李亞軍，李良勇，吳云虎，楊文明，2

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031； 2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038

腦梗死是顱內(nèi)動(dòng)脈供血主干或穿支動(dòng)脈突然中斷血流，使其供血區(qū)域突然缺血缺氧，腦組織迅速壞死的一類(lèi)疾病[1]，隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)相應(yīng)區(qū)域的神經(jīng)功能缺損，可表現(xiàn)為偏癱、偏盲、偏深感覺(jué)異常以及頭暈等癥狀，大血管閉塞可能使患者除以上表現(xiàn)外迅速進(jìn)展為昏迷狀態(tài)，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康，是目前致殘、致死率較高的疾病之一[2]，我國(guó)腦梗死的發(fā)病率較高且呈上升趨勢(shì)[3]。目前，對(duì)時(shí)間窗內(nèi)的腦梗死患者常使用藥物靜脈溶栓和大血管病變的機(jī)械取栓等治療，但是能夠從中獲益的患者比較少[4]，所以藥物保守治療仍然是目前主要的治療手段。藥物保守治療主要通過(guò)改善側(cè)支循環(huán)，挽救缺血半暗帶，同時(shí)通過(guò)腦細(xì)胞保護(hù)劑抑制凋亡神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)功能的進(jìn)一步損害[5]。在急性期腦梗死發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，炎癥反應(yīng)貫穿急性期的全過(guò)程，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后[6]。安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院采用腦絡(luò)通顆粒治療急性腦梗死取得很好的臨床療效，但是對(duì)于該藥臨床使用機(jī)制缺乏客觀依據(jù)。本文采用改良線(xiàn)栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致的急性腦梗死大鼠模型探討腦絡(luò)通顆粒對(duì)急性腦梗死模型大鼠Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路及其下游炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)的影響，挖掘腦絡(luò)通顆粒治療急性腦梗死的作用機(jī)制，為臨床合理用藥和新藥開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物15只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量 180～220 g，購(gòu)自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(豫)2019-0002，合格證號(hào)：HXDW221936。大鼠飲用水為滅菌二級(jí)超純水，質(zhì)量符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)的規(guī)定。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25 ℃，相對(duì)濕度范圍40%～70%。實(shí)驗(yàn)前大鼠在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)7 d。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可(動(dòng)物倫理編號(hào)：AHUCM-rats-2022099)。

1.2 藥物與試劑黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、葛根、石菖蒲、地龍、熟地黃(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，顆粒劑，批號(hào)：21090158、21030075、20100193、21100182、21050052、21100234、21030065、20120074)。水合氯醛(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：23100)；大鼠CRP、TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒[科鹿(武漢)生物科技有限公司，貨號(hào)：ELK1055、ELK1396、ELK1272]；IKK-β抗體、MyD88抗體(江蘇親科生物研究中心，貨號(hào)：AF6009、AF5195)；TLR4抗體、NF-κB P65抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(H+L)二抗、超敏兔鼠通用二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：19811-1-AP、10745-1-AP、SA00001-2、SA00001-1、PR30009)；蘇木素染液(杭州浩克生物科技有限公司，貨號(hào)：HK1024)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0012、P0013、ST506)。

1.3 儀器眼科鑷、精細(xì)剪、持針鉗(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號(hào)：F12005-10、S18001-11、F31025-13)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，型號(hào)：DR-200Bc)；水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：DK-98-IIA)；恒溫箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DHG-9070A)；高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)：KZ-II)；移液槍[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司，型號(hào)：KE003068]；離心機(jī)(美國(guó)SCILOGEX公司，型號(hào)：CF1524R)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型建立及干預(yù)15只SPF級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，分為假手術(shù)組(n=8)和造模組(n=16)，除假手術(shù)組外，其余大鼠采用線(xiàn)栓法制備大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型，按 10 mL·kg-1體積腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉后仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露頸總及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，并在頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈剪口，插入頭端燒成圓鈍形且直徑為 0.25 mm 的尼龍魚(yú)線(xiàn)，進(jìn)線(xiàn)長(zhǎng)度18～19 mm，在大腦中動(dòng)脈起始端堵塞大腦中動(dòng)脈，然后將頸外動(dòng)脈連同尼龍魚(yú)線(xiàn)一起結(jié)扎，縫合皮膚，單籠喂養(yǎng)，大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)，提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈即判定為模型成功，假手術(shù)組分離動(dòng)脈后不插入魚(yú)線(xiàn)。造模成功后將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、腦絡(luò)通組，每組8只，腦絡(luò)通組大鼠給予腦絡(luò)通混懸液，劑量為20.2 g·kg-1，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14 d，每天1次。

2.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分參照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]，每天對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，其標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)任何神經(jīng)功能損傷癥狀為0分；不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分；向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；向?qū)?cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失為4分。

2.3 TTC染色觀察大鼠腦梗死體積大鼠神經(jīng)功能測(cè)試后，禁食24 h稱(chēng)其質(zhì)量，按10 mL·kg-1體積腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，取血后分離完整腦組織。腦組織標(biāo)本置于干凈的 50 mL 離心管中，立即置于-20 ℃冰箱保存，每組3只，30 min后取出切片，加入5 mL TTC染液，置于37 ℃烘箱中避光反應(yīng)20～30 min，中間不時(shí)翻動(dòng)腦切片，使染色充分，然后將腦切片放入PBS中浸泡 5 min，取出拍照。使用Image J軟件對(duì)梗死面積進(jìn)行分析。

2.4 ELISA實(shí)驗(yàn)取剩余5只大鼠的適量腦組織于預(yù)冷的PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.0～7.2)中清洗去除血液，稱(chēng)其質(zhì)量后將組織剪碎放入專(zhuān)用的研磨儀離心管中，然后按140的質(zhì)量體積比(gmL)加入PBS溶液，并加入適量的蛋白酶抑制劑，使用高速組織研磨儀60 HZ、180 s研磨1～3次，直至研磨充分。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，對(duì)樣本反復(fù)凍融處理2次。最后將制備好的勻漿液于5 000 r·min-1離心10 min，取上清即可檢測(cè)。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟檢測(cè)大鼠血清與腦組織中CRP、TNF-α、IL-1β的水平。

2.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)取剩余5只大鼠的部分腦組織，加入RIPA細(xì)胞裂解液，提取各組腦組織中總蛋白，加樣，電泳、轉(zhuǎn)膜；采用5%脫脂奶粉封閉 2 h。經(jīng)過(guò)洗滌，加入一抗TLR4、NF-κB P65(稀釋比例為1500)及IKK-β、MyD88(稀釋比例為11 000)于4 ℃孵育過(guò)夜；加入按照110 000比例稀釋后的二抗孵育2 h。經(jīng)洗滌顯影后拍照，保存圖像，分析數(shù)據(jù)。

2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)取剩余5只大鼠的部分腦組織，將腦組織樣本置于4%多聚甲醛中固定48 h后，采用石蠟包埋，制備腦組織樣本石蠟切片后行免疫熒光染色，將切片經(jīng)脫蠟至水進(jìn)行抗原修復(fù)，分別采用TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88熒光抗體進(jìn)行 4 ℃ 孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育90 min后進(jìn)行DAPI染色，最后滴加抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片。于熒光顯微鏡下觀察染色效果，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評(píng)分比較假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能正常、無(wú)缺損，評(píng)分為0分。給藥前，與假手術(shù)組比較，模型組及腦絡(luò)通組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.01)。給藥后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，腦絡(luò)通組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 分)

3.2 TTC染色結(jié)果TTC染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，腦絡(luò)通顆粒治療14 d后，大鼠腦梗死體積明顯縮小(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A： TTC染色圖片，紅色為正常組織，白色為梗死組織；B：腦梗死體積半定量分析比較；n=3；與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3.3 大鼠血清與腦組織中TNF-α、IL-1β、CRP水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清 TNF-α、IL-1β、CRP水平及腦組織TNF-α、IL-1β水平極顯著升高(P<0.01)，腦組織CRP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，腦絡(luò)通組大鼠血清TNF-α水平及腦組織中IL-1β的水平極顯著下降(P<0.01)，血清IL-1β、CRP水平及腦組織TNF-α、CRP水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：A：血清中TNF-α、IL-1β及CRP水平比較(n=8)；B：腦組織中TNF-α、IL-1β及CRP水平比較(n=5)；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.4 免疫熒光結(jié)果比較DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色，Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Fluor594偶聯(lián)抗體將目的蛋白染成紅色。免疫熒光結(jié)果如圖所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，腦絡(luò)通組大鼠TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A：各組腦組織TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88免疫熒光染色圖片；B：免疫熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)分析；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；n=5

3.5 腦組織TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表達(dá)水平比較與假手術(shù)組比較，模型組TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，腦絡(luò)通組TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A：TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白條帶圖；B：TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表達(dá)水平比較；與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；n=5

4 討論

中醫(yī)稱(chēng)腦梗死為“中風(fēng)病”，自古以來(lái)就有大量的醫(yī)案及文獻(xiàn)報(bào)道證明盡早使用中醫(yī)藥干預(yù)治療可以減輕神經(jīng)功能缺損，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。中醫(yī)認(rèn)為中風(fēng)主要是平素氣血虧虛，心、肝、腎功能失調(diào)，加上情志不遂、飲食失節(jié)等因素導(dǎo)致陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂，上犯于腦，出現(xiàn)半身不遂，言語(yǔ)不清，甚至猝然昏仆等表現(xiàn)[8]。急性腦梗死發(fā)生后，缺血腦組織周?chē)鷷?huì)迅速建立側(cè)支循環(huán)，形成新生毛細(xì)血管起到代償作用，減少腦細(xì)胞凋亡，但是缺血核心區(qū)域仍然會(huì)有大量腦細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生自由基破壞周?chē)X組織。同時(shí)凋亡腦細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)產(chǎn)生大量炎癥因子，而這些炎癥因子又會(huì)阻礙受損神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，加速神經(jīng)功能缺損及延緩神經(jīng)功能的恢復(fù)[9-10]，因此，腦梗死患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義[11]。TLR4是Toll受體家族成員，在免疫激活中起著重要作用，參與腦梗死后炎癥反應(yīng)，激活TLR4/NF-κB炎癥通路，促進(jìn)神經(jīng)元炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[12-13]。TLR4/NF-κB是比較經(jīng)典的炎癥通路，TLR4作為上游炎癥調(diào)節(jié)因子，通過(guò)MyD88信號(hào)通路可以激活下游NF-κB，NF-κB是一種主要的氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)多種促炎基因，調(diào)節(jié)炎癥因子IL-1β、TNF-α和 IKK-β 等[14]。TLR4的異常表達(dá)可能引起異常的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，通過(guò)抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB通路的激活減少I(mǎi)L-1β、TNF-α和IKK-β等促炎因子釋放，最終減少鄰近神經(jīng)元的損傷[15]。TNF-α和 IL-1β 是促炎細(xì)胞因子，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可損傷內(nèi)皮細(xì)胞或?qū)е卵芄δ芪蓙y，使血管損傷和血栓形成，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和演變以及血栓性并發(fā)癥的發(fā)展[16]。IKK-β激活是NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與炎癥的發(fā)生有關(guān)[17]。在促炎因子的調(diào)控下，CRP生成增加，而CRP是體內(nèi)比較敏感的炎癥標(biāo)志物[18]。因此，TLR4/NF-κB炎癥通路及下游炎癥因子可參與腦組織損傷后炎癥反應(yīng)，抑制此炎癥通路可能是神經(jīng)保護(hù)的關(guān)鍵。

腦絡(luò)通顆粒由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心經(jīng)多年診治腦血管經(jīng)驗(yàn)積累，在補(bǔ)陽(yáng)還五湯的基礎(chǔ)上化裁成方，方劑由黃芪20 g、當(dāng)歸10 g、赤芍 10 g、川芎6 g、葛根15 g、石菖蒲10 g、地龍10 g、熟地黃6 g組成，方中取黃芪大補(bǔ)元?dú)猓瑲馔?，祛瘀不傷正，并助諸藥之力，為君藥；配以當(dāng)歸活血，有祛瘀而不傷好血之妙，是為臣藥；赤芍、川芎、熟大黃、葛根助當(dāng)歸活血祛瘀，地龍通經(jīng)活絡(luò)，石菖蒲醒神，為佐使藥；全藥共用具有益氣活血、 通絡(luò)開(kāi)竅之功，可用于氣滯血瘀等證的治療，而血瘀相關(guān)證型為急性缺血性腦卒中的主要證型[19]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、當(dāng)歸配伍可以一定程度上抑制TNF-α等炎癥標(biāo)志物的表達(dá)[20]。赤芍、川芎、葛根、石菖蒲、地龍、熟地黃等通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)血管新生，同時(shí)可抑制白介素等炎癥因子的表達(dá)[21-25]。從中醫(yī)角度分析，腦絡(luò)通顆粒組方具有益氣活血，通絡(luò)開(kāi)竅之功[26]?，F(xiàn)代藥理研究表明腦絡(luò)通顆粒具有抑制炎癥反應(yīng)，改善側(cè)支循環(huán)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用[27]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)急性腦梗死模型大鼠TLR4/NF-κB炎癥通路及其下游炎性因子的研究挖掘腦絡(luò)通顆粒治療急性腦梗死的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，腦絡(luò)通組大鼠腦梗死體積明顯小于模型組，神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組，說(shuō)明腦絡(luò)通顆?？梢詼p少模型大鼠的腦梗死體積，改善神經(jīng)功能。結(jié)合大鼠血清與腦組織樣本ELISA檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，腦絡(luò)通組血清及腦組織中CRP、TNF-α、IL-1β水平明顯下降，說(shuō)明腦絡(luò)通顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制腦組織損傷后的炎癥反應(yīng)減少梗死體積。免疫熒光及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腦絡(luò)通顆粒主要是通過(guò)降低TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表達(dá)水平抑制TLR4/NF-κB炎癥通路，抑制炎癥因子生成。

綜上所述，腦絡(luò)通顆粒通過(guò)降低TLR4、NF-κB P65、IKK-β、MyD88蛋白表達(dá)水平，抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路激活，減少CRP、TNF-α、IL-1β生成，從而減少大鼠腦梗死體積，改善大鼠神經(jīng)功能缺損。本研究為臨床使用腦絡(luò)通顆粒治療急性腦梗死提供了理論基礎(chǔ)，闡明了腦絡(luò)通顆粒治療急性腦梗死的作用機(jī)制。