李港，胡玉峰

(大連理工大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 盤錦 124221)

氟喹諾酮類抗生素(FQs)作為一種人畜共用的藥物被廣泛使用，然而進(jìn)入人體或動(dòng)物體內(nèi)的FQs，70%未被代謝而通過(guò)排泄釋放到環(huán)境中，在我國(guó)水環(huán)境中常有痕量殘留[1]，因此建立針對(duì)FQs的快速檢測(cè)方法對(duì)于保證人類和環(huán)境健康具有重要意義。目前，抗生素的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌分析法、化學(xué)儀器分析法、免疫分析法，但這些方法或操作復(fù)雜，或靈敏度不足，或僅能檢測(cè)特定目標(biāo)物[2-6]。石墨稀碳量子點(diǎn)(GCDs) 因其生物相容性、發(fā)光性 (PL)以及分散性被廣泛運(yùn)用到各個(gè)領(lǐng)域[7-8]。在FQs檢測(cè)方面有很大的潛力[9-10]。目前，水熱法是最常用的GCDs制備方法[11]。制備過(guò)程中所采用的原材料、反應(yīng)條件等，對(duì)GCDs熒光性質(zhì)及表面官能團(tuán)種類具有很多影響[12-15]。

本研究擬通過(guò)對(duì)GCDs制備方法的優(yōu)化，得到對(duì)FQs具有熒光響應(yīng)的GCDs，并對(duì)其熒光特性進(jìn)行表征，探索其作為熒光單體用于定量檢測(cè)FQs的可能性，為環(huán)境中FQs的快速篩查奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

過(guò)氧化氫(30%)、二氧化錳、氧化石墨烯(GO)均為分析級(jí)；氧氟沙星(OFL)，購(gòu)自百靈威科技有限公司；恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CPR)，均由上海源業(yè)生物科技有限公司提供；諾氟沙星(NOR)，購(gòu)自梯希愛(ài)(上海)發(fā)展有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

F-7000熒光分光光度計(jì)；Tecnai G2F30透射電子顯微鏡(FEI)；UPTA-20超純水機(jī)。

1.2 GCDs的制備

將20 mg氧化石墨烯溶于20 mL超純水中，加入5 mL 30% H2O2溶液，超聲分散30 min。將混合物轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯中，并置于高壓釜室中，在180 ℃ 下保持90 min，冷卻至室溫。用 0.2 μm 濾膜過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量3 500 Da)中。將適量的MnO2用超純水溶化后，投入另一個(gè)透析袋中，用作去除反應(yīng)剩余過(guò)氧化氫的催化劑。把兩個(gè)透析袋封閉起來(lái)，一起放進(jìn)裝有超純水的燒杯內(nèi)，避光靜置。待燒杯中不再產(chǎn)生氣泡時(shí)，將裝有GCDs溶液的透析袋取出，用超純水沖洗透析袋表面，去除二氧化錳，透析袋中的液體即為制備的GCDs溶液，置于冰箱中冷藏待用。

1.3 GCDs的表征

使用熒光分光光度計(jì)在360 nm激發(fā)下獲得熒光光譜，其中光電管電壓為700 V，掃描速度為 1 200 nm/min，激發(fā)單元狹縫寬度設(shè)置為5.0 nm，發(fā)射單元狹縫寬度設(shè)置為5.0 nm。除特殊說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的熒光光譜獲取均為此參數(shù)設(shè)置。使用透射電子顯微鏡拍攝TEM圖像。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將1.2節(jié)中制備的GCDs溶液，冷藏避光保存，并定時(shí)定量取出，使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，記錄其在120 min內(nèi)的變化。

配制一系列濃度梯度為10%的GCDs溶液(10%～90%)，加入定量FQs，振蕩培養(yǎng)120 min，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度的變化，并根據(jù)結(jié)果，分析GCDs用于FQs檢測(cè)時(shí)的最優(yōu)條件。

在最優(yōu)GCDs濃度與最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間下，將GCDs用于多種FQs的定量檢測(cè)，繪制FQs濃度-F/F0標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算GCDs對(duì)多種FQs的檢測(cè)限。

2 結(jié)果與討論

2.1 GCDs的制備

GCDs制備時(shí)的加熱時(shí)間對(duì)于材料的熒光性能有非常大的影響，實(shí)驗(yàn)見(jiàn)圖1。

圖1 不同加熱時(shí)間制備的GCDs照片(a) 與熒光發(fā)射光譜圖(b)Fig.1 Physical diagram(a) and fluorescence emission spectrum(b) of GCDs at different heating time

由圖1可知，隨著加熱時(shí)間的增加，溶液顏色由深到淺，同時(shí)GCDs量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度增加，在85 min時(shí)達(dá)到最大值，而當(dāng)加熱時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至90 min時(shí)，溶液則不再有熒光信號(hào)，這是因?yàn)樵撝苽浞磻?yīng)本質(zhì)上是將微米級(jí)尺度的氧化石墨烯切割為納米級(jí)尺度的石墨烯碳量子點(diǎn)的過(guò)程。當(dāng)加熱時(shí)間從70 min 增加到 90 min 時(shí)，獲得了一系列的產(chǎn)物，盡管實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)通過(guò)濾膜去除了大尺度的殘留物，但還是有各種不同尺度的產(chǎn)物保留了下來(lái)，因此，這實(shí)際上是一個(gè)混合體系的熒光測(cè)量。作為原料的氧化石墨烯溶液為棕黃色，沒(méi)有任何熒光，加熱70 min 時(shí)，溶液仍保持棕黃色，但是主要表現(xiàn)出500 nm處的綠色熒光，加熱時(shí)間到85 min 時(shí)，溶液為淡黃色，并且 450 nm 處的藍(lán)色熒光也增強(qiáng)，加熱時(shí)間到達(dá)90 min 后，溶液為無(wú)色透明狀態(tài)，并且?guī)缀鯖](méi)有任何熒光，這表明氧化石墨烯全部分解為了小分子物質(zhì)，不再具有熒光性能。因此，確定GCDs最佳制備時(shí)間為85 min。

圖2是GCDs的TEM圖。

圖2 GCDs的TEM圖(a、b)和尺寸分布(c)Fig.2 TEM diagram of GCDs and size distribution of GCDs a.20 nm；b.5 nm；c.GCDs尺寸分布

由圖2可知，GCDs尺寸分布比較均勻，集中在5～10 nm。由GCDs高分辨的表征，由圖2b可知，GCDs有明顯的晶格線條紋。通過(guò)多處取像，并對(duì)GCDs尺寸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由圖2c可知，GCDs尺寸集中在6～8 nm。

2.2 GCDs的穩(wěn)定性

取10 mL GQDs溶液避光靜置，分別在0，10，20，30，45，60，90，120 min時(shí)，各取1 mL GQDs溶液置于熒光分光光度計(jì)中獲取熒光光譜，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 GCDs穩(wěn)定性Table 1 Stability of GCDs

由表1可知，GCDs在120 min 內(nèi)熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生改變。后續(xù)研究中，實(shí)驗(yàn)時(shí)間應(yīng)控制在 120 min 內(nèi)。

2.3 GCDs使用條件的優(yōu)化

以諾氟沙星(NOR)作為氟喹諾酮類抗生素的代表物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 GCDs的使用濃度 在10%～90%濃度范圍內(nèi)，按照濃度梯度為10%(v/v)配制GCDs溶液各2份，并向其中1份加入NOR溶液，NOR在體系中的終濃度為100 μmol/L，振蕩培養(yǎng)15 min后，測(cè)量體系的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，當(dāng)存在NOR時(shí)，GCDs的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)增強(qiáng)，當(dāng)NOR濃度不變，GCDs濃度增加，則NOR對(duì)GCDs熒光增強(qiáng)的響應(yīng)逐漸減弱。GCDs濃度為10%時(shí)，NOR對(duì)其的熒光增強(qiáng)效果最佳，但是此時(shí)GCDs的初始熒光強(qiáng)度較低，會(huì)導(dǎo)致熒光光譜儀數(shù)據(jù)測(cè)量的不準(zhǔn)確性。當(dāng)GCDs濃度為90%時(shí)，NOR對(duì)其的熒光增強(qiáng)效果最差，這是由于體系中GCDs的量遠(yuǎn)高于NOR，從而導(dǎo)致增強(qiáng)效果減弱，不利于對(duì)NOR的檢測(cè)。因此，綜合兩者之后，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用 50% 作為最優(yōu)濃度使用。

圖3 不同濃度條件下GCDs-NOR體系的熒光強(qiáng)度變化Fig.3 Changes of fluorescence intensity of GCDS-NOR system at different concentration of GCDs

2.3.2 培育時(shí)間 配制含有GCDs(濃度為50%)、NOR(50 μmol/L)的混合溶液9份，并立即振蕩，分別于配制后1，5，10，15，30，45，60，90，120 min 時(shí)，測(cè)試各混合溶液的熒光光譜。同時(shí)采用濃度為50%的GCDs溶液作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同培育時(shí)間的GCDs-NOR體系熒光強(qiáng)度變化Fig.4 Changes of fluorescence intensity of GCDS-NOR system at different incubation time

由圖4可知，當(dāng)GCDs用于NOR的檢測(cè)時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度在1 min內(nèi)即可達(dá)到最大值，且在 10 min 內(nèi)維持不變，說(shuō)明GCDs能夠非?？焖俚貙?duì)諾氟沙星做出熒光響應(yīng)，之后隨時(shí)間增加，熒光增強(qiáng)逐漸降低，并在45 min 之后基本保持穩(wěn)定。因此，為便于操作和獲取更加穩(wěn)定的熒光信號(hào)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用10 min作為培育時(shí)間。

2.4 GCDs用于氟喹諾酮類抗生素的檢測(cè)

配制濃度為0，5，10，15，20，30，40，50 μmol/L的NOR、OFL、ENR或CPR的溶液，按2.3節(jié)中的最優(yōu)條件，與GCDs溶液混合，測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。測(cè)試條件如下：激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為380～700 nm，光電管電壓為700 V，掃描速度為 1 200 nm/min，激發(fā)單元狹縫為2.5 nm，發(fā)射單元狹縫5.0 nm。結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 不同濃度的NOR、OFL、ENR和CPR存在時(shí)，GCDs溶液的熒光波譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of GCDs solution with different concentration of NOR，OFL，ENR and CPR a.NOR；b.OFL；c.ENR；d.CPR

由圖5可知，在濃度范圍為0～50 μmol/L時(shí)，4種氟喹諾酮類抗生素均對(duì)GCDs具有熒光增強(qiáng)效應(yīng)，因此可以通過(guò)GCDs的熒光強(qiáng)度增加與否，判斷是否存在氟喹諾酮類抗生素。4種氟喹諾酮類抗生素對(duì)GCDs的熒光增強(qiáng)效應(yīng)從強(qiáng)到弱為：ENR>CPR>NOR>OFL。同時(shí)，在OFL存在時(shí)，GCDs的熒光峰會(huì)發(fā)生紅移，而其他三種均未出現(xiàn)此情況，因此可以根據(jù)此現(xiàn)象將OFL與其它種類的氟喹諾酮類抗生素進(jìn)行區(qū)分。

圖6 4種抗生素對(duì)GCDs熒光響應(yīng)Fig.6 The fluorescence response of four fluoroquinolones on GCDs a.NOR；b.OFL；c.ENR；d.CPR

由圖6可知，GCDs對(duì)于4種喹諾酮類抗生素在0～50 μmol/L濃度下均表現(xiàn)出穩(wěn)定的線性熒光增強(qiáng)響應(yīng)，因此，GCDs可以用于喹諾酮類抗生素濃度的定量檢測(cè)。相應(yīng)的檢測(cè)限根據(jù)LOD=3S/K計(jì)算得到，其中，S為20次重復(fù)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)差，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。采用GCDs對(duì)NOR、OFL、ENR、CPR 4種氟喹諾酮類抗生素在0～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)限分別為 1.305，2.178，0.753，1.035 nmol/L。宗婧婧等采用膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中氟喹諾酮類抗生素，檢測(cè)時(shí)間為3～5 min，恩諾沙星、環(huán)丙沙星等氟喹諾酮類抗生素的檢出限在0.3～5 μg/kg[16]；鄭晶等采用酶聯(lián)免疫吸附法快速檢測(cè)鰻魚(yú)中恩諾沙星殘留，測(cè)試檢測(cè)范圍為0.3～10 μg/kg，最低檢測(cè)線為3 μg/kg[17]；康莉等采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中的氟喹諾酮類抗生素殘留分析方法，檢測(cè)范圍為0.20～5.00 mg/kg，檢測(cè)限為0.50～31.4 μg/kg[18]。與其他研究相比，本實(shí)驗(yàn)所建立的基于GCDs熒光檢測(cè)氟喹諾酮類抗生素的方法在檢測(cè)范圍和檢測(cè)靈敏度上具有一定的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

(1)在石墨烯水溶液中加入過(guò)氧化氫，180 ℃加熱85 min，得到對(duì)氟喹諾酮類抗生素具有熒光響應(yīng)的GCDs。在GCDs濃度為50%，培育時(shí)間為10 min的檢測(cè)條件下，對(duì)NOR、OFL、ENR、CPR 4種氟喹諾酮類抗生素在0～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)限分別為1.305，2.178，0.753，1.035 nmol/L。

(2)在OFL存在時(shí)，GCDs的熒光峰會(huì)發(fā)生紅移，而其他三種均未出現(xiàn)此情況，因此可以根據(jù)此現(xiàn)象將OFL與其它種類的氟喹諾酮類抗生素進(jìn)行區(qū)分。