錢 英，代 義，喻慧琳，格汝娜姆，趙婷婷

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2.重慶醫(yī)科大學，重慶 400016；3.重慶醫(yī)科大學實驗教學管理中心，重慶 400016)

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為紅色斑塊、鱗屑和瘙癢。在銀屑病皮損部位角質(zhì)形成細胞與樹突狀細胞、免疫細胞等串擾，形成炎癥的惡性循環(huán)。而白細胞介素-23(IL-23)/IL-17炎癥軸在驅(qū)動銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)、外源性刺激(如遺傳因素和皮膚屏障破壞等)均會誘導漿細胞樣樹突狀細胞等釋放IL-23，激活輔助性T淋巴細胞17分泌IL-17和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎性細胞因子，進而促進角質(zhì)細胞過度增殖并分泌其他炎癥介質(zhì)[1]。其中細胞間黏附因子-1(ICAM-1)參與了T淋巴細胞的激活、遷移、黏附和再激活，介導斑塊的形成和維持[2]。ICAM-1以可溶性ICAM-1(sICAM-1)在血清中被檢測到。sICAM-1不僅在一定程度上反映表皮中ICAM-1表達水平，且與病情嚴重程度及活動度密切相關(guān)[3-4]。此外，銀屑病中的內(nèi)源性一氧化氮(NO)在角質(zhì)形成細胞的增殖、分化及炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著復雜的雙相作用。低水平NO 誘導角質(zhì)形成細胞增殖，加重炎癥；高水平NO誘導角質(zhì)形成細胞分化，有助于表皮屏障恢復[5]。因此，促進NO釋放可能是減輕銀屑病炎癥及修復皮膚屏障的新方向。

網(wǎng)絡藥理學分析表明，莪術(shù)油可作用于合成NO的誘導型一氧化氮合酶(iNOs)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOs)，且含有莪術(shù)醇、β-欖香烯和吉馬酮等多種成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗菌等生物活性[6-7]。其中β-欖香烯及相關(guān)衍生物可能通過激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/eNOs信號通路誘導NO釋放，改善內(nèi)皮功能障礙[8-9]。以β-欖香烯為母體化合物引入呋喃烷 NO 供體基團開發(fā)出的β-欖香烯雜合體，顯示出了顯著的抗腫瘤活性[10]。莪術(shù)油可能是作用于銀屑病的潛在NO供體，從而達到治療銀屑病的作用。

據(jù)文獻報道，莪術(shù)油外用治療銀屑病具有較好的療效，且不良反應較小，適合銀屑病穩(wěn)定期患者長期維持用藥，以預防皮損復發(fā)，但其降低銀屑病炎癥并抑制表皮增厚的作用機制尚不明確[11-12]。本研究通過建立咪喹莫特乳膏(IMQ)誘導的小鼠銀屑病皮損模型，初步探討了莪術(shù)油對銀屑病穩(wěn)定期小鼠血清ICAM-1、NO水平的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 BALB/c小鼠44只(雄性、體重18～25 g)，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SYXK(渝)2018-0003]，嚴格按實驗動物3R原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。莪術(shù)油購于江西省吉水縣健民天然香料油廠，IMQ購于四川明欣藥業(yè)有限責任公司，凡士林購于聯(lián)合利華(中國)有限公司，乳膏基質(zhì)為遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院自制，ICAM-1、NO酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均購于江蘇酶免實業(yè)有限公司，光學顯微鏡購自寧波舜宇儀器有限公司，KD-BM組織包埋機購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，Leica RM2255(徠卡)組織切片機購自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司，MULTISKAN GO酶標儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，均由重慶醫(yī)科大學創(chuàng)新實驗室提供。

1.2方法

1.2.1動物造模、分組和給藥 適應性飼養(yǎng)小鼠1周后刮除背部絨毛，形成大小2 cm×3 cm暴露區(qū)域。將44只BALB/c小鼠隨機打上1～44號耳標，采用計算機Excel表格函數(shù)生成44個隨機不重復整數(shù)。按照空白對照組、IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對照組、5%莪術(shù)油組和10%莪術(shù)油組的順序依次完成隨機分組，IMQ模型組12只，其余每組8只。隨機適應性飼養(yǎng)3 d后除空白對照組涂抹凡士林外，其余4組連續(xù)14 d每天于小鼠背部裸露皮膚涂抹5% IMQ 62.5 mg，于第7天開始分別給予凡士林、乳膏基質(zhì)、5%莪術(shù)油、10%莪術(shù)油進行治療，用量均為12.5 mg/cm2。

1.2.2皮損嚴重程度評估及取材 根據(jù)銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)(PASI)，于第2、4、6、8、12、14天進行評分，皮損紅斑、鱗屑、浸潤增厚程度均為0～4分，三者評分相加即為總評分。具體評分標準：無皮損計0分，輕度皮損計1分，中度皮損計2分，重度皮損計3分，極重度皮損計4分。給藥第8、11天隨機抽取2只IMQ模型組小鼠處死，余下實驗動物于第15天全部處死。眼球取血，2 000 r/min離心10 min，吸取上清液備用。同時，迅速剝離小鼠背部裸露皮膚組織，游標卡尺測量皮膚厚度，每只小鼠取3個表皮位置進行測量，取平均值，然后置于4%多聚甲醛中固定備用。剝離小鼠脾臟組織，觀察脾臟長度并稱重，計算脾指數(shù)(脾臟重量/體重)。評估莪術(shù)油抗銀屑病活性實驗設計見圖1。

圖1 評估莪術(shù)油抗銀屑病活性實驗設計

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)染色及組織病理觀察 皮膚組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水后包埋在石蠟中。使用HE染色對5 μm石蠟切片進行染色。在光學顯微鏡下評估銀屑病的組織病理學特征，包括過度角化、顆粒層變薄或消失、棘層肥厚、表皮波浪狀起伏并向真皮下延伸，以及皮脂腺增多、炎性細胞浸潤等。

1.2.4ELISA檢測血清ICAM-1、NO表達 使用ELISA法對各組小鼠血清ICAM-1、NO水平進行定量分析，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠不同時間點PASI評分比較 各組小鼠第0～8天均逐漸出現(xiàn)紅斑、浸潤、鱗屑等。IMQ模型組小鼠第8～14天PASI評分出現(xiàn)下降，但仍明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。乳膏基質(zhì)對照組、5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠PASI評分均高于IMQ模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A.不同時間點PASI總分；B.治療后PASI總分；aP<0.05。

2.2各組小鼠不同時間點表皮厚度比較 IMQ模型組小鼠不同時間點表皮厚度均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對照組、5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠表皮厚度均明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與IMQ模型組比較，5%莪術(shù)油組小鼠表皮厚度明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與乳膏基質(zhì)對照組比較，5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠表皮厚度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖4。

注：aP<0.05。

表1 各組小鼠表皮厚度比較

注：aP<0.05。

2.3各組小鼠皮膚組織病理學特征比較 與空白對照組比較，IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對照組、5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠均出現(xiàn)不同程度表皮增厚、角化過度、角化不全、顆粒層變薄、棘層肥厚、表皮突呈杵狀向真皮下延伸等。此外，皮脂腺增多，出現(xiàn)Munro微膿腫和大量炎性細胞浸潤。見圖5。

圖5 各組小鼠皮膚組織病理學特征比較(HE染色，200×)

2.4各組小鼠脾腫大情況比較 與空白對照組比較，IMQ模型組小鼠脾臟大小和重量均明顯增加，且脾指數(shù)也增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對照組比較，5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠脾臟大小和重量均明顯降低，且脾指數(shù)也降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖6、7。

表2 各組小鼠脾腫大情況比較

圖6 各組小鼠脾臟大小比較

2.5各組小鼠不同時間點血清ICAM-1、NO水平比較 IMQ模型組小鼠第0、8、11、15天血清ICAM-1、NO水平見表3、圖8。IMQ模型組小鼠血清ICAM-1、NO水平與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、乳膏基質(zhì)對照組比較，5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠血清ICAM-1水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與IMQ模型組比較，10%莪術(shù)油組小鼠血清ICAM-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與空白對照組比較，乳膏基質(zhì)對照組和5%莪術(shù)油組小鼠血清NO水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與IMQ模型組比較，5%莪術(shù)油組小鼠血清NO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、圖9。

注：aP<0.05。

表3 IMQ模型組小鼠不同時間點血清ICAM-1、NO水平

圖8 IMQ模型組不同時間點血清ICAM-1、NO水平

表4 各組小鼠血清ICAM-1、NO水平比較

注：aP<0.05。

3 討 論

銀屑病是一種慢性炎癥疾病，分為急性發(fā)病期、穩(wěn)定期和消退期。IMQ誘導的銀屑病小鼠模型可模擬與人類相似的銀屑病病程。在銀屑病急性發(fā)病期IMQ激活Toll樣受體7/8，通過IL-23/IL-17炎癥軸激活下游炎癥級聯(lián)反應，并招募中性粒細胞和樹突狀細胞等免疫細胞遷移至表皮[1]。而在銀屑病穩(wěn)定期，盡管局部炎性細胞因子，如IL-22和TNF-α短暫增加后降低，但表皮中浸潤的免疫細胞與持續(xù)激活的轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)、STAT3，以及腺苷受體共同維持了穩(wěn)定期銀屑病局部皮損[13-14]。此外，IMQ誘導的小鼠銀屑病復發(fā)模型表明，即使肉眼觀察皮損消退，小鼠局部皮膚仍保留銀屑病的病理改變，病灶中浸潤的記憶CD8+T淋巴細胞容易再次被IMQ激活而復發(fā)銀屑病[15]。

目前，銀屑病無法治愈，銀屑病患者需接受持續(xù)治療，以防止復發(fā)。急性模型不適合長期治療藥物的研究。因此，本研究連續(xù)7 d涂抹IMQ誘導小鼠急性發(fā)病期銀屑病皮損，再通過維持劑量IMQ模擬慢性炎癥穩(wěn)定期，即第8～14天，以更好地模擬慢性銀屑病患者體內(nèi)的長期炎癥狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果顯示，IMQ持續(xù)作用7 d誘發(fā)小鼠背部皮膚的紅斑、鱗屑和浸潤，第8～14天IMQ模型組小鼠銀屑病皮損消退，但仍表現(xiàn)出嚴重的表皮組織病理學改變，以及脾指數(shù)的明顯增加。涂抹5%、10%莪術(shù)油乳膏治療后可明顯減少小鼠表皮厚度、減輕炎性細胞浸潤和脾臟腫大，而乳膏基質(zhì)對照組小鼠PASI評分仍高于IMQ模型組，可能是因為乳膏基質(zhì)對皮膚存在較輕微的刺激性。因此，推測PASI評分在IMQ誘導的銀屑病穩(wěn)定期小鼠模型中可能存在不準確性，尤其是當穩(wěn)定期IMQ模型組的肉眼造模效果下降時治療藥物對皮膚的不良反應可能會干擾對藥物療效的評估。

本研究結(jié)果顯示，涂抹5%、10%莪術(shù)油乳膏治療后小鼠血清ICAM-1水平明顯低于空白對照組和IMQ模型組，提示莪術(shù)油可能具有較強抑制銀屑病病灶內(nèi)免疫細胞黏附的作用。而5%莪術(shù)油組小鼠血清NO水平明顯高于空白對照組和IMQ模型組，可能與莪術(shù)油作用于iNOs、eNOs有關(guān)。另外，乳膏基質(zhì)成分中常見的成分為石蠟，可激活多環(huán)芳烴芳香烴受體，誘導NO釋放。表明莪術(shù)油乳膏可能上調(diào)NO水平抑制角質(zhì)細胞增殖并促進其分化，逆轉(zhuǎn)低水平NO引發(fā)的炎性反應。

急性期和緩解期銀屑病患者血清中均可檢測到顯著升高的sICAM-1[17]。在受到γ干擾素和TNF-α等炎性細胞因子刺激后角質(zhì)細胞及真皮層中微血管內(nèi)皮細胞上的膜型ICAM-1會脫落釋放sICAM-1[18]。病灶中增高的基質(zhì)金屬蛋白酶-9切割 ICAM-1胞外域也會促進內(nèi)皮細胞釋放sICAM-1[19]。鑒于sICAM-1常被認為是動態(tài)觀測銀屑病療效及預后的炎癥標志物，抑制其釋放可能是一種有效的抗銀屑病策略[20]。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)油明顯降低了血清ICAM-1水平，發(fā)揮了抗炎作用。此外，莪術(shù)油可能作為一種停用依法珠單抗(阻斷淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1 α亞基CD11a與配體ICAM-1結(jié)合)后的過渡性治療藥物，持續(xù)靶向ICAM-1以阻止T淋巴細胞和樹突狀細胞流入皮膚，進而延長緩解期，增強生物制劑的療效。

銀屑病局部皮損中核因子κB、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子等炎癥通路誘導iNOs表達[21-22]，但過表達精氨酸酶1與其競爭底物L-精氨酸，最終導致iNOs活性降低，產(chǎn)生較低水平的NO，刺激角質(zhì)形成細胞過度增殖，并增加血管通透性，促進炎癥介質(zhì)滲出[23]。另外，銀屑病局部病灶中缺氧、高氧化應激、精氨酸酶活躍的微環(huán)境誘導eNOs解偶聯(lián)，產(chǎn)生超氧化物而不是NO，同樣會導致NO的生物利用度降低[24-26]。而較高水平NO則可抑制角質(zhì)形成增殖并促進其正常的分化和凋亡，誘導角化包膜及絲聚蛋白表達，有助于表皮屏障穩(wěn)態(tài)恢復[5]。高水平NO還顯著抑制角質(zhì)細胞產(chǎn)生ICAM-1[27]。此外，臨床使用局部NO供體顯著改善了銀屑病皮損的紅斑、脫屑等[28]。結(jié)合iNOs、eNOs對表皮滲透屏障潛在的正向調(diào)節(jié)作用[29-30]，本研究假設莪術(shù)油可能通過調(diào)控iNOs、eNOs上調(diào)血清NO水平，進而抑制角質(zhì)形成細胞增殖并促進其分化。

綜上所述，本研究證明了復方莪術(shù)油乳膏對IMQ誘導的銀屑病穩(wěn)定期小鼠的治療作用。復方莪術(shù)油乳膏不僅下調(diào)血清ICAM-1水平，阻止免疫細胞遷移，而且誘導高水平NO抑制角質(zhì)細胞增殖，最終降低銀屑病體內(nèi)炎癥水平和表皮厚度。