保守性及功能的預(yù)測：應(yīng)用Clustal Omega在線軟件(http://www.clustal.org/omega/)預(yù)測基因變異位點的保守性，使用Jalview軟件分析結(jié)果。使用REVEL、CADD等在線軟件預(yù)測基因變異的致病性。

2 結(jié)果

2.1 臨床表型

先證者1，男，18歲，雙手背部散在分布點狀、小片狀白斑8年余，局部摻雜色素沉著過度斑(圖2)，白斑隨年齡增長數(shù)量有所增多、面積有所擴(kuò)大，無痛癢癥狀，否認(rèn)家族史。

先證者2，男，12歲，雙手、足背部散在分布點狀白斑和褐色斑塊近2年(圖2)，且隨年齡增長逐漸加重，否認(rèn)家族史。

先證者3，女，5歲，雙手、足背部散在分布點狀白斑和色素沉著過度斑(圖2)，面部有雀斑樣斑點，否認(rèn)家族史。

The hyperpigmented macules are indicated by the red triangles, while the hypopigmented macules are indicated by the blue triangles

2.2 WES結(jié)果分析與Sanger測序驗證

根據(jù)上述策略，對WES結(jié)果進(jìn)行分析及變異篩選，發(fā)現(xiàn)3名先證者均攜帶ADAR(NM_001111.5)基因雜合變異。先證者1攜帶ADARc.3546T>G(p.Tyr1182*)無義變異，先證者2攜帶c.2770T>G(p.Tyr924Asp)錯義變異，先證者3攜帶ADARc.3116A>C(p.Lys1039Thr)錯義變異。這3個變異均未在gnomAD數(shù)據(jù)庫等公共數(shù)據(jù)庫中收錄。前兩個變異在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database，HGMD)未見報道。Sanger測序結(jié)果表明這3個家系中先證者的父母均未攜帶相應(yīng)變異，提示為新發(fā)變異(denovovariants)(圖3)。

2.3 變異致病性預(yù)測分析結(jié)果

這3個ADAR基因的變異位點在不同物種間高度保守(圖4)。ADAR基因c.3546T>G(p.Tyr1182*)無義變異CADD預(yù)測分值為38，判定為“Damaging”，LRT預(yù)測分值為0，判定為“Deleterious”；c.2770T>G(p.Tyr924Asp)錯義變異SIFT、REVEL、CADD預(yù)測分值分別為0、0.981、29.8，判定為“Damaging”； c.3116A>C(p.Lys1039Thr)錯義變異SIFT、REVEL、CADD預(yù)測分值分別為0、0.985、31，判定為“Damaging”。 根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)指南,ADAR基因c.3546T>G無義變異被判定為致病(PVS1+PS2+PM2+PP3+PP4)；c.2770T>G、c.3116A>C錯義變異分別被判定為致病(PS2+PM1+PM2+PP3+PP4)以及(PS1+PS2+PM1+PM2+PP3+PP4)。

The variants are indicated by the red arrows圖3 3個家系A(chǔ)DAR基因變異位點測序圖Fig 3 Sanger sequence chromatograms of the ADAR variants in the three families

The variant sites are highlighted in red圖4 ADAR基因編碼蛋白924位酪氨酸(Y)、1039位賴氨酸(K)、1182位酪氨酸(Y)位點保守性分析(NP_001102.3)Fig 4 Conservation of the variant sites, Tyr (924), Lys (1039) and Tyr (1182) in ADAR protein

3 討論

DSH是一種呈常染色體顯性遺傳的色素性皮膚病。2003年，中國學(xué)者Zhang等通過定位克隆的方法發(fā)現(xiàn)DSH致病基因定位于1號染色體1q11～1q21區(qū)域，同年，日本學(xué)者M(jìn)iyamura等將DSH致病基因確定為該區(qū)域內(nèi)編碼雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶的基因ADAR[3, 7]。ADAR基因全長26.13 kb，包含15個外顯子，所編碼的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶(double-stranded RNA-specific adenosine deaminase，DSRAD)由1 226個氨基酸組成。DSRAD發(fā)揮RNA編輯作用，能夠催化腺嘌呤核苷脫氨基生成次黃嘌呤核苷，導(dǎo)致密碼子改變或剪接位點的改變，從而影響蛋白質(zhì)功能，參與某些發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控[8-9]。DSRAD包含2個Z-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Z-alpha)、3個雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DSRM)以及1個腺苷脫氨酶催化結(jié)構(gòu)域(ADEAMc)，其中Z-alpha、DSRM結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合底物，提高RNA編輯的效率，ADEAMc結(jié)構(gòu)域催化腺嘌呤核苷脫氨基生成次黃嘌呤核苷[10]。

DSH發(fā)病機(jī)制尚不明確，ADAR變異導(dǎo)致的單倍劑量不足可能是DSH的一種分子發(fā)病機(jī)制[11]。本研究中ADARc.3546T>G(p.Tyr1182*)無義變異導(dǎo)致提前終止密碼子的產(chǎn)生，可能引起無義介導(dǎo)的mRNA降解，導(dǎo)致單倍劑量不足，引起先證者1 對稱性色素異常的表型。先證者2攜帶的ADARc.2770T>G(p.Tyr924Asp)錯義變異和先證者3攜帶的c.3116A>C(p.Lys1039Thr)錯義變異均位于ADEAMc結(jié)構(gòu)域，且924位酪氨酸(Tyr)和1 039位賴氨酸(Lys)在物種間均高度保守，因此這兩個變異可能通過影響DSRAD的功能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。Murata等報道了一例日本DSH散發(fā)病例攜帶ADARc.2770T>G(p.Tyr924Asp)錯義變異[12]。目前HGMD數(shù)據(jù)庫中已收錄DSH相關(guān)的ADAR致病變異234個，包括錯義變異128個、無義變異38個、移碼變異80個、剪接變異24個，大部分均位于ADEAMc結(jié)構(gòu)域(128個，54.7 %)。本研究中的3個變異均位于ADEAMc催化結(jié)構(gòu)域，生物信息軟件預(yù)測結(jié)果顯示極有可能為致病變異，ACMG將其分類為致病變異。因此，3個家系中的新發(fā)變異c.3546T>G，c.2770T>G和c.3116A>C可能分別是3位先證者DSH的發(fā)病原因。

綜上所述，本研究結(jié)合患者臨床表型和遺傳學(xué)檢測結(jié)果，鑒定并分析了3個DSH家系的致病變異，為患者的基因診斷、臨床治療以及遺傳咨詢提供了依據(jù)；發(fā)現(xiàn)了ADAR基因新的變異位點c.3546T>G(p.Tyr1182*)、c.2770T>G(p.Tyr924Asp)，豐富了ADAR基因的突變譜。