臧文晶，劉麗娜，趙 丹,3,

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150080；3.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530008）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是部分乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的天然高分子聚合物，具有分子質(zhì)量大、黏度大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣等特點(diǎn)[1]。乳酸菌胞外多糖具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和降血糖等功能，具有開發(fā)成益生元的潛力[2]，還可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑等改善或增強(qiáng)乳制品的口感和流變特性[3]，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[4]。一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌主要從泡菜、果蔬醬、水果發(fā)酵液中分離篩選[5-7]。但是由于菌種來(lái)源、培養(yǎng)條件和分離純化方法等不同，使得胞外多糖的分子質(zhì)量、單糖組成、結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大差異，進(jìn)而影響胞外多糖的功能特性[8]。

目前報(bào)道的產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌主要包括：鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等[9]。其中Leuconostoc胞外多糖是由一種單糖組成的同型多糖，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能，是目前乳酸菌胞外多糖的主要來(lái)源。產(chǎn)胞外多糖成員有腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）等[10]。深入挖掘高產(chǎn)胞外多糖Leuconostoc資源，獲得不同化學(xué)組分、優(yōu)良特性的胞外多糖，對(duì)于揭示構(gòu)效關(guān)系和拓展應(yīng)用范疇具有重要的意義。此外，乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量較低，限制了其大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用[11]，因此新的乳酸菌胞外多糖的研究與開發(fā)將成為生命科學(xué)領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。

目前已分離的乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量尚不能滿足發(fā)酵工業(yè)的需求。本研究從自制發(fā)酵水果中分離篩選到一株產(chǎn)胞外多糖的Ln. mesenteroidesHDE1，分離純化胞外多糖后測(cè)定化學(xué)組成，并考察了胞外多糖的牛奶凝結(jié)能力和體外抗氧化活性。研究結(jié)果不僅豐富Leuconostoc胞外多糖來(lái)源，為HDE1胞外多糖構(gòu)效關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)，也有助于推動(dòng)該多糖在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橘子 哈達(dá)水果批發(fā)市場(chǎng)；API 50 CHL試驗(yàn)條（產(chǎn)品編號(hào)：50300） 法國(guó)梅里埃有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：DP302-02） 北京天根生化科技有限公司；DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL 15000 大連寶生物工程有限公司；MRS培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，酵母浸粉5 g，檸檬酸銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，無(wú)水亞硫酸鈉0.1 g，吐溫80 1 mL，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)至pH5.5，121 ℃滅菌15 min；MRS-S培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，蔗糖50 g，磷酸氫二鉀2 g，亞硫酸鈉0.1 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，檸檬酸銨2 g，吐溫80 1 mL，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)至pH5.5，108 ℃滅菌20 min；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UVmini-1240型紫外可見分光光度計(jì) 島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司；VersaMax型酶標(biāo)儀 美國(guó)美谷分子儀器有限公司；BX43型正置熒光顯微鏡 奧林巴斯中國(guó)有限公司；SM+3140B型體視鏡 北京泰克儀器有限公司；X-15R型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter有限公司；HH-B11-420-S型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 取新鮮個(gè)體均勻的橘子洗凈切塊，去核處理后放入含100 mL無(wú)菌水的發(fā)酵罐中，密封自然發(fā)酵72 h。

1.2.2 產(chǎn)胞外多糖菌株的分離與純化 取200 μL準(zhǔn)備好的發(fā)酵液稀釋涂布于MRS平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，待平板上長(zhǎng)出菌落，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜靜置培養(yǎng)后獲得菌懸液，將菌懸液于MRS-S固體平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，觀察平板上菌落特征。

1.2.3 菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)胞外多糖的進(jìn)程 以2%（v/v）的接種量將活化到對(duì)數(shù)期的種子液接種到100 mL/250 mL MRS-S培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，每間隔6 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)（CFU/mL）及胞外多糖產(chǎn)糖量（g/L）。

1.2.4 基于16S rDNA序列的鑒定 菌株HDE1基因組DNA的提取：取5 mL活化好的種子液經(jīng)12000r/min離心1 min，盡量吸凈上清，留沉淀。然后用基因組提取試劑盒提取菌株HDE1的基因組DNA。PCR擴(kuò)增：采用16S rDNA通用引物，上游引物27F 5” AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3” 和下游引物1492R 5” GGTTACCTTGTTACGACTT 3” ，對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序見表1及表2。

表1 16S rDNA PCR擴(kuò)增體系Table 1 16S rDNA PCR amplification system

表2 16S rDNA PCR擴(kuò)增程序Table 2 16S rDNA PCR amplification procedure

16S rDNA測(cè)序及分析：將PCR產(chǎn)物交由上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有核苷酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，根據(jù)同源性確定菌株的種屬水平。系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：下載與獲得的16S rDNA核苷酸序列同源性高的模式菌株核苷酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 API鑒定 使用API試劑盒分析菌株生理生化特性，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，分別于24和48 h觀察并記錄結(jié)果。

1.2.6 胞外多糖的純化 按照Du等[12]的方法純化胞外多糖。以2%（v/v）的接種量將活化好的產(chǎn)胞外多糖菌株種子液接入到MRS-S產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)36 h，得到的發(fā)酵液4 ℃、12000 r/min離心30 min，加入80%（w/v）的TCA，使上清液的TCA終濃度達(dá)4%（w/v）。4 ℃靜置過(guò)夜后，4 ℃、12000 r/min離心30 min除去發(fā)酵液中的蛋白，獲得上清液。向上清液中加入三倍體積95%預(yù)冷乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜沉淀為胞外多糖，4 ℃、12000 r/min離心20 min，將沉淀溶于去離子水并轉(zhuǎn)入透析袋（截留分子量為8000～12000 Da），4 ℃透析2 d，每8 h更換一次水。透析后將胞外多糖樣品冷凍干燥。

1.2.7 胞外多糖產(chǎn)糖量的測(cè)定 胞外多糖產(chǎn)糖量根據(jù)苯酚-硫酸法[13]進(jìn)行測(cè)定，并以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將烘干至恒重的葡萄糖配制成200 μg/mL的母液，并依次稀釋成濃度為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180及200 μg/mL的葡萄糖溶液。取1 mL葡萄糖溶液與1 mL 6%（w/v）的苯酚溶液混合，隨后加入5 mL濃硫酸，冷卻至室溫后，測(cè)定OD490nm。以葡萄糖濃度（μg/mL）和OD490nm分別為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=22.246x+0.002（R2=0.9995）。將胞外多糖溶液適當(dāng)稀釋后，同法測(cè)定OD490nm，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株胞外多糖產(chǎn)糖量。

1.2.8 胞外多糖純度檢測(cè) 將凍干的胞外多糖溶于去離子水中，配制成濃度為1 mg/mL的胞外多糖溶液，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，掃描波長(zhǎng)范圍為190～350 nm，觀察在波長(zhǎng)260和280 nm處有無(wú)特征峰，檢測(cè)胞外多糖是否有核酸和蛋白的污染。

1.2.9 胞外多糖化學(xué)組成測(cè)定 本研究采用BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)胞外多糖中蛋白的定量測(cè)定。采用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖的總糖含量，具體操作見1.2.7。采用硫酸-咔唑法[14]測(cè)定胞外多糖的糖醛酸含量。將烘干至恒重的葡萄糖醛酸配制成40 μg/mL的母液，并依次稀釋成濃度為0、5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL的葡萄糖醛酸溶液。取5 mL 0.025 mol/L硫酸-四硼酸鈉溶液置于冰上冷卻10 min，隨后緩慢加入1 mL葡萄糖醛酸溶液，冰上混勻后，將試管于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫。再向其中加入0.2 mL 0.125%咔唑溶液，混勻后繼續(xù)沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫后，測(cè)定其OD530nm。以葡萄糖醛酸濃度（μg/mL）和OD530nm分別為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0137x+0.0403（R2=0.9903）。同法測(cè)定胞外多糖中糖醛酸含量。

1.2.10 抗氧化活性檢測(cè)

1.2.10.1 DPPH自由基清除能力 參照Shen等[15]的方法，將2 mL（濃度范圍0～5 mg/mL）的胞外多糖樣品與2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液混勻，暗反應(yīng)30 min后，測(cè)定OD517nm，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除能力計(jì)算公式如下：

式中：A0：水與DPPH反應(yīng)的吸光度；A1：樣品與DPPH反應(yīng)的吸光度；A2：水與樣品反應(yīng)的吸光度，以排除樣品自身對(duì)試驗(yàn)的干擾。

1.2.10.2 ABTS+自由基清除能力 參照Peter等[16]的方法稍作修改，將2 mL（濃度范圍0～5 mg/mL）的胞外多糖樣品與4 mL 7 mmol/L的ABTS工作液混勻，室溫反應(yīng)6 min，以VC為陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定混合液OD734nm。ABTS+自由基清除能力計(jì)算公式：

式中：A0：水與ABTS反應(yīng)的吸光度；A1：樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；A2：水與樣品反應(yīng)的吸光度，以排除樣品自身對(duì)試驗(yàn)的干擾。

1.2.10.3 H2O2-自由基清除能力 參照Ruch等[17]的方法并稍作調(diào)整，將0.6 mL 40 mmol/L的H2O2溶液與2.4 mL 0.1 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液混勻，并向其中加入2 mL（濃度范圍0～5 mg/mL）的胞外多糖樣品，反應(yīng)體系混勻后于室溫反應(yīng)10 min，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定混合液OD230nm。H2O2-自由基清除能力計(jì)算公式：

式中：A0：磷酸鹽緩沖液與H2O2反應(yīng)的吸光度；A1：樣品與H2O2反應(yīng)的吸光度；A2：磷酸鹽緩沖液與樣品反應(yīng)的吸光度，以排除樣品自身對(duì)試驗(yàn)的干擾。

1.2.10.4 羥基自由基清除能力 根據(jù)Liu等[18]的報(bào)道，將2 mL（濃度范圍0～5 mg/mL）的胞外多糖樣品與1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液振蕩混勻，隨即加入1 mL 9 mmol/L的H2O2溶液以啟動(dòng)反應(yīng)發(fā)生，混勻后于37 ℃反應(yīng)40 min，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定混合液OD510nm。羥基自由基清除能力計(jì)算公式：

式中：A0：水與OH反應(yīng)的吸光度；A1：樣品與OH反應(yīng)的吸光度；A2：水與樣品反應(yīng)的吸光度，以排除樣品自身對(duì)試驗(yàn)的干擾。

1.2.10.5 總還原力 采用Chen等[19]的研究稍作調(diào)整，將2 mL（濃度范圍0～5 mg/mL）的胞外多糖樣品與2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液及2.5 mL 1%（w/v）的鐵氰化鉀溶液振蕩混勻，50 ℃反應(yīng)20 min，冷卻至室溫后，向反應(yīng)體系中加入2.5 mL 10%（w/v）的TCA溶液，4000 r/min離心30 min，取2.5 mL上清與0.5 mL 0.1%（w/v）的FeCl3溶液及2.5 mL去離子水振蕩混勻，反應(yīng)10 min，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定混合液OD700nm。

1.2.11 牛奶凝結(jié)試驗(yàn) 向滅菌后的10%（w/v）脫脂牛奶中分別加入3%、6%、9%及12%（w/v）的蔗糖。將Ln. mesenteroidesHDE1發(fā)酵液按1%的接種量接入到含不同蔗糖濃度的脫脂牛奶中，搖勻后于30 ℃靜止放置12、24及36 h，以不含蔗糖的脫脂牛奶為對(duì)照，觀察脫脂牛奶的凝結(jié)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理設(shè)置三個(gè)平行，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本研究使用Excel 2019（Microsoft, U.S.A.）軟件繪圖，使用JMP 10.0（LISHISAS）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及多重比較。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HDE1菌落形態(tài)特征

水果發(fā)酵液經(jīng)稀釋涂布、三區(qū)劃線后，獲得一株產(chǎn)胞外多糖菌株HDE1。在MRS瓊脂培養(yǎng)基上（圖1A），菌落呈現(xiàn)圓形、灰白色、凸起、邊緣整齊。在MRS-S瓊脂培養(yǎng)基上（圖1B），菌落為半透明、凸起、表面粘稠、有光澤，并且比MRS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落要大。李彬等[20]和Kanamarlapudi等[21]同樣在MRS-S培養(yǎng)基上篩選得到了產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌。以上結(jié)果均證明，蔗糖不僅可以作為乳酸菌生長(zhǎng)的碳源，還可以作為菌株產(chǎn)胞外多糖的誘導(dǎo)劑。

圖1 菌株HDE1在MRS（A）及MRS-S（B）平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain HDE1 on MRS (A) and MRS-S (B) agar plate

2.2 菌株HDE1產(chǎn)胞外多糖進(jìn)程

菌株在MRS-S培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及產(chǎn)胞外多糖進(jìn)程如圖2所示，在發(fā)酵初期，胞外多糖產(chǎn)量隨著菌株的生長(zhǎng)不斷增加，在發(fā)酵42 h時(shí)，菌株的活菌數(shù)達(dá)到13.4±0.10 lg CFU/mL，此時(shí)胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大。隨后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外多糖的產(chǎn)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。本研究中菌株HDE1與韓瑨等[22]研究的Ln. mesenteroidesLeuco 4相比產(chǎn)胞外多糖速度更快、產(chǎn)量更高。HDE1在42 h即可達(dá)到13.02±0.61 g/L而Leuco 4在80 h才能達(dá)到11 g/L。

圖2 菌株HDE1生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)胞外多糖進(jìn)程Fig.2 Growth curve and process for EPS production of strain HDE1

2.3 菌株HDE1 16S rDNA序列分析

菌株HDE1 16S rDNA部分序列長(zhǎng)度為1444 bp，GenBank登錄號(hào)為OM302141，該序列與Ln. mesenteroidesLAB-29（GenBank登錄號(hào)MT 953985.1）的16S rDNA基因序列相似度最高，同源性達(dá)98%（圖3）。

圖3 Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株HDE1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HDE1 by Neighbor-Joining method

2.4 菌株HDE1糖發(fā)酵特征

菌株API 50 CHL鑒定結(jié)果如表3所示，菌株可以利用L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖及D-甘露醇等，而不能利用甘露醇、D-阿拉伯糖、L-木糖及L-鼠李糖等，發(fā)酵特征與Ln. mesenteroides最為相似，相似度達(dá)99.9%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA分析，鑒定該菌株HDE1為L(zhǎng)n. mesenteroides。

表3 菌株HDE1的API 50 CHL鑒定結(jié)果Table 3 Identification results based on API 50 CHL test of strain HDE1

2.5 菌株HDE1胞外多糖純度檢測(cè)

發(fā)酵液經(jīng)TCA去蛋白、乙醇沉淀、透析及冷凍干燥后，獲得Ln. mesenteroidesHDE1胞外多糖粗品，呈白色棉花狀固體。HDE1胞外多糖溶液全波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖4所示，在260和280 nm附近沒有吸收峰，說(shuō)明胞外多糖中沒有核酸和蛋白的污染[23]。

圖4 Ln. mesenteroides HDE1胞外多糖的紫外光譜圖Fig.4 UV spectrums of the EPS from Ln. mesenteroides HDE1

2.6 菌株HDE1胞外多糖化學(xué)組成

HDE1胞外多糖的總糖含量為41.73%±1.74%，蛋白含量為0.29%±0.03%，糖醛酸含量為7.69%±0.42%，表明HDE1胞外多糖中含有少量的蛋白質(zhì)修飾，胡風(fēng)慶等[24]也曾報(bào)告過(guò)相關(guān)情況。葉廣彬等[25]之前報(bào)道的Ln. pseudomesenteroidesGX-3胞外多糖總糖含量最高才可達(dá)到38.42%±2.15%，研究結(jié)果展示HDE1的總糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GX-3。證明不同種屬來(lái)源的胞外多糖在化學(xué)組分上有差異。

2.7 菌株HDE1胞外多糖抗氧化活性

2.7.1 DPPH自由基清除能力 如圖5所示，隨著HDE1胞外多糖質(zhì)量濃度的升高，DPPH自由基清除能力不斷升高。當(dāng)胞外多糖濃度為1.3 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到37%±0.05%，胞外多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除能力達(dá)到50.00%±0.05%。董樂等[26]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，胞外多糖對(duì)DPPH自由基清除率為19.32%。不同來(lái)源的胞外多糖可能因?yàn)閱翁墙M成、羥基和羧基的含量以及供氫能力不同，使得DPPH自由基清除能力上存在差異[27]。

圖5 Ln. mesenteroides HDE1胞外多糖的DPPH自由基清除率Fig.5 Scavenging activity of DPPH free radical of Ln.mesenteroides HDE1 EPS

2.7.2 ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基清除率結(jié)果如圖6所示，當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS的清除能力超過(guò)了20%。隨著胞外多糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，ABTS+自由基清除能力也隨之增強(qiáng)，胞外多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，ABTS+自由基清除能力達(dá)到40.00%±0.02%。

圖6 Ln. mesenteroides HDE1胞外多糖的ABTS+自由基清除率Fig.6 Scavenging activity of ABTS+ free radical of Ln.mesenteroides HDE1 EPS

2.7.3 H2O2-自由基清除能力 對(duì)于食物或細(xì)胞的功能性來(lái)說(shuō)，清除羥基來(lái)防御被氧化是至關(guān)重要的[28]。HDE1胞外多糖和VC對(duì)H2O2自由基清除活性如圖7所示。胞外多糖和VC的清除能力均呈現(xiàn)濃度依賴性，但HDE1胞外多糖的清除能力始終低于VC，當(dāng)胞外多糖濃度為5 mg/mL時(shí)H2O2-自由基清除能力超過(guò)了50%，明顯高于紫芝（Ganoderma sinense）GSP2胞外多糖[29]，優(yōu)化后的GSP2含量為10 mg/mL時(shí)，H2O2-自由基清除率僅達(dá)到了48.12%。研究結(jié)果表明HDE1胞外多糖具有良好的H2O2-自由基清除活性。-

圖7 Ln. mesenteroidesHDE1胞外多糖的H2O2自由基清除率Fig.7 Scavenging activity of H2O2 of Ln. mesenteroides HDE1 EPS

2.7.4 羥基自由基清除能力 從圖8可以看出，HDE1胞外多糖和VC均表現(xiàn)出羥基自由基的清除活性，且羥基自由基清除能力呈濃度依賴性。Ye等[30]與崔靜等[31]試驗(yàn)研究結(jié)果均可證明，胞外多糖濃度越高，羥基自由基清除效果越強(qiáng)。在濃度為5 mg/mL時(shí)，HDE1胞外多糖對(duì)羥基自由基清除能力達(dá)到49.96%±0.03%，表明HDE1胞外多糖有良好的羥基自由基清除能力。

圖8 Ln. mesenteroides HDE1胞外多糖的羥基自由基清除率Fig.8 Scavenging activity of hydroxy lradicals of Ln.mesenteroides HDE1 EPS

2.7.5 總還原力 總還原力是通過(guò)測(cè)定樣品在700 nm處Fe3+/鐵氰化物配合物還原成亞鐵的吸光度來(lái)估算樣品還原能力。具有還原力的化學(xué)物質(zhì)可以提供氫原子來(lái)阻斷過(guò)氧化物的形成，進(jìn)而破壞自由基反應(yīng)鏈，展現(xiàn)抗氧化能力[28]。如圖9所示，隨著質(zhì)量濃度的升高，胞外多糖和VC的總還原力呈現(xiàn)先急速上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)，但胞外多糖的總還原力始終低于VC。在濃度為5 mg/mL時(shí)，胞外多糖的總還原力為38.82%±0.09%，高于Ln. pseudomesenteroidesGX-3胞外多糖[22]和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）SR2-2胞外多糖[32]。

圖9 Ln. mesenteroides HDE1胞外多糖的還原力Fig.9 Scavenging activity of reducing power of Ln.mesenteroides HDE1 EPS

2.8 牛奶凝結(jié)

Ln. mesenteroidesHDE1對(duì)脫脂牛奶的凝結(jié)效果如圖10所示。與無(wú)蔗糖的脫脂牛奶相比，蔗糖的存在使得脫脂牛奶均呈現(xiàn)出一定程度的凝固效果，并且隨著蔗糖濃度和培養(yǎng)時(shí)間的增加，凝結(jié)效果越強(qiáng)。當(dāng)蔗糖的濃度為12%，并且培養(yǎng)至36 h時(shí)，凝結(jié)效果最強(qiáng)，這證明蔗糖誘導(dǎo)菌株產(chǎn)胞外多糖，且胞外多糖的產(chǎn)量隨蔗糖濃度和時(shí)間的升高而增加。與Zhao等[33]曾報(bào)道過(guò)的融合魏斯氏菌（Weissella. confusa）XG-3相比，蔗糖濃度同為3%時(shí)HDE1使牛奶凝結(jié)的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于W. confuseXG-3，36 h HDE1即可使脫脂牛奶完全凝結(jié)，而W. confuseXG-3則需要48 h。研究結(jié)果表明HDE1利用蔗糖作為底物產(chǎn)胞外多糖的能力高于W. confuseXG-3。上述結(jié)果證明Ln. mesenteroidesHDE1在發(fā)酵乳制品方面具有很好的應(yīng)用潛力。

圖10 Ln. mesenteroides HDE1對(duì)含不同蔗糖濃度脫脂牛奶凝結(jié)的影響Fig.10 Effects of Ln. mesenteroides HDE1 on condensation of skim milk with different sucrose concentrations

3 結(jié)論

本研究從自制水果發(fā)酵液中分離得到一株產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌HDE1，其胞外多糖的總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量分別為41.73%±1.74%、0.29%±0.03%和7.69%±0.42%。經(jīng)形態(tài)特征、16S rDNA及API 50 CHL試驗(yàn)，鑒定為L(zhǎng)n. mesenteroides。HDE1胞外多糖具有較高的抗氧化活性，在0～5 mg/mL范圍內(nèi)隨著胞外多糖濃度的增加，抗氧化活性增強(qiáng)。牛奶凝結(jié)研究結(jié)果表明，HDE1在36 h能夠使添加3%（w/v）蔗糖的脫脂牛奶完全凝結(jié)，展示出作為天然食品添加劑或抗氧化劑應(yīng)用和開發(fā)前景。此外，雖然胞外多糖在抗氧化方面發(fā)揮著重要作用，但具體的機(jī)制尚不明確，應(yīng)進(jìn)一步研究抗氧化作用機(jī)制，還應(yīng)利用臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)知識(shí)和設(shè)備進(jìn)一步研究驗(yàn)證其抗氧化作用。