王勤儉，張睿昕

(河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院骨病二科，鄭州 450000)

骨質疏松癥是臨床上常見的全身性疾病，該病患者骨量明顯降低，骨微結構受到明顯破壞，嚴重者可導致患者發(fā)生骨折[1]。研究結果發(fā)現，導致骨質疏松癥的危險因素有多種，包括鈣攝入量不足、性激素失調、吸煙和飲酒等，其中女性絕經后骨質疏松是重要的危險因素之一[2-4]。絕經后骨質疏松癥(postemnopausal osteoporosis，PMOP)是一類全身代謝性骨病，其為絕經婦女因體內的雌激素分泌減少，骨量降低導致骨纖維結構退化，進而發(fā)生骨質疏松。目前，臨床主要采用降鈣素、雙磷酸鹽、氟化物和維生素D等藥物治療骨質疏松癥，但由于以上藥物的療效并不十分理想且不良反應顯著，因此其在臨床的使用受到一定限制[5]。近年來，隨著中醫(yī)理論的不斷發(fā)展，學者們認為導致PMOP的主要因素為腎虛[6]。研究結果發(fā)現，益腎補骨湯對促進骨細胞和骨保護素表達、抑制骨吸收有很好的作用[7]。近年來的研究結果表明，一氧化氮/環(huán)磷酸鳥苷(NO/cGMP)信號通路介導骨代謝，NO不僅可抑制破骨細胞骨吸收，還能促進成骨細胞的分化，NO被成骨細胞釋放后可激活鳥苷酸環(huán)化酶，進而增加cGMP的形成，同時NO能通過激活受體Ⅱ型cGMP依賴性蛋白激酶的表達，促進成骨細胞分化[8-9]。但關于NO/cGMP通路在PMOP中的作用機制研究較少，因此，本研究旨在探討益氣補骨湯對PMOP大鼠骨形成及NO/cGMP通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗60只SD大鼠均購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2017-0001。大鼠為2個月齡，SPF級，雌性未生育，體重為200～240 g。將大鼠飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動物房內，保持室內溫度為24～26 ℃，相對濕度為50%～70%，室內光照12 h/12 h循環(huán)，每日自由飲水、進食普通飼料。適應性飼養(yǎng)大鼠7 d。動物實驗在我院倫理委員會批準下進行，并按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 儀器

TXK4型離心機(長沙英泰儀器有限公司)；雙能X線骨密度儀[博卓生物科技(上海)有限公司]；124型萬分之一分析天平(日本Shimadzu公司)。

1.3 藥品與試劑

益腎補骨湯由葛根60 g、山藥30 g、川續(xù)斷30 g、穿山甲30 g、淫羊藿30 g、補骨脂30 g、黃芪30 g、茯苓20 g、鹿角霜20 g、熟地黃15 g、當歸15 g和紅花10 g組成；上述中藥購于南京藥業(yè)股份有限公司，由我院制劑室制成水煎液，加水2 000 mL浸泡上述藥物2 h，取出藥物用水煎煮40 min，共煎煮2次；將2次的煎煮液合并并濃縮為1 g/mL的溶液，于4 ℃冰箱冷藏備用。戊酸雌二醇用蒸餾水溶化制備為0.1 mg/mL的溶液。Wnt3a、β-catenin抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(貨號：ab54479、ab32572和ab6721，美國Abcam公司)；磷酸緩沖鹽溶液(貨號：P1020，南京森貝伽生物科技有限公司)；NO酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：BC1475、G1120，北京索萊寶科技有限公司)；cGMP ELISA試劑盒(貨號：LM-cGMP-Ge，上海聯邁生物工程有限公司)。

1.4 分組與模型制備

將大鼠按照隨機數字表法分為六組，即sham組、PMOP組、益腎補骨湯L組、益腎補骨湯M組、益腎補骨湯H組和陽性對照組，各10只。各組大鼠均腹腔注射300 mg/kg水合氯醛麻醉，沿大鼠腹部正中線切一2 cm的小口，在肋弓脊柱旁1 cm處將肌肉切開，將卵巢組織充分暴露在外，取出卵巢組織并將脂肪組織分離，將卵巢下方的輸卵管和血管進行結扎；后切除大鼠卵巢組織并固定，縫合大鼠皮膚。sham組大鼠僅將卵巢暴露后再放回，不切除，逐層縫合皮膚。術后各組大鼠均給予青霉素鈉鹽5萬IU/d腹腔注射，預防感染，連續(xù)注射3 d。用雙能X線骨密度儀檢測大鼠右側股骨密度(BMD)，判斷模型是否制備成功。造模過程中，有3只大鼠造模失敗，予以補充后進行后續(xù)實驗。

1.5 給藥方法

益腎補骨湯L組、益腎補骨湯M組和益腎補骨湯H組大鼠分別給予益腎補骨湯2、4和8 mL/kg灌胃干預，陽性對照組大鼠給予戊酸雌二醇0.09 mg/kg灌胃干預，sham組和PMOP組大鼠均給予等量的0.9%氯化鈉溶液干預。所有大鼠給藥均1日1次，共給藥12周。

1.6 標本收集及處理

末次給藥后，各組大鼠均禁食12 h，自由飲水，記錄各組大鼠體重變化，觀察各組大鼠一般情況的變化，包括精神狀態(tài)、毛發(fā)、活動和大小便等。稱量后麻醉各組大鼠，取各組大鼠腹主動脈血，靜置30 min后離心(3 000 r/min，離心半徑5 cm)5 min，收集上清液，于-80 ℃環(huán)境中保存。剝離大鼠雙側股骨，剔除肌肉組織和結締組織后用0.9%氯化鈉溶液沖洗，固定左側股骨組織于10%甲醛溶液中，48 h后浸泡于10%硝酸中，待到用縫合針能夠刺進骨組織時為脫鈣成功。用流水沖洗組織，12 h后取1 cm3股骨用于制作病理切片。

1.7 ELISA法檢測血清總堿性磷酸酶(TALP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)含量

將“1.6”中保存于-80 ℃冰箱中的血清取出并解凍，用ELISA檢測試劑盒檢測各組大鼠血清TALP、TRAP含量。

1.8 BMD測定

分別取各組大鼠右側股骨組織，剔除周圍的肌肉組織和結締組織，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后用0.9%氯化鈉溶液紗布包裹，用雙能X線骨密度儀檢測各組大鼠的BMD。將股骨置于雙能X線骨密度儀探頭處進行檢測，應用小動物學骨密度測試軟件進行股骨頸BMD分析。測定完畢后，用濕紗布再次包裹股骨，用保鮮膜將股骨密封，保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)實驗。

1.9 股骨HE染色

取“1.6”中1 cm3股骨組織，石蠟包埋，切成厚度為4 μm的薄片，將薄片脫水處理后，用蘇木精染色5 min，伊紅染色1 min，再次脫水后透明組織并干燥，最后用中性樹脂封片，將股骨組織置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)結構。

1.10 股骨組織中NO、cGMP含量測定

取“1.6”中股骨組織，加入蛋白裂解液，將股骨組織置于含有冰冷0.9%氯化鈉溶液的玻璃勻漿器中制成質量分數為10%的股骨組織勻漿，1 500 r/min，4 ℃離心(離心半徑5 cm)20 min，取上清液。用分光光度計法檢測血清中NO含量，用放射免疫法測定血清中cGMP含量，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.11 蛋白質印跡法檢測股骨組織中Wnt3a、β-catenin的表達

取各組大鼠股骨組織，于冰上裂解組織至組織勻漿，離心組織勻漿，用二喹啉甲酸法檢測上清液中蛋白濃度。分別配置濃縮膠和分離膠，濃度分別為5%和8%，在膠孔中分別加入樣品蛋白，電泳10 min后轉膜。孵育2 h后，將5%封閉液加入到樣品中，激活后轉移至PVDF膜上，封閉PVDF膜1 h。分別加入一抗Wnt3a、β-catenin過夜，繼續(xù)加入HRP標記的二抗，繼續(xù)孵育2 h。用電化學發(fā)光試劑盒檢測細胞PVDF膜并成像。

1.12 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較

術前，各組大鼠體重的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖1(A)。術后，PMOP組大鼠行動較sham組明顯遲緩，活動變少，體毛粗糙無光，食欲降低，部分大鼠存在糞便稀軟現象；益腎補骨湯L、M及H組大鼠以上情況得到改善明顯，益腎補骨湯H組和陽性對照組大鼠活動狀況、體毛、飲食及糞便情況相似。PMOP組大鼠體重明顯低于sham組(P<0.05)；益腎補骨湯L組、M組和H組大鼠體重明顯高于PMOP組，且益腎補骨湯H組和陽性對照組大鼠體重高于益腎補骨湯L組、M組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義，見圖1(B)。

A.各組大鼠實驗前體重比較；B.各組大鼠實驗后不同時間體重比較；與sham組相比，aP<0.05；與PMOP組相比，bP<0.05；與益腎補骨湯L組相比，cP<0.05；與益腎補骨湯M組相比，dP<0.05

表1 各組大鼠實驗前體重比較

2.2 各組大鼠血清中TALP、TRAP含量比較

PMOP組大鼠血清TALP含量明顯低于sham組，TRAP含量明顯高于sham組；益腎補骨湯L組、M組及H組大鼠血清TALP含量明顯高于PMOP組，TRAP含量明顯低于PMOP組；益腎補骨湯H組大鼠血清中TALP含量高于益腎補骨湯L組、M組，TRAP含量低于益腎補骨湯L組、M組，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清TALP、TRAP含量比較

2.3 各組大鼠BMD和股骨組織形態(tài)變化比較

與sham組相比，PMOP組大鼠股骨BMD降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與PMOP組相比，益腎補骨湯L組、M組及H組BMD均不同程度升高，且呈濃度依賴，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益腎補骨湯H組大鼠股骨BMD與陽性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3、圖2(A)。與sham組相比，PMOP組大鼠骨小梁間隙變大不規(guī)則，粗細不均勻，骨小梁表型更??；與PMOP組相比，益腎補骨湯L組、M組、H組和陽性對照組大鼠骨小梁間隙均不同程度變小，且骨小梁粗細均勻且逐漸規(guī)則，見圖2(B)。

A.各組大鼠股骨BMD比較；B.各組大鼠股骨組織HE染色；與sham組相比，aP<0.05；與PMOP組相比，bP<0.05；與益腎補骨湯L組相比，cP<0.05；與益腎補骨湯M組相比，dP<0.05

表3 大鼠股骨BMD比較

2.4 各組大鼠股骨組織中NO、cGMP含量比較

與sham組相比，PMOP組股骨組織中NO、cGMP含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益腎補骨湯L組、M組及H組大鼠股骨組織中NO、cGMP含量明顯低于PMOP組，且隨著濃度升高降低越顯著，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益腎補骨湯H組與陽性對照組大鼠股骨組織中NO、cGMP含量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠股骨組織中NO、cGMP含量比較

2.5 各組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達比較

與sham組相比，PMOP組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益腎補骨湯L組、M組及H組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達明顯高于PMOP組，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；益腎補骨湯H組與陽性對照組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5、圖3。

與sham組相比，aP<0.05；與PMOP組相比，bP<0.05；與益腎補骨湯L組相比，cP<0.05；與益腎補骨湯M組相比，dP<0.05

表5 各組大鼠股骨組織中Wnt3a、β-catenin蛋白表達比較

3 討論

PMOP是婦女的常見病，主要由于機體中的雌激素水平降低導致骨量大量丟失所致[10]。激素替代治療是防止60歲以下女性骨質疏松癥的一線選擇，但對60歲及60歲以上的女性預防骨質疏松癥的治療不作為首選，主要因為激素替代治療會引起乳腺癌、心血管不良事件的發(fā)生風險升高[11]。因此，安全有效地緩解PMOP的藥物成為研究的熱點。中醫(yī)認為，骨質疏松癥是由肝腎虧虛、淤血阻滯所致，《醫(yī)經精義·中卷》中認為，腎精逐漸衰弱，骨髓生化無源、骨髓空虛，進而導致腎虛型PMOP發(fā)生[12]。有學者發(fā)現，PMOP通常為機體中骨吸收和骨形成出現失衡所致，屬于高轉換型骨質疏松癥[13]。近年來研究結果發(fā)現，中藥治療PMOP的療效顯著[14]。益腎補骨湯方中葛根可祛熱升陽；黃芪、山藥有益氣健脾的功效；熟地黃、補骨脂可補腎填髓，滋陰養(yǎng)肝，強筋壯骨續(xù)折傷；穿山甲、當歸具有益氣健脾、活血化瘀等功效；以上藥物共用，不僅可補腎健脾，還可活血化瘀、強筋健骨。

目前，臨床上多通過測定BMD來判定骨質疏松癥，其可有效反映骨骼中骨礦物質的含量[15]。本研究通過測定各組大鼠BMD以驗證PMOP大鼠模型制備是否成功，結果發(fā)現，PMOP組大鼠體重降低，猜測可能是因為雌激素水平降低、內分泌紊亂，進而影響體重。骨代謝生化指標通?？蓪C體中的骨吸收和骨形成情況進行有效反映，目前臨床上反映骨形成情況的指標有多種，如堿性磷酸酶、骨鈣素等[16]。本研究通過檢測血清TALP水平來反映新骨的生成情況，通常骨質疏松癥患者的新骨形成明顯少于正常人群，且反映新骨形成的血清指標活性也會降低。本研究結果顯示，PMOP組大鼠血清TALP水平明顯降低，益腎補骨湯L組、M組及H組大鼠血清TALP水平顯著高于PMOP組，提示益腎補骨湯可促進PMOP大鼠的新骨生成。臨床上通常用血清TRAP、降鈣素和甲狀旁腺激素等指標反映骨吸收情況。本研究通過檢測血清TRAP水平反映骨吸收情況，結果顯示，PMOP組大鼠血清TRAP水平明顯升高，可見PMOP大鼠骨吸收增加，骨量大量減少，益腎補骨湯治療后大鼠血清TRAP水平顯著降低，提示益腎補骨湯可抑制PMOP大鼠骨吸收情況。韓龍等[17]的研究結果證實，與假手術組相比，骨質疏松癥模型組大鼠血清TALP水平降低，TRAP水平升高，與本研究結果一致。

NO參與并調控骨重建等多種生理過程，可與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的血紅素基團相結合，通過提高sGC活性而提高cGMP水平，進而激活cGMP依賴性蛋白激酶級聯，同時激活下游信號通路發(fā)揮生理活性作用[18]。體外實驗結果顯示，成骨細胞自身可產生少量的NO，其可調節(jié)成骨細胞內生長因子的產生。NO供體內NO的緩慢釋放誘導體外成骨細胞的生長和分化[19]。本研究結果顯示，PMOP大鼠血清中NO、cGMP含量升高，益腎補骨湯干預后大鼠股骨組織中NO、cGMP含量顯著降低，提示益腎補骨湯可降低PMOP大鼠股骨組織中NO、cGMP含量，進一步證明益腎補骨湯在促進骨形成過程中與抑制NO/cGMP信號通路有關。宋明甲等[20]的研究結果證實，7-甲氧基-4’-羥基異黃酮可通過NO/cGMP/sGC信號通路促進體外培養(yǎng)成骨細胞成熟與礦化。

Wnt3a是Wnt蛋白家族成員之一，Wnt信號通路可調節(jié)骨重建等過程，是骨質疏松的重要病理基礎。在Wnt/β-catenin信號通路中，β-catenin是關鍵的調節(jié)因子，在骨形成過程中β-catenin水平降低，其可通過升高堿性磷酸酶水平并降低BMD，進而介導骨質疏松的發(fā)生發(fā)展[21]。本研究結果顯示，益腎補骨湯可增加PMOP大鼠股骨組織中Wnt3a和β-catenin蛋白表達，提示益腎補骨湯可能通過增加股骨組織中Wnt3a和β-catenin蛋白表達來治療骨質疏松癥。邢威等[22]的研究結果證實，杜仲健骨方可通過調控Wnt/β-catenin信號通路來發(fā)揮治療骨質疏松癥的作用。

綜上所述，益腎補骨湯可促進骨質疏松癥大鼠的骨形成，可能是通過抑制NO/cGMP信號通路抑制骨吸收。