姜平 郭哲 梁殿迅 楊喜科 付小玲 李和麗

河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院（河南南陽(yáng) 473000）

卵巢癌在全球女性癌癥患者中病死率最高［1-2］。由于缺乏有效和準(zhǔn)確的診斷標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已到晚期［2］。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢癌患者死亡的重要原因，有研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關(guān)［3］。近年來(lái)，越來(lái)越多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-cording RNAs，lncRNA）被發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）在卵巢癌中作為癌基因和抑癌因子［4-5］。lncRNA X 失活特異轉(zhuǎn)錄物（X-inactive specific transcript，XIST）能夠促進(jìn)食管癌、結(jié)直腸癌發(fā)展［6-7］。下調(diào)lncRNA XIST 可抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［8］。因此，lncRNA XIST 是一種潛在的卵巢癌診斷標(biāo)志物，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。生物信息學(xué)分析顯示miR-340-5p 可能是lncRNA XIST 的下游靶點(diǎn)，其在結(jié)腸癌、乳腺癌等多種人類(lèi)惡性腫瘤中調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展［9-10］。然而，在卵巢癌中，lncRNA XIST 和miR-340-5p 之間的潛在調(diào)控軸尚不清楚。本研究將探討lncRNA XIST 通過(guò)EMT 影響卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲的作用及其機(jī)制，為卵巢癌提供潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 lncRNA XIST 干擾載體（silncRNA XIST）質(zhì)粒及其陰性對(duì)照（si-NC）、miR-340-5p 模擬物或抑制劑（miR-340-5p mimics 或miR-340-5p inhibitor）及其陰性對(duì)照（NC mimics 或NC inhibitor）、RT-qPCR 引物購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)自英國(guó)Invitrogen 公司；TaqManTMmicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；qPCR 試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒、Matrigel、放射免疫沉淀試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科學(xué)技術(shù)公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司；兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GADPH 抗體及羊抗兔抗IgG 購(gòu)自Abcam 公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 生物公司；4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。RT qPCR 儀購(gòu)自ABI 公司；Glomax 20/20 熒光檢測(cè)器購(gòu)自Promega 公司；XDS 800D 倒置顯微鏡購(gòu)自上海凱肯光學(xué)儀器有限公司。

1.2 組織樣本 收集2018-2021年本院28 例卵巢癌手術(shù)患者組織標(biāo)本。正常組織來(lái)自于卵巢楔形活檢或附件切除術(shù)的纖維狀瘤或子宮腺肌癥。卵巢切除后，取下生殖上皮并進(jìn)一步分析。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 購(gòu)自BNCC 公司的人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80 和人卵巢癌細(xì)胞系ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 在添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，維持在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下。

實(shí)驗(yàn)分為Control 組（不轉(zhuǎn)染）、si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-lncRNA XIST 組（轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST）、si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組（轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 和NC inhibitor）、si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組（轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 和miR-340-5p inhibitor）。第3 代的A2780 細(xì)胞接種到24 孔板（2×106個(gè)/孔），然后培養(yǎng)至單層細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到75%時(shí)，去除培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前1 d，指數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞被播種到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。孵育12 h后，使用Lipofectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.4 RT-qPCR 檢測(cè)lncRNA XIST 和miR-340-5p表達(dá)水平 使用TRIzol 收集卵巢癌組織、細(xì)胞系及轉(zhuǎn)染48 h 后的各組A2780 細(xì)胞的總RNA。采用TaqManTMmicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，用qPCR 試劑盒配置PCR 反應(yīng)體系（25 μL）。將PCR 反應(yīng)液置于RT-qPCR 儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。最后，使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。PCR 引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA XIST 和miR-340-5p 的調(diào)控關(guān)系 利用在線網(wǎng)站（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析lncRNA XIST和miR-340-5p 之間的靶向關(guān)系?；诙叩慕Y(jié)合序列，分別設(shè)計(jì)目標(biāo)和突變序列，并將合成后的片段克隆到psiCHECK 2 載體中，進(jìn)而獲得野生型/突變型（WT/MUT-lncRNA XIST）載體質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒與miR-340-5p mimics 或NC mimics 共轉(zhuǎn)染至A2780細(xì)胞，記為NC mimics+WT-lncRNA XIST 組、miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 組、NC mimics+MUT-lncRNA XIST 組、miR-340-5p mimics+MUT-lncRNA XIST 組。48 h 后，按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性的變化。用Glomax 20/20 熒光檢測(cè)器記錄這些變化，將si-NC、si-lncRNA XIST、pcDNA、pc-lncRNA XIST 分別轉(zhuǎn)染至A2780 細(xì)胞，記為si-NC 組、si-lncRNA XIST 組、pcDNA 組、pc-lncRNA XIST 組，48 h 后收集細(xì)胞，根據(jù)1.4 的方法檢測(cè)各細(xì)胞中miR-340-5p 的表達(dá)。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將各組A2780細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為1 × 105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到90%時(shí)，用200 μL 的無(wú)菌針尖在平板每孔底部做4 個(gè)標(biāo)記。除去原培養(yǎng)基后，每孔補(bǔ)充2 mL 含10%血清的培養(yǎng)基并孵育。分別于劃痕后0 h 和24 h 倒置顯微鏡下拍照，至少測(cè)量5 個(gè)劃痕點(diǎn)的間距，取平均值。各組劃痕愈合率=（0 ～ 24 h）劃痕面積/0 h劃痕面積×100%。

1.7 Transwell 法評(píng)估細(xì)胞侵襲能力 用Matrigel（1∶8）在24 孔板上覆蓋Transwell 室底膜的上室。在上室中加入200 μL 的細(xì)胞懸液（1×105個(gè)/mL），在下室中加入含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基600 μL，在37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。將上室表面非侵襲細(xì)胞擦拭干凈，剩余細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色15 min。倒置顯微鏡下，選擇5 個(gè)視野拍照。

1.8 Western blot 分析EMT 標(biāo)志蛋白水平 轉(zhuǎn)染48 h后，提取A2780細(xì)胞總蛋白，然后用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白的Tween-20 溶液的Tris-緩沖鹽水阻斷膜。隨后，用稀釋的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 多克隆抗體和GADPH在4 ℃孵育膜過(guò)夜。次日，用羊抗兔IgG 抗體在室溫下孵膜培養(yǎng)。通過(guò)電化學(xué)發(fā)光觀察條帶。

1.9 免疫熒光染色觀察EMT 標(biāo)志蛋白表達(dá) 首先，用甲醇固定細(xì)胞，用0.1% Triton X-100 滲透細(xì)胞膜。接著，細(xì)胞與一抗（E-cadherin、N-cadherin 或Vimentin）在4 ℃孵育過(guò)夜。24 h 后，細(xì)胞與FITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體孵育2 h。細(xì)胞核用DAPI 染色。圖像用倒置顯微鏡拍攝。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 資料均采用正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。將正常組織與癌組織數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)比較。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行比較。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平 與正常組織相比，卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA XIST 表達(dá)升高，miR-340-5p 表達(dá)降低（P<0.05），見(jiàn)圖1A。與IOSE80細(xì)胞相比，ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA XIST 表達(dá)增高，miR-340-5p 表達(dá)降低（P<0.05），見(jiàn)圖1B。由于A2780 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST、miR-340-5p 表達(dá)水平與IOSE80 細(xì)胞差異最明顯，故選擇A2780 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

圖1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of lncRNA XIST and miR-340-5p in ovarian cancer tissues and cell lines

2.2 lncRNA XIST 靶 向下調(diào)miR-340-5p 表達(dá) StarBase 網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示lncRNA XIST 與miR-340-5p存在互補(bǔ)位點(diǎn)，見(jiàn)圖2A。與NC mimics+WT-lncRNA XIST 組相比，miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 組熒光素酶活性降低（P< 0.05），見(jiàn)圖2B。此外，si-lncRNA XIST 組miR-340-5p 水平高于si-NC 組，pc-lncRNA XIST 組miR-340-5p 水平低于pcDNA 組（P<0.05），見(jiàn)圖2C。

圖2 lncRNA XIST 靶向結(jié)合miR-340-5p 并下調(diào)miR-340-5p 表達(dá)Fig.2 lncRNA XIST targets miR-340-5p and downregulates miR-340-5p expression

2.3 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌細(xì)胞遷移 與Control 組、si-NC組比較，si-lncRNA XIST 組lncRNA XIST 水平、劃痕愈合率下降（t= 26.497、26.931、56.383、56.040，P<0.05）；與si-lncRNA XIST組、si-lncRNA XIST+NC inhibitor組相比，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組lncRNA XIST 水平、劃痕愈合率增加（t= 24.325、23.456、48.614、48.190，P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細(xì)胞遷移（×50）Fig.3 Effect of si-lncrNA XIST transfection on migration of ovarian cancer cells

2.4 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 抑制卵巢癌細(xì)胞侵襲 si-lncRNA XIST 組細(xì)胞侵襲數(shù)低于Control 組、si-NC 組（t= 33.115、32.526，P< 0.05）；si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組細(xì)胞侵襲數(shù)高于silncRNA XIST 組 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組（t=26.207、25.425，P<0.05），見(jiàn)圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌細(xì)胞EMT 與Control 組 和si-NC組相比，si-lncRNA XIST 組E-cadherin mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin和Vimentin 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；與si-lncRNA XIST 組和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組相比，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組E-cadherin mRNA 和蛋白表達(dá)水平下降，Ncadherin 和Vimentin 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平增高（P<0.05），見(jiàn)圖4、表7。另外，圖5 顯示，與Control組和si-NC 組比較，si-lncRNA XIST 組E-cadherin 表達(dá)增強(qiáng)，N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)減弱；與si-lncRNA XIST 組 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組 比較，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組E-cadherin 表達(dá)減弱，N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)增強(qiáng)。

圖4 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細(xì)胞侵襲（×200）Fig.4 Effect of si-lncrNA XIST transfection on ovarian cancer cell invasion

圖5 轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細(xì)胞EMT 標(biāo)志物表達(dá)（×200）Fig.5 Effect of si-lncrNA XIST transfection on EMT marker expression in ovarian cancer cells

3 討論

EMT 是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，癌細(xì)胞表現(xiàn)為極性喪失和細(xì)胞表型從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的改變，被認(rèn)為是血管生成上調(diào)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)和細(xì)胞外基質(zhì)侵襲等典型腫瘤表型的先決條件，也被認(rèn)為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟［11］。通過(guò)EMT，轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征，具有間充質(zhì)表型的單個(gè)癌細(xì)胞可以穿過(guò)內(nèi)皮屏障進(jìn)入血液和淋巴循環(huán)［12］。這一過(guò)程的關(guān)鍵分子特征是上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin 的下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin 的上調(diào)［13-14］。

許多研究［15-17］表明，lncRNA可以通過(guò)參與EMT進(jìn)程影響腫瘤的侵襲和遷移。lncRNA XIST 是一種17 kb 的lncRNA，通過(guò)調(diào)控哺乳動(dòng)物X 染色體失活，獲得XX 女性和XY 男性之間的基因劑量等效值［18］。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，lncRNA XIST 能促進(jìn)卵巢癌、宮頸癌的進(jìn)展以及膠質(zhì)瘤的EMT［19-21］。本研究結(jié)果顯示，lncRNA XIST 在卵巢癌組織和4 種卵巢癌細(xì)胞系中均上調(diào)表達(dá)，這與JIANG 等［8］的發(fā)現(xiàn)一致，說(shuō)明lncRNA XIST 在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用。另外，以lncRNA XIST 表達(dá)最高的A2780細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染si-lncRNA XIST 下調(diào)lncRNA XIST 表達(dá)后，A2780 細(xì)胞的遷移和侵襲能力被抑制，此外，干擾lncRNA XIST 可顯著提高E-cadherin 表達(dá)，降低N-cadherin 和Vimentin 表達(dá)，與既往研究一致，提示干擾lncRNA XIST 表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的EMT 進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。

以往研究［22］表明，lncRNA XIST 對(duì)卵巢癌的影響通過(guò)調(diào)控miRNA實(shí)現(xiàn)，其下游靶點(diǎn)包括miR-335、miR-106a［23］等。本研究根據(jù)StarBase 預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-340-5p 是lncRNA XIST 的一個(gè)可能靶點(diǎn)。miR-340-5p 可能是結(jié)直腸癌的一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，其通過(guò)直接靶向結(jié)直腸癌中的ANXA3 發(fā)揮其抑瘤功能［24］。miR-340-5p 在甲狀腺癌中高表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)甲狀腺癌增殖［25］。然而，miR-340-5p 在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究在卵巢癌組織和細(xì)胞系中檢測(cè)到顯著降低的miR-340-5p 水平，說(shuō)明miR-340-5p 可能在卵巢癌中發(fā)揮抑癌功能，這與miR-340-5p 在甲狀腺癌中的作用相反，提示miR-340-5p 的表達(dá)趨勢(shì)與癌細(xì)胞的類(lèi)型相關(guān)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA XIST 與miR-340-5p 之間的直接調(diào)控關(guān)系。抑制miR-340-5p 表達(dá)在體外逆轉(zhuǎn)了干擾lncRNA XIST 對(duì)卵巢癌遷移、侵襲及EMT 的作用。這說(shuō)明lncRNA XIST 通過(guò)抑制miR-340-5p 在卵巢癌中發(fā)揮致癌作用。

綜上所述，lncRNA XIST 通過(guò)靶向下調(diào)miR-340-5p 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT 和遷移、侵襲，有助于探索卵巢癌新的治療策略。然而，本研究還存在一些不足之處。第一，卵巢癌的臨床樣本量較少；第二，未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?；谶@兩點(diǎn)，未來(lái)將通過(guò)擴(kuò)大臨床組織樣本量，并采用荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)，深入研究lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌中的功能和作用機(jī)制。