鐘照明 曹磊 姚立群 黃永珍

海南省中醫(yī)院麻醉科（?？?570203）

七氟烷（sevoflurane，SEV）是兒童最常用的麻醉劑之一，可能導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、突觸缺陷、神經(jīng)炎癥、Tau 磷酸化、髓鞘形成的破壞以及認知障礙［1-2］。盡管許多研究發(fā)現(xiàn)SEV 麻醉會導(dǎo)致大腦各個區(qū)域的基因表達發(fā)生巨大變化，但是否會發(fā)生信使RNA 水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)尚不清楚。mRNA可以進行各種不同的化學(xué)修飾，包括N6 位腺苷的甲基化，從而導(dǎo)致N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）的形成［3］。m6A 是成人大腦中最豐富的可逆mRNA 修飾［4-5］。越來越多的證據(jù)表明，m6A RNA 甲基化在RNA 的產(chǎn)生/代謝中起著至關(guān)重要的作用，并參與了多種疾病的發(fā)病機制［6］。m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase-like protein 3，METTL3）作為m6A RNA 甲基化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，已發(fā)現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮多種生物學(xué)作用，例如調(diào)節(jié)軸突引導(dǎo)，并且METTL3 在脊髓連合神經(jīng)元中的特異性消融導(dǎo)致預(yù)交叉軸突引導(dǎo)缺陷并導(dǎo)致學(xué)習(xí)缺陷和記憶［7］。然而，METTL3 是否參與SEV 誘發(fā)的認知功能損傷尚未明確。因此，本研究建立了SEV 損傷大鼠模型，以證實METTL3 在誘發(fā)的認知功能損傷上的意義，并對其潛在機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 動物和治療 體質(zhì)量18 ～ 22 g（8 周齡）的C57BL/6小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所。動物在受控條件［（22 ± 2）℃，12∶12 h 光照：黑暗循環(huán)］下分組飼養(yǎng)，自由飲水和食物，并允許在實驗開始前適應(yīng)實驗室條件至少1 周。交配時雌雄比例為2∶1。出生后6 d 小鼠隨機分為兩組（每組8 只）：對照組（Ctrl）和SEV 組。SEV 組小鼠在出生后第6、7 和8 天用3%SEV 在濕潤的20%氧氣載氣中進行麻醉，每天2 h，持續(xù)3 d。對照組中的新生小鼠在相同的腔室中僅以相同的流速接受20%的氧氣?；谙惹暗难芯浚?］，這些經(jīng)SEV 處理或未長大至出生后65 d 的新生小鼠被定義為成年小鼠。此外，為了考察METTL3 敲低對SEV 誘發(fā)的認知功能損傷的影響，將出生后6 d 小鼠隨機分為4 組（每組8 只）：Ctrl+sh-NC 組、SEV+sh-NC 組、Ctrl+sh-METTL3 組和SEV+sh-METTL3 組。SEV+sh-NC 組和SEV+sh-METTL3 組在出生后第6、7、8 天用3%SEV 在濕潤的20%氧氣載氣中進行麻醉，每天2 h，持續(xù)3 d，并在出生后第9 天注射sh-METTL3 病毒。Ctrl+sh-NC 組和Ctrl+sh-METTL3 組出生后第6、7 和8 天以相同的流速接受20%的氧氣，并在出生后第9 天注射sh-NC 病毒。研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意（批件號：20190526）。

1.2 病毒包裝和立體定向注射 CMV-METTL3 shRNA（sh-METTL3）和METTL3 過表達腺相關(guān)病毒由山東維真生物科技有限公司構(gòu)建和包裝。對于sh-METTL3 病毒包裝，合成小鼠METTL3 的shRNA序列（5'-GATCCGGGCAGGACAAAGCAATATTGTTCAAGAGACAATATTGCTTTGTCCTGCCCTTTTTTA-3'）并克隆到pAV-U6-GFP 質(zhì)粒中以產(chǎn)生pAV-U6-eGFP-METTL3 shRNA。 Scramble 腺相關(guān)病毒作為對照病毒（sh-NC）。通過定量PCR測定的基因組滴度為4.72×1013TU/mL。對于METTL3過表達，合成小METTL3的編碼序列并克隆到PAG-CAG-eGFP 質(zhì)粒中以產(chǎn)生PAG-CAG-METTL3-P2A-eGFP。產(chǎn)生eGFP 質(zhì)粒病毒作為對照病毒（Vector）。通過碘克沙醇逐步梯度超速離心純化病毒顆粒。通過定量PCR 測定的基因組滴度為4.68×1013TU/mL。

對于病毒注射，通過腹膜內(nèi)注射用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（8 mg/kg）麻醉小鼠并置于立體定向框架中。通過玻璃微量移液器以緩慢的速率（10 nL/min）。動物實驗中，幼鼠在SEV 麻醉后第9 天注射病毒（100 nL）。所有小鼠的Morris水迷宮試驗均為在出生后第65 天進行。

1.3 Morris 水迷宮測試 在SEV 暴露和其他實驗之后，通過使用如前所述的Morris 水迷宮測試在出生后60 ～ 65 d 評估空間記憶［9］。圓形黑色水池（直徑：120 cm；深度：21 cm）用不透明的水填充，使用白色無毒墨水達到平臺表面（直徑，10 cm）以上1.0 cm，水溫保持在22 ℃。在訓(xùn)練階段，所有動物每天接受4 次訓(xùn)練試驗，總共4 d。將老鼠放在一個特殊的起始位置的水池中，讓它們在60 s 內(nèi)發(fā)現(xiàn)隱藏的平臺。如果小鼠在1 min 內(nèi)無法找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺。記錄延遲時間（到達隱藏平臺的時間）以評估空間學(xué)習(xí)。在測試階段，移去平臺，讓每只老鼠在水池中自由游泳2 min。記錄平臺穿越時間和象限時間以測量記憶功能。

1.4 組織收獲 在Morris 水迷宮測試后第65 天收獲小鼠的腦組織。用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，i.p.）麻醉動物的大腦。然后，切開右心房并用肝素化的0.9%鹽水和4%甲醛進行經(jīng)心灌注。提取腦組織并在4%甲醛中固定過夜，在含15%蔗糖的0.1 mmol/L 鹽緩沖液（pH 7.4）中固定24 h，然后在含30%蔗糖的0.1 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中固定48 h。

1.5 高爾基染色 使用Hito Golgi-Cox OptimStainTMPreKit（美國Hitobiotec Corp 公司）在齒狀回（dentate gyrus，DG）中研究神經(jīng)元樹突和樹突棘的形態(tài)。處死后獲得腦組織。用等體積的溶液A 和B浸漬腦組織，避光保存（室溫，2 周）。然后，將腦組織轉(zhuǎn)移到溶液C 中在4 ℃黑暗中儲存72 h。使用冷凍切片機生成腦切片（100 μm）。使用溶液C 將每個切片固定在涂有明膠的顯微鏡載玻片上，然后讓切片在室溫下自然干燥3 d。使用Olympus BX61 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）觀察海馬DG 亞區(qū)的樹突。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡 使用RIPA 緩沖液（上海Beyotime 公司）和1×蛋白酶抑制劑混合物（上海Beyotime 公司）對不同組的海馬組織進行勻漿。通過離心（12 000 ×g，20 min）收集上清液，并通過二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒（上海Beyotime 公司）測量蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE 分離50 μg 蛋白質(zhì)的等分試樣并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.4）中的5%脫脂牛奶封閉。將膜與針對METTL3（1∶1 000）、BDNF（1∶500）、FTO（1∶1 000）、METTL14（1∶500）、WTAP（1∶500）、YTHDF2（1∶1 000）、p-AMPK（1∶800）、AMPK（1∶800）和微管蛋白α（1∶10 000，均購自美國Abcam 公司）一抗在4 ℃下孵育過夜。在室溫下將印跡在辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔IgG（1∶5 000；美國CST 公司）二抗中孵育2 h。圖像由VersaDoc 4000MP 系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）捕獲，條帶密度用自帶Quantity One 軟件分析。

1.7 斑點印跡法分析mRNA m6A 甲基化 參照文獻方法進行mRNA m6A 甲基化的斑點印跡分析［10］。使用Trizol 方法分離總RNA，并使用GenEluteTMmRNA Miniprep Kit（美國Sigma 公司）富集mRNA。通過NanoDrop 2000 測量mRNA 的濃度和純度。通過在95 ℃下加熱5 min 使mRNA 變性，然后立即在冰上冷卻。將mRNAs（100 ng）直接點樣到帶正電荷的尼龍膜（美國GE Healthcare 公司）上并風(fēng)干5 min。然后將膜用5%脫脂牛奶在TBST 中封閉，在4 ℃下與抗m6A 抗體孵育過夜。將HRP綴合的抗兔IgG 二抗在室溫下加入膜中2 h，用增強的化學(xué)發(fā)光顯色。亞甲藍染色用于驗證膜上是否發(fā)現(xiàn)了等量的mRNA。

1.8 細胞培養(yǎng)和分組 本研究中使用的小鼠海馬神經(jīng)元細胞系（HT-22）獲自上海匯盈生物科技有限公司，接種在含有10%（v/v）FBS 的Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM，美國Hyclone 公司）中培養(yǎng)。將細胞分為Vector 組和METTL3 組，分別轉(zhuǎn)染Vector 或METTL3 質(zhì)粒，并在轉(zhuǎn)染48 h 后收集細胞進行相關(guān)測試。

1.9 雙熒光素酶測定 將螢火蟲熒光素酶報告基因與海腎報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HT-22 細胞中4 h。用Vector 或METTL3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。使用Dual-Luciferase?Reporter Assay System（美國Promega 公司）測量螢火蟲和海腎螢光素酶活性。

1.10 mRNA 穩(wěn)定性分析 參照文獻方法進行mRNA 穩(wěn)定性分析［11］。HT-22 細胞用5 μg/mL 放線菌素D（美國Sigma-Aldrich 公司）處理以抑制整體mRNA 轉(zhuǎn)錄。分別在處理后3、6 和9 h 收集細胞，用于RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄。通過qPCR 定量AMPK mRNA 水平。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0 軟件進行分析，并表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。使用非配對Student'st檢驗分析兩組之間的差異，并通過重復(fù)測量的單因素或雙向方差分析分析多組之間的差異，然后進行Bonferroni 事后檢驗。P< 0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SEV 會損害新生小鼠的空間記憶 與對照組相比，SEV 組小鼠在Morris 水迷宮試驗中具有更長的逃避潛伏期，較低的平臺穿越時間和更短的象限時間（P<0.01，圖1A-D）。樹突棘充當(dāng)突觸強度的存儲位點，并幫助將電信號傳輸?shù)缴窠?jīng)元的細胞體。樹突棘的數(shù)量被認為是衡量神經(jīng)元活動的有效方法。研究通過高爾基染色確定了兩組樹突棘數(shù)量，SEV 組海馬DG 區(qū)樹突棘的數(shù)量顯著低于Ctrl 組（P<0.01，圖1E-F）。

圖1 SEV 損害新生小鼠的空間記憶并減少海馬神經(jīng)發(fā)生Fig.1 SEV damaged the spatial memory of newborn mice and reduced hippocampal neurogenesis

2.2 SEV 增加海馬中的m6A 水平 斑點印跡分析顯示暴露于SEV 的小鼠海馬組織中m6A 水平顯著增加（P< 0.01，圖2A）。同時，去甲基化酶FTO水平顯著下降（P<0.05），而甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、WTAP 和結(jié)合蛋白YTHDF2 水平顯著增加（P<0.05，圖2B）。

2.3 SEV誘導(dǎo)的年輕小鼠認知缺陷需要METTL3 sh-METTL3 在小鼠中消除了METTL3 蛋白的表達（圖3A）。在接受sh-NC 病毒的小鼠中，與Ctrl 組相比，SEV 組小鼠在Morris 水迷宮試驗中具有更長的逃避潛伏期，較低的平臺穿越時間和更短的象限時間（P<0.01）。與sh-NC+SEV 組相比，sh-METTL3+SEV 組逃避潛伏期顯著縮短，平臺穿越時間和象限時間顯著增加（P< 0.05，圖3B-E）。此外，在接受sh-NC 病毒的小鼠中，與Ctrl 組相比，SEV 組小鼠DG 區(qū)樹突棘的數(shù)量和BDNF 表達均顯著降低（P< 0.01）。與sh-NC+SEV 組相比，sh-METTL3+SEV 組DG 區(qū)樹突棘的數(shù)量和BDNF 表達均顯著增加（P<0.05，圖3F-G）。

圖3 SEV 誘導(dǎo)的年輕小鼠認知缺陷需要METTL3Fig.3 METTL3 was needed for SEV-induced cognitive impairment in young mice

2.4 METTL3上調(diào)抑制海馬中的AMPK通路 與Ctrl 組相比，SEV 組小鼠海馬中AMPK 表達顯著降低（P<0.01）。與sh-NC+SEV 組相比，sh-METTL3+SEV 組海馬中p-AMPK 表達顯著增加（P< 0.05）（圖4）。體外研究中，METTL3 過表達質(zhì)粒顯著增加了HT-22 細胞中的m6A 水平（P< 0.01，圖5A），同時顯著增加了METTL3 的表達并降低了BDNF和p-AMPK 表達（P< 0.05，圖5B）。AMPK 3'UTR報告熒光素酶測定顯示，METTL3 上調(diào)顯著降低了含有AMPK 3'UTR 的構(gòu)建體的熒光素酶活性（P<0.05），這些m6A 位點（A 到T）的突變導(dǎo)致熒光素酶活性顯著增加（P< 0.05），并對METTL3 上調(diào)作用產(chǎn)生抗性（圖5C）。此外，METTL3 上調(diào)顯著降低了AMPK mRNA 穩(wěn)定性（P<0.05，圖5D）。

圖4 蛋白質(zhì)印跡檢查DG 亞區(qū)AMPK 表達Fig.4 The expression of AMPK in DG subregion was examined by protein blotting

圖5 METTL3 上調(diào)增加AMPK 3'UTR 中的m6A 修飾并降低HT-22 細胞中的AMPK mRNA 穩(wěn)定性（n=3）Fig.5 Up-regulation of METTL3 increased m6A modification in AMPK 3'UTR and decreased the stability of AMPK mRNA in HT-22 cells（n=3）

3 討論

有明確的證據(jù)表明，生命早期麻醉暴露與隨后持續(xù)神經(jīng)行為缺陷的風(fēng)險增加之間存在聯(lián)系［12］。本研究對P6-P8 小鼠進行每天2 h 的3%SEV 麻醉，并在小鼠成年期觀察到認知缺陷。在許多動物模型中報告了類似的行為改變，包括從1～3 周齡暴露于SEV 的C57BL/6 小鼠，以及Wistar大鼠從出生后第4 天暴露于SEV 3 d，均表現(xiàn)出焦慮樣行為增加和認知障礙［13-14］。因此，SEV 會損害新生小鼠的認知功能。此外，本研究發(fā)現(xiàn)SEV 增加小鼠海馬中的m6A 水平，同時伴隨著FTO 減少和METTL3、METTL14 和WTAP 增加。這些結(jié)果提示m6A 甲基化增加和SEV 暴露誘導(dǎo)小鼠認知行為受損之間可能存在聯(lián)系。

m6A 甲基化在調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和大腦功能中發(fā)揮重要作用［4］。研究表明，m6A RNA 甲基化在AD中異常高，這歸因于METTL3 水平升高和FTO 受損［15］。還有研究報道海馬METTL3 異常表達不利于小鼠的長期記憶維持和鞏固，其可能通過m6A RNA 甲基化減弱神經(jīng)元早期反應(yīng)基因的翻譯［16］。本研究利用METTL3 shRNA 病毒來改變METTL3在海馬中的表達。METTL3 沉默病毒減輕了SEV引起的年輕小鼠空間記憶障礙，并改善了DG 區(qū)樹突棘的數(shù)量和BDNF 表達。BDNF 在大腦中的表達可能有助于腦損傷后的保護和再生作用［17］。已顯示樹突棘數(shù)量受BDNF 表達的影響［18］。目前的研究結(jié)果進一步強調(diào)METTL3 是SEV 誘導(dǎo)的對年齡敏感的學(xué)習(xí)能力障礙的易感性所必需的。

m6A RNA 甲基化控制與記憶和學(xué)習(xí)功效以及神經(jīng)元分化相關(guān)的基因的表達和形態(tài)發(fā)生。然而，作為一種新發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳調(diào)控方法，m6A RNA 甲基化可能是SEV 暴露中一小部分基因表達抑制的原因。值得注意的是，m6A 在5'UTR 而不是在3'UTR 或其他區(qū)域的富集，在調(diào)節(jié)基因表達中起重要作用。5'UTR 處的m6A 殘基通過規(guī)避m7G 帽要求［19］，實現(xiàn)了翻譯起始的帽獨立模型，而成熟多腺苷酸化mRNA 的3'末端m6A 的富集與另一種多腺苷酸化相關(guān)［20］。因此，筆者推測在海馬神經(jīng)元細胞系統(tǒng)中，m6A 介導(dǎo)的翻譯過程占據(jù)了最終基因表達的主導(dǎo)階段。研究接下來探討了METTL3 對可能參與SEV 誘導(dǎo)認知行為受損相關(guān)靶點的影響。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）充當(dāng)能量傳感器，其是蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)的下游組分，在維持能量穩(wěn)態(tài)中起主要作用［21-22］。已經(jīng)報道了AMPK 對酒精性肝損傷的保護作用［23］。此外，AMPK 過表達可改善老年大鼠的術(shù)后認知功能障礙［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)METTL3 沉默病毒逆轉(zhuǎn)了SEV 引起的AMPK 表達降低，METTL3上調(diào)抑制HT-22細胞中AMPK、BDNF的表達。此外，AMPK 3'UTR 含有對METTL3 上調(diào)反應(yīng)的功能性m6A 修飾位點，這些m6A 位點的高甲基化導(dǎo)致AMPK mRNA穩(wěn)定性降低。本研究結(jié)果表明，METTL3 上調(diào)通過m6A 介導(dǎo)的AMPK mRNA穩(wěn)定性的降低抑制BDNF 表達，從而導(dǎo)致海馬依賴性記憶形成受損。

綜上所述，本研究探討了SEV 暴露導(dǎo)致小鼠認知功能損傷中的潛在機制，并發(fā)現(xiàn)SEV 暴露導(dǎo)致海馬組織中m6A 水平和METTL3 增加。METTL3敲低減輕了SEV 誘導(dǎo)的幼鼠認知功能損傷，其可能通過m6A 介導(dǎo)的AMPK mRNA 穩(wěn)定性的降低導(dǎo)致海馬依賴性記憶形成受損。本研究為N6 甲基腺苷修飾在麻醉誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用提供數(shù)據(jù)支持，需要進一步了解N6 甲基腺苷修飾在麻醉相關(guān)行為缺陷中的作用機制。