何文鳳，薛 成，鄭健康，帥 壯，岳榮川

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科心血管疾病實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000)

心肌梗死是導(dǎo)致心血管疾病人群死亡的主要原因，冠狀動(dòng)脈介入治療和動(dòng)脈旁路植入術(shù)等是目前臨床治療該類患者的主要措施，上述手術(shù)治療措施雖可在短時(shí)間內(nèi)快速開通患者的閉塞血管，但也會(huì)明顯增加患者發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。目前，關(guān)于MIRI的具體發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，多數(shù)研究結(jié)果認(rèn)為鈣離子超載、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡等因素與MIRI的發(fā)生密切相關(guān)[3]。分子心血管病學(xué)研究結(jié)果已證實(shí)，細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞損傷的主要形式，而此過程的發(fā)生與多種基因的調(diào)控作用密切相關(guān)[4-5]。鈣蛋白酶(Calpain)是一種普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的鈣依賴的蛋白酶，當(dāng)心肌缺血/再灌注(I/R)發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Calpain會(huì)被異常激活，進(jìn)而促使凋亡物質(zhì)大量釋放，加重心肌細(xì)胞損傷[6-7]。盧圣忠[8]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Calpain對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心肌功能障礙的發(fā)生具有明顯的促進(jìn)作用，而抑制Calpain活性則可起到減輕I/R損傷的效果。大量臨床證據(jù)已證實(shí)，曲美他嗪對(duì)MIRI具有明確的治療效果，但其具體改善機(jī)制尚不明確。本研究推測(cè)曲美他嗪可能是通過調(diào)控Calpain和細(xì)胞焦亡過程來起到減輕心肌損傷的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠30只，SPF級(jí)，體重200～250 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供[合格證號(hào)：SCXK(京) 2016_0008]。

1.1.2 儀器：DY89-11型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；VCX130PB型超聲波細(xì)胞破碎儀(美國Sonics公司)；ES315型自動(dòng)蒸氣消毒柜(日本Tomy公司)；VS-1300L-U型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；80-2型低速臺(tái)式離心機(jī)(上海百典儀器設(shè)備有限公司)；Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；LSM 780型高靈敏度激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；熒光分光光度計(jì)(美國Cary Eclipse VARIAN公司)；電子天平(德國Sartorius公司)；顯微外科器械(寧波市成和顯微器械廠)；日立7060型全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司)。

1.1.3 藥品與試劑：鹽酸曲美他嗪緩釋片[施維雅(天津)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20100077，規(guī)格：35 mg]，用蒸餾水配置為30 mg/L的混懸液備用。大鼠肌酸激酶(CK)測(cè)定試劑盒 (蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20200629)；大鼠乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20200629)；無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：16A20B21)；DNA原位末端標(biāo)記(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒(上海金畔生物科技有限公司，貨號(hào)：22849)；Caspase-1活性檢測(cè)試劑盒(美國Biomol公司，貨號(hào)：KLPR2107)；白細(xì)胞介素(IL)1β檢測(cè)試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào)：FN-EM1624)；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)抗體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)抗體(美國Abcam公司，貨號(hào)：KLPR2107、2257223)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的喂養(yǎng)：在室內(nèi)自然照明條件下對(duì)大鼠進(jìn)行7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前后的動(dòng)物喂養(yǎng)條件保持一致，本研究過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理均嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理學(xué)中的相關(guān)規(guī)定。

1.2.2 動(dòng)物分組和造模：將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組和曲美他嗪干預(yù)組。Sham組大鼠僅置縫線，不對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎。模型組和曲美他嗪干預(yù)組均采用手術(shù)結(jié)扎大鼠心肌冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)的方法進(jìn)行造模，具體如下，采用戊巴比妥對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，而后將其以仰臥位固定于操作臺(tái)之上，并以加熱等進(jìn)行照射，確保直腸溫度始終處于36.5～37.5 ℃。氣管插管后，以小型嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行通氣，呼吸頻率為75次/min，呼吸比為1∶ 1，潮氣量為20 mL；以左胸闊為手術(shù)切口，打開胸腔，于胸骨左邊緣2 mm處和第二、第三肋骨點(diǎn)之間進(jìn)行縱向切口，并將心包切開，使心臟外露；使用8/0尼龍線穿過LAD近端部分下方的心肌，LAD系活結(jié)，并外露結(jié)扎末端；LAD閉塞30 min，打開活結(jié)恢復(fù)血流2 h，而后使用捆扎前放置好的縫合線將大鼠胸部縫合。采用心電圖對(duì)造模大鼠進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，若心電圖ST段抬高≥0.3 mV或T波迅速升高、局部心肌出現(xiàn)紫紺表示存在心肌缺血；心電圖ST段降低或T波恢復(fù)至正常水平、心肌缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅則表示MIRI模型造模成功。

1.2.3 給藥方法：待造模完成進(jìn)行給藥，三組大鼠灌胃劑量根據(jù)成人每日常規(guī)用藥劑量，按動(dòng)物體表面積換算成大鼠日等效劑量。曲美他嗪干預(yù)組大鼠每日給藥劑量為20 mg/kg，Sham組、模型組大鼠則應(yīng)用相同劑量的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃處理，1日1次，持續(xù)1周。

1.2.4 取材：(1)大鼠血清。待再灌注結(jié)束時(shí)，采集大鼠腹主動(dòng)脈血液，并于4 ℃條件下以4 000 r/min進(jìn)行離心，10 min后，留取上清液并置于-80 ℃環(huán)境中待統(tǒng)一檢測(cè)。(2)大鼠心肌組織。除伊文思藍(lán)和氯化三苯基四氮唑法(TTC法)染色的大鼠心臟外，其他大鼠均在收集血清樣本后立即處死，切除心臟并以冷鹽水進(jìn)行充分洗滌后，在保持于4%多聚甲醇中備用。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色：將經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h的心尖部組織進(jìn)行石蠟包埋處理后，制成5 μm切片，并以二甲苯、100%乙醇、75%乙醇梯度進(jìn)行脫水處理后，以蒸餾水充分洗凈；經(jīng)蘇木精染色、自來水清洗、鹽酸乙醇分化處理后，浸泡于自來水中，加入伊紅液，經(jīng)95%乙醇、100%乙醇、二甲苯依次處理后，以中性樹膠進(jìn)行封固，并于顯微鏡下觀察組織情況。

1.2.6 心肌梗死面積估算：采用伊文思藍(lán)和TTC雙染色法確定大鼠心肌梗死和缺血區(qū)域。首先將切片置于1% TTC溶液中，并于37 ℃條件下進(jìn)行孵育，時(shí)間為15 min。判斷標(biāo)準(zhǔn)：非梗死區(qū)呈紅色，梗死區(qū)不染色。使用數(shù)碼相機(jī)拍攝照片，并通過專業(yè)圖像分析軟件(Sigma ScanPro v4.0，美國Ashburn公司)對(duì)心肌梗死面積的比例進(jìn)行計(jì)算。梗死區(qū)域?yàn)樾募≈形幢籘TC染色的灰白區(qū)域；非梗死心肌呈紅色，紅色和灰白色交界處為缺血區(qū)。以缺血區(qū)與左心室(LV)的百分比表示梗死危險(xiǎn)區(qū)，以梗死區(qū)域占缺血區(qū)的百分比表示心肌梗死面積。

1.2.7 心肌酶檢測(cè)：取部分備用血清樣本，經(jīng)解凍處理后，采用速率法檢測(cè)血清CK和LDH水平。

1.2.8 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用TUNEL法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，取備用心肌組織，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化處理后，滴加20 μg/mL蛋白酶k，于37 ℃環(huán)境中孵育15 min，以PBS溶液沖洗3次后(每次5 min)，使用0.3%H2O2進(jìn)行封閉處理，37 ℃孵育15 min，而后按照標(biāo)記液與酶濃縮液9∶ 1的比例配制TUNEL反應(yīng)液(冰上操作)。制備完畢后，將組織切片放入濕盒，滴加TUNEL反應(yīng)液，37 ℃避光孵育1.5 h。PBS溶液再次沖洗，每次5 min，沖洗3次；滴加適量Hoechst 33342染色液，室溫(25 ℃)、避光條件下孵育5 min，再次使用PBS進(jìn)行沖洗，共3次，每次5 min；最后置于室溫條件下風(fēng)干組織切片，用抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.9 Calpain活性檢測(cè)：SUC-LLVY-AMC作為熒光底物，通過檢測(cè)其降解產(chǎn)物AMC的量以評(píng)估Calpain活性。取部分心肌組織制備150 μL心肌勻漿液，加入1 mL反應(yīng)緩沖液，并置于37 ℃恒溫水浴箱中進(jìn)行振蕩，10 min后再加入150 μL N-Scuccinyl-Leu-Tyr-AMC(500 μmol/L)，繼續(xù)振蕩1 h。取1 mL加入比色皿中，使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)設(shè)定為360 nm，測(cè)定440 nm處發(fā)射的熒光強(qiáng)度。以已知濃度的AMC制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以“ngAMC/min·(mg蛋白)”表示檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果

Sham組大鼠心肌細(xì)胞核清晰可辨，心肌纖維整齊排列，胞漿均勻著色；模型組大鼠心肌細(xì)胞核濃縮，心肌纖維排列混亂，細(xì)胞變性呈空泡狀，且可伴有炎癥細(xì)胞浸潤；曲美他嗪干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)輕度水腫，心肌纖維排列正常，見圖1。

2.2 各組大鼠心肌損傷程度比較

Sham組大鼠未發(fā)生心肌梗死；曲美他嗪干預(yù)組大鼠心肌梗死面積為(13.53±4.18)%，較模型組的(25.87±6.85)%顯著縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組和曲美他嗪干預(yù)組大鼠心肌酶CK、LDH水平明顯高于Sham組，其中曲美他嗪干預(yù)組各項(xiàng)心肌酶指標(biāo)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示曲美他嗪干預(yù)可明顯減輕I/R損傷，見圖2—3。

A.模型組；B.曲美他嗪干預(yù)組

與Sham組對(duì)比，*P<0.05；與模型組對(duì)比，#P<0.05

2.3 曲美他嗪對(duì)I/R心肌細(xì)胞凋亡的影響

Sham組中可見少量心肌細(xì)胞凋亡；模型組中心肌細(xì)胞呈彌漫分布，凋亡數(shù)量明顯增多；經(jīng)曲美他嗪干預(yù)后，心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，見圖4。模型組Caspase-3蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯升高，Bal-2蛋白水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，曲美他嗪干預(yù)組Caspase-3蛋白表達(dá)水平偏低，Bal-2蛋白表達(dá)水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；曲美他嗪干預(yù)組與Sham組Caspase-3、Bal-2蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示曲美他嗪可抑制I/R心肌細(xì)胞的凋亡，起到保護(hù)作用，見表1。

A.Sham組；B.模型組；C.曲美他嗪干預(yù)組

表1 各組大鼠Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)灰度值比較

2.4 各組大鼠I/R心肌細(xì)胞Calpain活性比較

模型組大鼠I/R心肌細(xì)胞Calpain活性明顯高于Sham組和曲美他嗪干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sham組與曲美他嗪干預(yù)組大鼠I/R心肌細(xì)胞Calpain活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示曲美他嗪對(duì)IR心肌細(xì)胞的Calpain活性具有明顯的抑制作用，見圖5。

與Sham組對(duì)比，*P<0.05；與模型組對(duì)比，#P<0.05

3 討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，心肌細(xì)胞凋亡與MIRI的發(fā)生存在著密切聯(lián)系，心肌細(xì)胞凋亡可加速心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)，并對(duì)心肌梗死面積也有著一定的影響，而MIRI的發(fā)生也會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9-10]。有報(bào)道指出，再灌注可有效阻止心肌壞死的進(jìn)一步加劇，但無法阻止已壞死的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。曲美他嗪是歐洲心臟學(xué)會(huì)專家組推薦使用的抗心絞痛類藥物，可有效維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，維持細(xì)胞在缺氧缺血狀態(tài)下的能量代謝，對(duì)MIRI所致的心肌損傷具有明確改善效果[12-13]。

由于SD大鼠的遺傳基因與人體的相似率較高，且LAD是大鼠左心主要的供血管，故本研究以SD大鼠為研究對(duì)象，并通過對(duì)其LAD進(jìn)行結(jié)扎構(gòu)建MIRI模型。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生明顯改變，且伴有炎癥細(xì)胞浸潤；而曲美他嗪干預(yù)組大鼠心肌纖維排列無明顯異常，僅細(xì)胞間質(zhì)發(fā)生輕度水腫，且曲美他嗪干預(yù)組大鼠心肌梗死面積明顯小于模型組，其心肌酶CK、LDH水平低于模型組。這表明曲美他嗪可明顯減輕心肌細(xì)胞損傷。當(dāng)MIRI發(fā)生時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，繼而導(dǎo)致心肌胞漿中的酶類大量釋放進(jìn)入血液，其含量的改變可間接反映心肌細(xì)胞的損傷程度，尤其是CK、LDH這2種特異性酶，現(xiàn)已成為臨床評(píng)估心肌損傷程度和心肌梗死范圍的定量指標(biāo)[14]。此外，Bal-2、Caspase-3蛋白均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中Bal-2被稱為抗凋亡蛋白，對(duì)多種因素所致的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用[15]；Caspase-3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，曲美他嗪干預(yù)組細(xì)胞凋亡較模型組明顯減少，Caspase-3蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低，Bal-2蛋白表達(dá)水平較模型組顯著升高，表明曲美他嗪治療可有效減少心肌細(xì)胞凋亡。由此可見，曲美他嗪對(duì)MIRI的臨床療效確切，與既往研究結(jié)論相符。

Calpain在人體的多種生理病理過程中起著重要作用[17-18]。研究結(jié)果顯示，抑制Calpain活性可對(duì)小鼠心臟I/R損傷起到細(xì)胞保護(hù)作用[19]。也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Calpain轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌細(xì)胞中，NLRP3炎癥小體被活化，進(jìn)而導(dǎo)致心功能不全的發(fā)生，提示Calpain的表達(dá)與心肌細(xì)胞焦亡存在一定的聯(lián)系[20]。盧圣忠[8]也得出了類似的結(jié)論，即Calpain過表達(dá)會(huì)進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞損傷，但值得注意的是，Calpain對(duì)焦亡通路起到單向激活的作用，但不受NLRP3/ASC、Caspase-1通路的反饋調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠I/R心肌細(xì)胞Calpain活性明顯高于Sham組和曲美他嗪干預(yù)組，表明MIRI的發(fā)生可導(dǎo)致Calpain活性增強(qiáng)。而Sham組與曲美他嗪干預(yù)組大鼠I/R心肌細(xì)胞Calpain活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明曲美他嗪對(duì)Calpain的活性具有明顯的抑制作用。

綜上所述，曲美他嗪可通過抑制Calpain活性來抑制心肌細(xì)胞凋亡和焦亡，從而起到心肌損傷的作用。本研究還存在不足之處，未能明確曲美他嗪治療MIRI的最佳劑量，且本研究?jī)H為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，仍需進(jìn)一步研究深入探討。