劉穎 馬春華 朱彧

肺腺癌是中國目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。肺腺癌患者預(yù)后不良的主要原因是局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，腦膜轉(zhuǎn)移（leptomeningeal metastasis，LM）為肺腺癌細(xì)胞侵犯硬腦膜、軟腦膜、腦脊液及蛛網(wǎng)膜下腔等部位，一般腦和脊髓內(nèi)并無瘤塊，是肺腺癌患者最嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）并發(fā)癥，可發(fā)生在肺癌治療的任何階段且為術(shù)后的唯一復(fù)發(fā)病灶，其明確診斷僅約5%。LM 預(yù)后極差，積極治療僅將生存期從6～8 周延長至3～11 個(gè)月，約15%的患者可長期生存1 年以上，極大威脅了患者的生命，對(duì)其家庭和社會(huì)也造成沉重的負(fù)擔(dān)[2]。

目前已經(jīng)公認(rèn)腦脊液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移瘤具有緊密聯(lián)系[3]，因此國內(nèi)外針對(duì)腦脊液標(biāo)本開展了多種腦膜轉(zhuǎn)移瘤診斷技術(shù)的研究，如腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、腦脊液循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、腦脊液免疫細(xì)胞化學(xué)檢測、蛋白芯片以及流式細(xì)胞術(shù)等[4-5]。但目前傳統(tǒng)腦膜轉(zhuǎn)移瘤診斷技術(shù)存在缺乏客觀指標(biāo)、敏感性、特異性以及診斷效能低、操作方法復(fù)雜、對(duì)標(biāo)本保存處理?xiàng)l件以及診斷醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)要求高等不足。蛋白組學(xué)技術(shù)是近年來基于質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展起來的檢測腫瘤標(biāo)志物的新技術(shù)，本研究擬通過蛋白組學(xué)技術(shù)從腦脊液蛋白質(zhì)組變化中發(fā)現(xiàn)肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移的差異蛋白，證實(shí)通過腦脊液輔助診斷肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移的可行性，為腦脊液診斷技術(shù)方法學(xué)研究提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年1 月至2021 年12 月天津市環(huán)湖醫(yī)院經(jīng)確診的肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者30 例作為試驗(yàn)組，來自同期非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者30 例作為對(duì)照組。試驗(yàn)組中男性11 例，女性19 例，年齡57.2±11.5 歲；對(duì)照組中男性15 例，女性15 例，年齡63.7±14.8 歲。兩組基線資料比較無顯著性差異（年齡：χ2=1.900 0，P=0.062 5；性別：χ2=1.086 2，P=0.297 4）。標(biāo)本的采集經(jīng)天津市環(huán)湖醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者本人或家屬的知情同意（倫理批件編號(hào)：2019-42）。

入組標(biāo)準(zhǔn)：1）經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)明確診斷的肺腺癌患者。2）確診的LM 患者。3）MRI 檢查顱內(nèi)無直徑超過l cm 的轉(zhuǎn)移病灶。4）6 個(gè)月內(nèi)無腦炎及顱腦外傷病史，未經(jīng)過腦部手術(shù)或者放療。5）經(jīng)脫水藥物治療后顱內(nèi)高壓癥狀可獲得控制。6）能夠耐受腰椎穿刺采集腦脊液。7）排除合并顱內(nèi)腦膜瘤、室管膜瘤、脊膜瘤等腦脊髓膜病變[6]。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照中國LM 專家共識(shí)診斷標(biāo)準(zhǔn)：1）具有1 個(gè)或多個(gè)典型LM 癥征。2）惡性腫瘤病史或神經(jīng)系統(tǒng)癥征出現(xiàn)后發(fā)現(xiàn)腫瘤。3）具有1 個(gè)或多個(gè)輔助檢查發(fā)現(xiàn)，如顱壓升高、腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）蛋白升高、糖降低，影像學(xué)示腦膜強(qiáng)化，CSF 存在循環(huán)腫瘤DNA。4）確診實(shí)驗(yàn)：CSF 細(xì)胞學(xué)找到癌細(xì)胞或CSF 腫瘤標(biāo)志物陽性。5）排除其他診斷，同時(shí)滿足上述5 項(xiàng)條件即確診LM[2]。

1.2 方法

1.2.1 腦脊液樣本收集及處理 所有患者均行側(cè)臥位腰椎穿刺，顱內(nèi)壓無升高或降低，椎管無阻塞。取無色清亮腦脊液5 mL，立即經(jīng)4℃，2 000×g 離心10 min，取上清于?80℃冰箱凍存 。

1.2.2 腦脊液蛋白質(zhì)組的檢測 肽段制備：將腦脊液樣本經(jīng)BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0012S）檢測蛋白濃度后，取500 ng蛋白轉(zhuǎn)移至10 KD 蛋白組超濾管中，通過200 μL 1 mol/L 尿素置換樣本，向超濾管中加入酶解液（酶∶蛋白=1∶50），調(diào)至pH 為8.0，37℃消化16 h，離心收集消化肽段樣本，旋轉(zhuǎn)蒸干，通過C18 脫鹽柱脫鹽，通過高pH 值反向色譜柱分析樣本。2）質(zhì)譜上樣：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜LC-MS/MS 設(shè)備采用Q Exactive HF質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），自制C18 色譜分析柱（內(nèi)徑150 μm，粒徑1.9 μm，長度12 cm），柱溫維持在30℃，上樣500 ng。LC-MS/MS條件：流動(dòng)相A：1%甲酸，99%水；流動(dòng)相B：1%甲酸，99%乙腈，流速0.6 μL/min。在初始條件下（0%流動(dòng)相B）平衡15 min 后，0～5 min 5%流動(dòng)相B（100%乙腈，0.1%甲酸）；6～16 min 10%流動(dòng)相B；17～51 min，22%流動(dòng)相B；52～71 min，30% 流動(dòng)相B；72 min，95%流動(dòng)相B；78 min，95% 流動(dòng)相B。3）蛋白質(zhì)鑒定：通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫和Proteome Discoverer 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索和鑒定，設(shè)定差異倍數(shù)為1.2 倍或0.83 倍，且P<0.05 作為表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的顯著閾值，多肽和蛋白質(zhì)的假發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）設(shè)置為0.01，達(dá)到可信度>99% 。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法按照說明書要求通過酶標(biāo)儀Multiskan FC（美國Thermo Fisher Scientific 公司）分析腦脊液蛋白組學(xué)分析中差異蛋白含量，C1q（ab170246）、C2（ab 154132）、C7（ab125964）、C8B（ab283548）、C9（ab13 7972）、AMBP（ab108884）、CFI（ab195460）、SERPIN F1（ab213815）。ELISA 試劑盒購自美國Abcam 公司，KRT1（CSB-EL012503HU）、SAA4（CSB-EL020659 HU）、KRT6A（CSB-EL012561HU）、ACTG1（CSB-EL0 01222HU）、SERPINF2（CSB-E09452h）、LPA（CSB-EQ 028005HU）ELISA 試劑盒購自美國CUSABIO 公司，PGLYRP2 ELISA 試劑盒購自美國Biomatik 公司（EKU06521）。采用德國SIMENS BNⅡ特種蛋白分析儀通過速率散射比濁試驗(yàn)分析腦脊液IgG 含量（OSAS15），采用美國貝克曼庫爾特AU5800 全自動(dòng)生化分析儀通過免疫透射比濁試驗(yàn)分析腦脊液載脂蛋白B 含量（OSR6143）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量采用表示，組間差異比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSDt檢驗(yàn)。使用Cytoscape 3.8 軟件進(jìn)行基因本體論（gene ontolgy，GO）分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS 鑒定結(jié)果

LC-MS/MS 結(jié)果經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫和Proteome Discoverer 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索和鑒定，共鑒定出蛋白372 個(gè)，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組腦脊液中13 個(gè)蛋白顯著上調(diào)，6 個(gè)蛋白顯著下調(diào)（表1）。

表1 肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液差異蛋白變化

2.2 生物信息學(xué)分析

本研究通過GO 富集分析，研究了肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液差異蛋白相關(guān)的生物學(xué)過程（biological process，BP）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）分布，其中急性炎癥應(yīng)答（acute inflammatory response）和創(chuàng)傷應(yīng)答（response to wounding）是富集差異蛋白較多（分別占44%和22%）的生物學(xué)過程（圖1A），細(xì)胞外膜結(jié)合細(xì)胞器（extracellular membrane-bounded organelle）、細(xì)胞外外泌體（extracellular exosome）和細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle）等細(xì)胞組成分布發(fā)生了改變（圖1B）。通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）網(wǎng)絡(luò)分析差異蛋白之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液差異蛋白主要與急性炎癥應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答（humoral immune response）和應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控（regulation of response to stress）相關(guān)（圖1C）。

圖1 肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液差異蛋白GO 富集分析

2.3 腦脊液差異蛋白的驗(yàn)證

本研究通過ELISA 試驗(yàn)研究了試驗(yàn)組和對(duì)照組患者腦脊液中上述差異蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組腦脊液中補(bǔ)體C1q/2/7/8B、IgG、PGLYRP2、SAA4、AMBP 顯著上調(diào)（均P<0.05），未能在腦脊液中檢測到ApoB、KRT1/6A、ACTG1、SERPINF1/2和LPA（表2）。

表2 肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液蛋白含量變化（n=30）

2.4 腦脊液差異蛋白的檢驗(yàn)效能

通過ROC 分析得到補(bǔ)體C1q/2/7/8B、IgG、PGLYRP2、SAA4、AMBP 的診斷效能（表3），其中C2 具有較高的特異度，PGLYRP2 具有較高的靈敏度，將二者進(jìn)行二元Logistic 回歸分析，得到Logistic（P）=3.758× C2+0.213×PGLYRP2-49.103，ROC 分析表明C2+PGLYRP2 聯(lián)合分析可得到較為理想的診斷效能。

表3 腦脊液蛋白輔助診斷肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移的檢驗(yàn)效能

3 討論

肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)其疾病發(fā)展已不可控制，因此肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[7]。但是，早期診斷腦膜轉(zhuǎn)移癌尚屬醫(yī)學(xué)難題，即便腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查、磁共振成像增強(qiáng)掃描等現(xiàn)有診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”也存在靈敏度和特異度較低，只能定性不能定量等缺陷，己成為肺癌腦膜轉(zhuǎn)移早期治療的一個(gè)瓶頸[8-10]。

蛋白組學(xué)技術(shù)被認(rèn)為是檢測蛋白質(zhì)譜的最有效的手段，本研究通過蛋白組學(xué)技術(shù)有望從腦脊液蛋白質(zhì)組變化中發(fā)現(xiàn)肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移的差異蛋白，從而實(shí)現(xiàn)肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警和診斷，為挽救患者生命贏得時(shí)間。

已有研究證實(shí)，腦脊液免疫狀態(tài)可表征腦轉(zhuǎn)移瘤微環(huán)境[11]。腫瘤細(xì)胞侵犯神經(jīng)系統(tǒng)，可激活免疫細(xì)胞并促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，因此監(jiān)控腦脊液免疫狀態(tài)可反映腫瘤腦膜轉(zhuǎn)移情況[12-13]。補(bǔ)體系統(tǒng)是一類可調(diào)節(jié)人體細(xì)胞和體液免疫的調(diào)節(jié)蛋白，在免疫系統(tǒng)和防御機(jī)制中具有重要的作用。神經(jīng)系統(tǒng)中的補(bǔ)體系統(tǒng)不但可參與免疫系統(tǒng)調(diào)控，還可參與突觸和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育調(diào)控。

本研究采用非標(biāo)記定量LC-MS/MS 技術(shù)觀察到肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液蛋白質(zhì)組表達(dá)發(fā)生了改變。生物學(xué)過程分析表明，患者腦脊液差異蛋白主要分布于急性炎癥應(yīng)答、創(chuàng)傷應(yīng)答和外部刺激應(yīng)答等生物學(xué)過程，而細(xì)胞外基質(zhì)、膜結(jié)合細(xì)胞器、外泌體和囊泡等細(xì)胞組成富集也發(fā)生了顯著改變。細(xì)胞組成分析結(jié)果提示肺腺癌侵犯腦膜的過程中，腦脊液中免疫相關(guān)蛋白譜發(fā)生了顯著變化，補(bǔ)體系統(tǒng)受到激活，KEGG 分析結(jié)果提示肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)了急性炎癥應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答和應(yīng)激反應(yīng)。為了證實(shí)蛋白組學(xué)分析結(jié)果，本研究通過ELISA 和生化法考察了肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中差異蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體患者腦脊液中C1q/2/7/8B、IgG、PGLYRP2、SAA4、AMBP 顯著上調(diào)，但是未能在腦脊液中檢測到ApoB、KRT1/6A、ACTG1、SERPINF1/2和LPA，可能與ELISA和生化法試劑盒靈敏度低于質(zhì)譜法有關(guān)。PGLYRP2與抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān)，補(bǔ)體C1q/2/7/8B、IgG、SAA4和AMBP 均與急性炎癥反應(yīng)有關(guān)，表明腦膜轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)了炎癥應(yīng)答，證實(shí)了KEGG 分析結(jié)果。上述研究結(jié)果與Kwon 等[14]的研究結(jié)果相一致，但其未對(duì)差異蛋白的診斷價(jià)值進(jìn)行探索。

本研究為了進(jìn)一步探討差異蛋白在肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移臨床診斷中的作用，ROC 分析發(fā)現(xiàn)，PGLYRP2具有較高的靈敏度，補(bǔ)體C2 具有較高的特異度，補(bǔ)體C2 與PGLYRP2 聯(lián)合分析具有較為理想的診斷效能，具有成為肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移診斷標(biāo)志物組合的潛力。本課題組曾通過免疫FISH 技術(shù)檢測肺癌腦膜轉(zhuǎn)移患者腦脊液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞[6]，其AUC 為0.875、靈敏度為75.0%、特異度為100.0%，其AUC 和靈敏度低于本研究結(jié)果，特異度高于本研究結(jié)果。本研究有望通過監(jiān)測腦脊液中補(bǔ)體系統(tǒng)活化狀態(tài)為肺腺癌腦膜轉(zhuǎn)移提供預(yù)測手段并為腫瘤免疫治療提供新的策略。