張利勃，單文琪，王宏軍*，孫 健，田莉莉，蔣 紅，劉國權(quán)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州 121001；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京房山 102400）

四味穿心蓮散源自《中華人民共和國獸藥典》，由穿心蓮、大青葉、辣蓼和葫蘆茶組成，具有清熱解毒、澀腸止痢、抗菌消炎的作用，對禽致病性大腸桿菌（APEC）引起的雞心包炎、肝周炎、氣囊炎、卵黃性腹膜炎等有特效。汪艷秋等（2013）、班燕桃等（2020）采用薄層色譜法定性鑒別了四味穿心蓮散中的大青葉；包愛情等（2016）用高效液相色譜法測定了四味穿心蓮散中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量；張遂平等（2016）完成了四味穿心蓮散固體分散體及其制備方法的研究；王林等（2017）采用薄層色譜法鑒別四味穿心蓮超微粉中含有穿心蓮內(nèi)脂、脫水穿心蓮內(nèi)脂、靛玉紅、蘆丁及槲皮素；陶松若等（2020）開展了四味穿心蓮散及其組方中單味中藥水煎劑對沙門菌的體外抑菌試驗(yàn)。但目前關(guān)于四味穿心蓮散抗大腸桿菌及其體內(nèi)效果方面的研究鮮見報(bào)道，本試驗(yàn)將該復(fù)方的水煎劑用于APEC病的治療，為雞大腸桿菌病的治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌CVCC251購自于中國獸藥藥品監(jiān)察所中國獸生物菌種保存管理中心。

1.1.2 藥物 穿心蓮、大青葉、葫蘆茶和辣蓼均購買于國安市順全隆中藥材有限公司，經(jīng)鑒定符合中華人民共和國獸藥典要求。氟苯尼考可溶性粉，山東福美樂動(dòng)物藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試劑 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、EC肉湯、瓊脂粉、麥康凱瓊脂，北京奧星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡海蘭褐雛雞200只，購自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雛雞飼料，購自錦州東正飼料有限公司。

1.1.5 主要儀器 HC-1000Y型高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）；KQ-300B型超聲波振蕩清洗器（昆明市儀器有限公司）；雙人雙面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州凈化）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DSCS的制備 將穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶4味中草藥飲片粉碎，按照中國獸藥典處方比例組方，加入10倍量水，超聲處理30 min，煎煮2 h，收集濾液，然后再加入5倍量水煎煮1 h，重復(fù)一次，合并濾液，濃縮至1 g/mL藥液。

1.2.2 抗菌活性的測定 將大腸桿菌CVCC251菌株凍干粉在EC肉湯增菌培養(yǎng)24～48 h，用徐淑云等（1994）提出的活菌計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)菌濃度為104cfu/mL，采用Jiang等（2013）提出的微孔-平板法測定提取物對試驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 APEC病理模型的建立 隨機(jī)挑選180只10日齡雛雞，按照蔣紅等（2012）的方法攻毒制備APEC病理模型。按照陳溥言（2015）方法依據(jù)臨床癥狀、病理剖檢、顯微觀察及劃線接種麥康凱瓊脂平板，菌落呈紅色即可初步診斷為雞大腸桿菌病。

1.2.4 臨床治療試驗(yàn) 待動(dòng)物表現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，隨機(jī)分成5組，每組20只，設(shè)DSCS高劑量組（3 mL/只）、中 劑 量 組（1.5 mL/只）和 低 劑 量 組（0.5 mL/只），氟苯尼考可溶性粉組（1 mg/只），感染對照組（不給藥組），另設(shè)一組健康對照組（不給菌不給藥組）。連續(xù)給藥5 d，停藥后繼續(xù)觀察20 d，記錄動(dòng)物的臨床表現(xiàn)、疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和消失情況。按照《獸用中藥、天然藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求計(jì)算無效率、有效率、顯效率、治愈率。

治愈率/%=（癥狀體征、實(shí)驗(yàn)室檢查與專業(yè)特異指標(biāo)均轉(zhuǎn)為正常的動(dòng)物數(shù)）/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100；

顯效率/%=滿足以上其中三項(xiàng)的動(dòng)物數(shù)/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100；

有效率/%=（痊愈+顯效動(dòng)物數(shù)）/發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100；

無效率/%=100-有效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 用IBM SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抑菌結(jié)果 四味穿心蓮散水煎液對大腸桿菌CVCC251菌株的MIC為7.82 mg/mL，MBC為31.25 mg/mL。

2.2 治療結(jié)果 由圖1所示，氟苯尼考組動(dòng)物治愈率、顯效率、有效率及無效率分別為85%、90%、90%和10%，四味穿心蓮散水煎劑治療組治愈率為75%～90%，顯效率為80%～95%，有效率為90%～95%，無效率為5%～10%。四味穿心蓮散水煎劑高劑量組治愈率與氟苯尼考組有顯著性差異（P＜0.05），中劑量組甚至略高于氟苯尼考組，表明中草藥水煎劑組治愈APEC的療效優(yōu)于氟苯尼考，并且中草藥水煎劑組的顯效率、有效率和無效率與氟苯尼考組無顯著性差異（P＞0.05）。后續(xù)跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，四味穿心蓮散水煎劑組雛雞的生長和抗病能力優(yōu)于氟苯尼考組。

圖1 四味穿心蓮散水煎劑防治APEC結(jié)果

3 小結(jié)

雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸埃希氏菌（APEC）引起的一種細(xì)菌性傳染病。該病多呈現(xiàn)混合感染、易產(chǎn)生耐藥性，致使化藥治療十分困難，新致病菌株不斷產(chǎn)生，疫苗又難以預(yù)防該病，因而尋求具有抗菌活性的中草藥尤其是復(fù)方中草藥用于大腸桿菌病的防治是新的突破口之一。目前，中草藥治療雞大腸桿菌病成為研究熱點(diǎn)，較多文獻(xiàn)也報(bào)道單味中草藥和一些方劑對大腸桿菌病有療效，但存在發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)理不明確等問題。所以研究中草藥抗菌作用應(yīng)綜合藥物、微生物、機(jī)體相互關(guān)聯(lián)因素，本試驗(yàn)應(yīng)用APEC標(biāo)準(zhǔn)菌株考察四味穿心蓮散水煎劑對APEC的抗菌活性，取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展、世界對中醫(yī)藥的認(rèn)可及中醫(yī)藥國際化進(jìn)程的推進(jìn)，建立和完善我國藥典和獸藥典中收錄的中草藥成方制劑的質(zhì)量控制、藥理作用機(jī)制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等方面的研究勢在必行。