薄 杉,夏 斌,劉銘宇,陳 斌,孫 穎,李 強(qiáng),何 淼
(東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,哈爾濱150040)
土壤鹽堿化是當(dāng)前全世界面臨的一個(gè)非常棘手的問(wèn)題[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),世界鹽漬土總面積約10億hm2,中國(guó)鹽漬土總面積超過(guò)3600萬(wàn)hm2,占中國(guó)可利用土地面積的4.88%[3]。并且,生態(tài)破壞的不斷加劇使鹽堿土的面積與日俱增。鹽堿化嚴(yán)重的土壤會(huì)導(dǎo)致植物代謝紊亂,發(fā)生滲透脅迫、離子毒害,使得植物生長(zhǎng)不良,甚至死亡,造景效果大打折扣[4-5],但植物中的高抗鹽類(lèi)群對(duì)鹽堿化土壤有良好的適應(yīng)性,在鹽堿土上依然有著較好的觀賞效果[6]。所以,改良鹽堿土,促進(jìn)土壤鹽堿化嚴(yán)重地區(qū)的園林事業(yè)發(fā)展,可以通過(guò)獲得高抗鹽優(yōu)異植物類(lèi)群,并更多地了解其抗鹽機(jī)理來(lái)實(shí)現(xiàn)。
野菊(ChrysanthemumindiumL.),屬于菊科(Compositae)菊屬(DendraothemasGaertn.),為一種多年生草本植物[7]。菊花是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一,觀賞效果好,園林應(yīng)用價(jià)值高[8]。由于野菊源自野外,對(duì)各種生境的適應(yīng)性強(qiáng)于其他菊花品種,且野菊和其他品種的菊花擁有很近的親緣關(guān)系[9]。所以,在發(fā)掘抗鹽性強(qiáng)的野菊株系的基礎(chǔ)上對(duì)野菊的抗鹽性進(jìn)行研究,對(duì)于改善菊花群體的抗鹽性、促進(jìn)菊花在鹽堿地的應(yīng)用與推廣、豐富鹽堿地植物種類(lèi)具有重要意義。但目前,對(duì)野菊的研究主要集中在繁育栽培[10]以及食藥用價(jià)值[11]方面,對(duì)其抗鹽性的研究較少。本研究以引自遼寧省本溪市及周邊區(qū)縣的207個(gè)野菊株系作為試驗(yàn)材料進(jìn)行抗鹽性篩選,以獲得野菊自然群體中的抗鹽株系,并分析其中6個(gè)株系在鹽脅迫下的表型、光合生理及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化情況,以期初步探明野菊的抗鹽機(jī)理,為日后對(duì)野菊抗鹽機(jī)制的更深入研究及菊花抗鹽新品種的培育奠定理論基礎(chǔ),使北方地區(qū)鹽堿地的園林綠化有著更加豐富的植物資源。
試驗(yàn)于2020年9-12月在東北林業(yè)大學(xué)園林苗圃進(jìn)行,抗鹽株系篩選的試驗(yàn)材料為引自遼寧省本溪市及周邊區(qū)縣的207個(gè)野菊株系。
篩選試驗(yàn)后,從得出的高、中、低抗3大類(lèi)群中分別選擇2個(gè)株系[2個(gè)高抗株系:3-25-2(A),4-4-6(B),2個(gè)中抗株系:3-18-3(C)、2-13-2(D),2個(gè)低抗株系:5-11-2(E)、4-7-2(F)]作為抗鹽機(jī)理研究的試驗(yàn)材料。
1.2.1 試驗(yàn)材料的前期準(zhǔn)備 選取野菊頂端生長(zhǎng)良好且無(wú)病蟲(chóng)害的莖段進(jìn)行扦插繁殖,扦插基質(zhì)為珍珠巖,扦插后于溫室中養(yǎng)殖。待扦插苗根長(zhǎng)為1~2 cm時(shí),選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的單株進(jìn)行試驗(yàn)。
試驗(yàn)前,用蒸餾水將野菊根部清洗干凈,隨后對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)修剪,使每個(gè)野菊單株均保留4~6片真葉。將待測(cè)野菊置于塑料箱中水培,水培液是霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液,每2 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液,水培7 d后進(jìn)行鹽脅迫處理。
1.2.2 鹽脅迫處理 抗鹽株系篩選試驗(yàn)時(shí),將分析純NaCl固體溶于塑料箱中的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中,使得溶液中的NaCl濃度達(dá)到且保持在150 mmol/L。每個(gè)株系設(shè)置15個(gè)重復(fù)。
抗鹽機(jī)理試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)鹽處理組和1個(gè)對(duì)照組,處理組的鹽脅迫處理方式同抗鹽株系篩選試驗(yàn),對(duì)照組繼續(xù)用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)為15株。
1.2.3 野菊抗鹽評(píng)價(jià)體系的建立與抗鹽株系篩選 野菊抗鹽評(píng)價(jià)體系的建立:參照劉曉靜等[12]對(duì)草坪草質(zhì)地評(píng)價(jià)的方法,參照尹冬梅等[13]、宋釗等[14]對(duì)植物耐澇性的評(píng)價(jià)方法,確定對(duì)野菊抗鹽性的評(píng)價(jià)方式:對(duì)鹽脅迫后野菊表型的變化情況進(jìn)行賦分,根據(jù)賦分高低對(duì)其抗鹽性的強(qiáng)弱進(jìn)行排名,并結(jié)合管志勇等[15]對(duì)菊花近緣屬植物抗鹽性評(píng)價(jià)的研究方法,選擇出現(xiàn)受害癥狀的時(shí)間,全株葉片枯萎的時(shí)間,鹽脅迫后120 h時(shí)的莖色、葉色、葉片枯黃率5個(gè)指標(biāo)對(duì)野菊株系的抗鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)聚類(lèi)分析法將此次引種的野菊根據(jù)抗鹽性強(qiáng)弱進(jìn)行分級(jí)。
評(píng)分方法:鹽處理后,每隔24 h觀察株系的表型變化,統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)脅迫癥狀的單株以及葉片全部枯萎的單株,根據(jù)各個(gè)單株出現(xiàn)受害癥狀、葉片全部枯萎發(fā)生的時(shí)間進(jìn)行賦分。鹽脅迫處理120 h后,統(tǒng)計(jì)各株系每個(gè)單株的枯黃率、葉色及莖色并賦分。葉色與莖色均使用NCS比色卡進(jìn)行比色,其中葉色通過(guò)比對(duì)自上而下第3片真葉的顏色確定得分。莖色通過(guò)比對(duì)莖與鹽溶液接觸部位附近的顏色確定得分。葉片枯黃率參照張靜等[16]對(duì)竹節(jié)草(Chrysopogonaciculatus)耐鹽臨界濃度研究時(shí)所采用的目測(cè)打分法進(jìn)行估算,最后根據(jù)枯黃率的高低進(jìn)行賦分。每個(gè)指標(biāo)的評(píng)分取平均值。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。
表1 野菊抗鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation index and scoring standard of salt resistance of C.indicum
分?jǐn)?shù)的匯總與分析:評(píng)分完成后,將各項(xiàng)指標(biāo)得分的平均值四舍五入取整數(shù),得出其最終得分。將各指標(biāo)最終得分相加,獲得各個(gè)株系的總分。根據(jù)總分的高低對(duì)各個(gè)株系的抗鹽性進(jìn)行排名,隨后以總分為依據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。
1.2.4 生理指標(biāo)的測(cè)定 抗鹽機(jī)理探究試驗(yàn)進(jìn)行72 h(保證所有株系均能正常取樣與測(cè)量)后,進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。
光合色素含量的測(cè)定:選取植株頂部第3~5片功能葉,采用丙酮-乙醇混合液浸提法[17]測(cè)量葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類(lèi)胡蘿卜素的含量,并計(jì)算葉綠素a+b(Chl T)、葉綠素a/b的值。
光合指標(biāo)的測(cè)定:使用Li-6400光合儀在晴朗無(wú)風(fēng)的上午9:00-11:30測(cè)量?jī)艄夂纤俾?Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Cond),測(cè)量時(shí)選擇植株自頂部第3~5片功能葉。選用紅藍(lán)光源葉室,設(shè)置光照度800 μmol/(m2·s),溫度設(shè)置為25 ℃,以大氣CO2作為CO2氣源。每個(gè)株系的每個(gè)處理測(cè)量3個(gè)植株,每個(gè)植株重復(fù)測(cè)定3次。計(jì)算水分利用效率(WUE =Pn/Tr)、表觀葉肉導(dǎo)度(AMC=Pn/Ci)、氣孔限制值(Ls= 1 -Ci/Ca)。
滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定:選取植株自頂部第3~5片功能葉,采下后用錫箔紙包裹,迅速放入液氮桶中帶回試驗(yàn)室,置于-80 ℃冰箱,待測(cè)。采用蒽酮比色法[17]測(cè)定可溶性糖含量,采用酸性茚三酮[16]法測(cè)定脯氨酸含量,采用TBA法[17]測(cè)定丙二醛含量。
采用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與計(jì)算,采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用R studio進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。
對(duì)野菊出現(xiàn)脅迫癥狀時(shí)間,全株葉片枯萎時(shí)間,鹽脅迫后120 h時(shí)的莖色、葉色、葉片枯黃率5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分?;谒每偡謱?duì)引種野菊的抗鹽性進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析,結(jié)果如圖1所示。通過(guò)系統(tǒng)聚類(lèi),在距離為10處,根據(jù)抗鹽性的高低將本次引種的野菊聚為3類(lèi):高抗株系有111個(gè),中抗株系有44個(gè),低抗株系有52個(gè)。
圖中各數(shù)字字符代表不同的野菊株系
如圖2所示,試驗(yàn)進(jìn)行72 h后對(duì)照組與處理組的表型之間差別明顯。對(duì)照組中各株系均生長(zhǎng)良好,莖葉的顏色及形態(tài)均未發(fā)生明顯變化。處理組各株系的外部形態(tài)發(fā)生一定變化,高抗株系A(chǔ)、B的葉片變?yōu)闇\綠色,邊緣發(fā)生輕微萎蔫,莖的形態(tài)及顏色未發(fā)生明顯變化。中抗株系C、D的葉片變?yōu)辄S綠色,且有一定程度的萎蔫、皺縮,莖色略微變淺,莖的形態(tài)無(wú)明顯變化。低抗株系E、F的葉片黃化較為嚴(yán)重,部分葉片枯萎、脫落,莖色變?yōu)榈稚蚝稚页霈F(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。
圖2 鹽脅迫下野菊表型的變化Fig.2 Changes of phenotypic in C.indicum under salt stress
如表2所示,與對(duì)照組相比,除株系A(chǔ)的葉綠素a含量外,處理組中各株系光合色素含量均顯著下降(P<0.05),株系F的下降幅度最大。處理組中,株系D與株系F葉綠素a/b的值較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。
表2 鹽脅迫下野菊光合色素的含量Table 2 Photosynthetic pigment content in C.indicum under salt stress
處理組中株系A(chǔ)到株系F的光合色素含量均為下降趨勢(shì),且大部分株系之間存在顯著差異(P<0.05),葉綠素a/b的值在各株系之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
如表3所示,對(duì)照組的凈光合速率、蒸騰速率均顯著高于處理組(P<0.05)。除株系A(chǔ)、B外,對(duì)照組的水分利用效率高于處理組。除株系E、F外,對(duì)照組的胞間CO2濃度高于處理組,氣孔限制值低于處理組。對(duì)照組的氣孔導(dǎo)度、表觀葉肉導(dǎo)度均高于處理組,株系A(chǔ)的氣孔導(dǎo)度、株系B的表觀葉肉導(dǎo)度與對(duì)照組相比差異不顯著 (P>0.05)。
表3 鹽脅迫下各株系野菊的光合指標(biāo)Table 3 Photosynthetic indexes in C.indicum under salt stress
處理組中,除水分利用效率、表觀葉肉導(dǎo)度外,各株系間的各項(xiàng)光合指標(biāo)均具顯著性差異 (P<0.05)。株系A(chǔ)到株系F的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、水分利用效率、均呈不斷降低的趨勢(shì),胞間CO2濃度為先降低后升高的趨勢(shì),氣孔限制值、表觀葉肉導(dǎo)度為先升后降的趨勢(shì)。
如表4所示,處理組中各株系的脯氨酸、可溶性糖含量及丙二醛含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。處理組中株系A(chǔ)到株系F的脯氨酸、可溶性糖含量呈不斷降低趨勢(shì)(表4)。丙二醛含量呈不斷上升趨勢(shì)。處理組各株系間的脯氨酸含量均存在顯著差異(P<0.05)。除株系A(chǔ)、B外,處理組各株系間的可溶性糖、丙二醛含量存在顯著差異(P<0.05)。
表4 鹽脅迫下野菊滲透調(diào)節(jié)相關(guān)物質(zhì)含量的變化Table 4 Changes of osmoregulation related substances in C.indicum under salt stress
篩選是獲得優(yōu)良種質(zhì),改善植物群體整體質(zhì)量的基礎(chǔ)[18]。植物抗性的篩選主要基于形態(tài)指標(biāo)與生理指標(biāo)兩個(gè)方面[19]。其中,表型變化是植物受到逆境脅迫最直接的反應(yīng),比如莖葉萎蔫、變色等[20]。所以,根據(jù)表型可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量種質(zhì)資源進(jìn)行抗性篩選。聚類(lèi)分析是根據(jù)客觀反映研究對(duì)象之間遠(yuǎn)近關(guān)系的統(tǒng)計(jì)量(距離或相似性指數(shù)),對(duì)研究對(duì)象在排除人為主觀因素影響的基礎(chǔ)上進(jìn)行分類(lèi)[21]。通過(guò)賦分排名及系統(tǒng)聚類(lèi)分析可知,本研究中207個(gè)引種野菊株系的抗鹽性存在一定差異,有111個(gè)株系為高抗鹽株系,可能是在不同的生長(zhǎng)環(huán)境下,土壤的成分與周邊的環(huán)境使得野菊在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生一定的鹽適應(yīng)性。后期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,各株系在鹽處理后表型均產(chǎn)生一定變化,抗鹽性越強(qiáng)的株系表型變化越不顯著。由此可見(jiàn),抗鹽性強(qiáng)的株系擁有較完備的鹽響應(yīng)機(jī)制,能夠在鹽脅迫下基本保持正常的外部形態(tài),是進(jìn)行抗鹽性研究的重要材料。
光合色素具有吸收、傳遞光子的功能,是植物光合作用中至關(guān)重要的成分,其含量與比例的變化可作為評(píng)價(jià)植物受脅迫影響程度的重要指標(biāo)[22]。本研究結(jié)果表明,處理組中各株系的光合色素含量較對(duì)照組有所降低,且抗鹽性越強(qiáng)的株系降低幅度越小,這與丁丁等[23]的研究結(jié)果一致,原因可能是過(guò)多的Na+會(huì)嚴(yán)重影響植物對(duì)其他元素的吸收,這些元素有些是光合色素合成所必需的元素,最終使得光合色素的合成受阻[24]。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致葉肉細(xì)胞受損,使得葉綠素降解酶活性升高,加速葉綠素的分解,從而導(dǎo)致葉綠素含量下降[25]。由于類(lèi)胡蘿卜素具有消耗過(guò)剩光能的作用,但鹽脅迫使得野菊對(duì)光能的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)受阻,使得類(lèi)胡蘿卜素發(fā)揮的作用很小,所以類(lèi)胡蘿卜素含量的降低可能會(huì)使野菊在受到鹽脅迫時(shí)不至于消耗過(guò)多的有機(jī)物[26]。葉綠素a/b的值在不同處理、不同株系之間的變化相對(duì)較小,表明鹽脅迫對(duì)于葉綠素a與葉綠素b的影響大致相等,僅在脅迫較重時(shí),鹽脅迫對(duì)于葉綠素a的影響大于對(duì)葉綠素b的影響。
光合作用是植物進(jìn)行物質(zhì)合成與能量代謝的基礎(chǔ),是植物對(duì)于鹽脅迫最為敏感的生理過(guò)程之一[27-28]。通過(guò)凈光合速率可直接對(duì)植物光合作用的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)[29]。本研究結(jié)果表明,處理組的凈光合速率顯著低于對(duì)照組,抗鹽性越強(qiáng)的株系下降幅度越小,表明鹽脅迫對(duì)野菊的光合代謝過(guò)程產(chǎn)生一定的影響,受影響的程度與株系的抗鹽性密切相關(guān),這與王旭明等[25]的研究結(jié)果一致。
導(dǎo)致鹽脅迫下植物光合速率下降的原因可分為氣孔因素與非氣孔因素。葛江麗等[30]的研究表明氣孔因素與非氣孔因素之間不是相互獨(dú)立的,多重因素的影響會(huì)導(dǎo)致二者發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。氣孔導(dǎo)度、氣孔限制值、胞間CO2濃度是反應(yīng)氣孔情況的重要指標(biāo),其中,氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度同時(shí)下降表明植物光合速率下降主要是由氣孔因素導(dǎo)致的[31]。本研究結(jié)果表明,除低抗株系E、F外,其他各株系的氣孔導(dǎo)度與胞間CO2濃度均低于對(duì)照組,氣孔限制值高于對(duì)照組,表明在脅迫癥狀不重時(shí),氣孔因素是導(dǎo)致野菊光合速率下降的主要因素。表觀葉肉導(dǎo)度可反映RuBPCase活性的高低,是用于評(píng)價(jià)非氣孔限制程度的指標(biāo)之一[32]。本研究結(jié)果表明,處理組各株系的表觀葉肉導(dǎo)度普遍低于對(duì)照組,抗鹽性越強(qiáng)的株系偏低幅度越小,表明隨著脅迫癥狀的加重,非氣孔因素逐漸成為導(dǎo)致野菊光合作用下降的主導(dǎo)因素,這與荊培培等[33]的研究一致。
鹽脅迫下,植物體很容易失去水分。蒸騰速率與水分利用效率是光合作用中與水分關(guān)系最為密切的兩個(gè)指標(biāo),并且水分利用效率是反應(yīng)植物在鹽脅迫下能量轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵指標(biāo),可在一定程度上反應(yīng)其抗鹽性的強(qiáng)弱[34]。本研究結(jié)果表明,處理組中各株系的蒸騰速率普遍低于對(duì)照組,除株系A(chǔ)、B外,處理組中各株系的水分利用效率低于對(duì)照組,且抗鹽性越強(qiáng)的株系不汾利用效率和蒸騰速率越高。表明鹽脅迫對(duì)野菊的水分代謝機(jī)制產(chǎn)生一定的影響,且抗鹽性強(qiáng)的野菊株系在鹽脅迫下有著較高的能量轉(zhuǎn)化效率,能基本維持水分代謝平衡。抗鹽性不同的株系蒸騰速率下降的原因有所不同,對(duì)于較高抗株系而言,其增大氣孔阻力來(lái)減少水分流失導(dǎo)致蒸騰速率略有下降,而對(duì)于低抗的株系而言,鹽脅迫導(dǎo)致其膜系統(tǒng)受損嚴(yán)重,這種情況下,葉肉細(xì)胞的光化學(xué)活性嚴(yán)重偏低,從而導(dǎo)致CO2的利用效率明顯降低,最終使光合速率與蒸騰速率與對(duì)照組或其他株系相比明顯偏低[35]。
滲透調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的重要生理機(jī)制之一,對(duì)于調(diào)節(jié)植物水勢(shì)的平衡與保持膜系統(tǒng)的完整起著關(guān)鍵的作用[36]。有研究表明可溶性糖是非鹽生植物的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),也可以作為在脅迫下儲(chǔ)存能量的一種形式[37]。脯氨酸具有清除羥基自由基的作用,保護(hù)膜系統(tǒng)免受鹽的毒害,同時(shí)維持正常的細(xì)胞膨壓[38-39]。本研究結(jié)果表明,處理組中各株系的脯氨酸與可溶性含量均明顯高于對(duì)照組,表明野菊可通過(guò)合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫帶來(lái)的不利影響。處理組中,自株系A(chǔ)到株系F,可溶性糖與脯氨酸含量的下降趨勢(shì)為先緩后急,原因可能是抗鹽性較強(qiáng)的株系在該濃度的鹽脅迫下未將滲透調(diào)節(jié)作為主要的抗鹽機(jī)制,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量依舊存在提升空間,但隨著抗鹽性的不斷減弱,野菊合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力亦在減弱,加之鹽脅迫對(duì)其生理代謝活動(dòng)造成的影響更加不利于其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成,形成了惡性循環(huán),導(dǎo)致自株系C到株系F滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量出現(xiàn)了急劇降低的趨勢(shì)。株系C的脯氨酸含量顯著大于株系B,說(shuō)明脯氨酸是野菊在較重鹽脅迫下的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),這與李碩[40]等的研究結(jié)果一致。丙二醛是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物,其含量可用來(lái)衡量植物受脅迫影響嚴(yán)重程度的大小[41]。本研究表明,處理組中各株系的丙二醛含量較對(duì)照組均顯著升高,且抗鹽性越強(qiáng)株系升高幅度越小,表明鹽脅迫下野菊的膜系統(tǒng)均遭到了不同程度的破壞,但抗鹽性較強(qiáng)的株系的膜系統(tǒng)遭到破壞的程度較小,從而在一定程度上保證生理代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行。
本研究以150 mmol/L NaCl水培作為脅迫方式,基于表型變化結(jié)合聚類(lèi)分析對(duì)207個(gè)引種野菊株系進(jìn)行抗鹽性篩選,并對(duì)野菊抗鹽生理機(jī)制展開(kāi)研究。發(fā)現(xiàn)引種野菊中有111個(gè)株系對(duì)鹽脅迫有較強(qiáng)的抗性,抗鹽性較強(qiáng)野菊在鹽脅迫下的水分代謝與合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力較強(qiáng),從而有效減緩光合色素的分解,保證光合作用不受過(guò)大的影響,最終使得表型上發(fā)生的變化較小。本研究為菊花抗鹽新品種的選育與抗鹽性更深層次的研究奠定了基礎(chǔ)。