馮躍梁，程有普，郝培培，張彩霞

（1．天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2．天津市綠亨化工有限公司，天津 300270）

乙蟲腈（ethiprole）屬苯基吡唑類手性殺蟲劑，能夠防治多種咀嚼式口器和刺吸口器害蟲，目前已在中國登記，并大量應(yīng)用于防治水稻中的稻飛虱[1]。水稻是我國主要糧食作物之一，也是我國種植面積較大的糧食作物之一[2]，由此可見，對乙蟲腈的環(huán)境風(fēng)險評估是重中之重。乙蟲腈有1個手性中心，2個對映體。手性農(nóng)藥暴露在手性環(huán)境中時往往在吸收、累積和降解過程中表現(xiàn)出不同的對映體選擇性[3]。研究手性農(nóng)藥對映體的立體選擇性是在對映體水平上全面評價手性農(nóng)藥環(huán)境行為的重要組成部分，既有助于手性農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險評估，又對有效單體的開發(fā)意義重大。

蚯蚓在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，是最重要的生物因子之一，在土壤中充當消費者、分解者和調(diào)節(jié)者的角色[4]。蚯蚓對土壤污染物很敏感，通過吸收、代謝可以清除一些污染物，如農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴和重金屬[5-6]。目前，蚯蚓被認為是一種監(jiān)測土壤表層中的污染物的指示生物，廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)試驗[7]。目前尚未見從對映體角度研究乙蟲腈在蚯蚓中的生物累積行為，基于此，本研究擬從對映體角度探討乙蟲腈在蚯蚓體內(nèi)富集行為，從而為全面評價乙蟲腈的環(huán)境行為和提高對映體水平上的生態(tài)風(fēng)險認識提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida），天津市賈立明蚯蚓養(yǎng)殖公司，供試生物選取健康、大小相似（300~350 mg）且?guī)в猩抄h(huán)帶的蚯蚓。人工土壤按照OECD準則配制。配比為：石英砂68.0%（過80~120目篩），高嶺土20.0%（高嶺石含量大于30.0%），泥炭蘚10.0%，用碳酸鈣調(diào)節(jié)人工土壤pH值為7.0±0.5，混合均勻后備用。

1.2 試驗試劑

乙蟲腈外消旋體（對映體比例1∶1，純度95.6%）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所提供；R-（+）,S-（-）乙蟲腈由上海勤路生物技術(shù)有限公司制備（光學(xué)純度大于99.0%）；色譜純甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、冰醋酸購于默克公司；分析純甲醇、乙腈、分析純氯化鈉、分析純無水硫酸鎂購于天津津科精細化工研究所；超純水由MilliQ超純水制備系統(tǒng)制備；Pesti-Carb/PSA、氧化鋁、氨基、PSA、佛羅鋁硅土固相萃取柱（500mg/6mL/30pkg）購于博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 試驗儀器

超臨界流體串聯(lián)質(zhì)譜(SFC-MS/MS)(Waters，美國)；樣品管理器、柱溫箱、二元溶劑管理器、補償泵、三重四級桿質(zhì)譜檢測器Xevo-TQD和MasslynxV.4.1工作站、人工氣候箱（寧波賽福實驗儀器有限公司，中國）；OD-3多糖涂敷型手性色譜（長度均為150 mm，內(nèi)徑2 mm）（大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司，日本）。

1.4 試驗方法

1.4.1 蚯蚓染毒 試驗設(shè)置單體濃度為0.5、5.0、12.5 mg·kg-1的3個處理組以及空白對照組。將乙蟲腈溶于丙酮，加入到裝有石英砂的培養(yǎng)皿中，將其放入通風(fēng)櫥中，使丙酮充分揮發(fā)，藥砂與人工土混勻，每個燒杯中加入15條蚯蚓。通過稱質(zhì)量補水，使土壤濕度保持在40%~60%。人工氣候箱的設(shè)置條件為濕度80%~85%、溫度（20±1）℃、光暗比16∶8。定期（2 h、1、2、3、5、7、10、14、21、28 d）取全部蚯蚓和50 g土壤。取出蚯蚓用純凈水洗凈體表后，置于干凈濕潤的濾紙上清腸6 h，用吸水紙擦干體表后稱質(zhì)量。蚯蚓和土壤樣品均置于聚乙烯樣品袋中，并且在-20℃下冷凍保存。

1.4.2 蚯蚓和人工土樣品處理 蚯蚓樣品轉(zhuǎn)移到10.0 mL離心管中，加入鋼珠，震蕩20 min，完成后取出備用。稱取2.0 g蚯蚓基質(zhì)，加入20.0 mL 1%醋酸乙腈，震蕩15.0 min，加入1.0 g NaCl和2.0 g無水MgSO4，渦旋5.0 min，吸取15.0 mL上清液加入到50.0 mL茄形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，加入色譜純乙腈復(fù)溶，備用。將PC/PSA小柱用10.0 mL乙腈活化，加入已備好的復(fù)溶液，并收集流出液，以V（甲苯）∶V（乙腈）=1∶3溶液5.0 mL做洗脫液，一并收集，旋干，用1.5 mL色譜純乙腈復(fù)溶。用注射器吸取上清液，通過0.22μm尼龍膜注，進行SFC-MS/MS分析。

將10.0 g人工土樣品放入50.0 mL離心管中，加入10.0 mL去離子水，加入10.0 mL1%醋酸乙腈，渦旋震蕩15.0 min后，加入2.0 g NaCl和4.0 g無水MgSO4，震蕩5 min，在2 811×g條件下離心5.0 min，吸取1.5 mL上清液加入到裝有50.0 mg C18+150.0 mg無水硫酸鎂的2.0 mL離心管中，震蕩1.0 min，放入離心機中，在離心力為2 811×g條件下，離心5.0 min。用注射器吸取上清液，過0.22μm尼龍膜，進行SFC-MS/MS分析。

1.4.3 儀器分析方法 本試驗使用超臨界流體串聯(lián)質(zhì)譜（SFC-MS/MS）對樣品進行分析。其中具體的源參數(shù)包括毛細管電壓、離子源溫度、脫溶溫度、錐狀氣體流量和脫溶氣體流量分別設(shè)定為3.5 kV、150.0℃、500.0℃、30.0 L·h-1、800.0 L·h-1。乙蟲腈的母離子質(zhì)量分數(shù)為394.9，定性離子質(zhì)量分數(shù)為250.1，碰撞電壓為35.0 V，錐孔電壓為20 V。定量離子質(zhì)量分數(shù)為331.0，碰撞電壓為15.0 V，錐孔電壓為20.0 V。乙蟲腈對映體的最佳拆分條件為：OD-3涂敷型手性色譜柱；改性劑比例V（CO2）∶V（IPA）=90∶10；流速：1.8 mL·min-1；柱溫：30.0℃；背壓：2 000.0 Psi。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析方法 以對映體分數(shù)(EF)表示手性農(nóng)藥的對映體選擇性。其中，EF=C(+)/[C(-)+C(+)][8]。EF值的定義范圍為0~1，EF=0.5表示外消旋體；EF值低于0.5，說明(-)-乙蟲腈優(yōu)先降解，反之亦然。乙蟲腈對映體的相對累積用生物-土壤累積因子(BSAF)表示。

式中，CEW為蚯蚓體內(nèi)農(nóng)藥濃度；CS為土壤初始農(nóng)藥濃度和最終農(nóng)藥濃度的平均值[9-10]。

使用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理、差異顯著性分析和單因素方差分析，使用Excel制圖。數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立前處理方法

2.1.1 蚯蚓 考察4種提取劑（乙腈、1%甲酸乙腈、1%醋酸乙腈、5%醋酸乙腈），結(jié)果只有1%醋酸乙腈的回收率在80%~120%之間，故選取1%醋酸乙腈作為提取劑。蚯蚓體內(nèi)脂質(zhì)較多，使用QuEChERS方法中的凈化劑可能對脂質(zhì)清除不徹底。因此，在本試驗中對QuEChERS前處理方法進行改良，結(jié)合固相萃取技術(shù)（SPE）對蚯蚓基質(zhì)進行凈化，試驗凈化效果良好。蚯蚓中含有色素及脂質(zhì)物，分別使用PSA固相萃取柱、Alumina N固相萃取柱、Florisil固相萃取柱、C18固相萃取柱、PC/PSA固相萃取柱對蚯蚓基質(zhì)進行凈化。結(jié)果顯示，PC/PSA固相萃取柱的回收率優(yōu)于PSA固相萃取柱和C18固相萃取柱，且凈化色素效果更好，所以選擇PC/PSA固相萃取柱作為蚯蚓的凈化劑。

配制200 mg·L-1的標準母液，將母液稀釋制備成濃度依次為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg·L-1的溶劑標。使用空白基質(zhì)提取液對母液進行稀釋，同樣制備成上述濃度的基質(zhì)標。通過樣品檢測，使用Execl進行線性回歸分析，得出（+）-乙蟲腈的線性方程為y=223.94x+2 945，R2=0.998 7。（-）-乙蟲腈的線性方程為y=213.62x+2637.3，R2=0.998 6。通過對精密度和準確度驗證，（+）-乙蟲腈的回收率為100.1%~104.7%，RSD為1.5%~5.7%；（-）-乙蟲腈的回收率為91.6%~104.4%，RSD為2.5%~6.9%。

2.1.2 人工土 考察上述4種提取劑，酸化乙腈的提取效率效果比乙腈的效率高，1%甲酸乙腈回收率過高，1%醋酸乙腈和5%醋酸乙腈的回收率相近，基于節(jié)省成本、溶劑浪費和環(huán)境保護的角度，選擇1%醋酸乙腈作為人工土中乙蟲腈的提取劑?？疾?種凈化劑組合（20 mg C18+150 mg無水MgSO4；40 mg C18+150 mg無 水MgSO4；50 mg C18+150 mg無 水MgSO4；40 mg PSA+150 mg無水MgSO4；50 mg PSA+150 mg無水MgSO4），最終選擇50 mg C18+150 mg無水MgSO4作為凈化劑。

按2.2.1方法進行試驗，得出（+）-乙蟲腈在人工土中的線性方程為y=216.89x+10 503，R2=0.999 0；（-）-乙蟲腈的線性方程為y=202.74x+10 054，R2=0.999 0。通過對精密度和準確度驗證，和回收率的計算（添加回收試驗中的樣品峰面積比上基質(zhì)標峰面積×100%），（+）-乙蟲腈的回收率為86.8%~107.0%，RSD為3.6%~4.4%；（-）-乙蟲腈的回收率為89.5%~107.4%，RSD為2.4%~8.0%。

2.2 蚯蚓在單體濃度為0.5 mg·kg-1條件下的累積行為

試驗結(jié)果顯示，人工土中的乙蟲腈對映體在前21 d內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定，但是在28 d時，（+）-乙蟲腈濃度降解較大，降解率超過20%，根據(jù)OECD準則要求，第21天的降解率未超過20%，因此在21 d換土更合適。蚯蚓體內(nèi)的乙蟲腈單體濃度在2 d達到最大值，隨后蚯蚓體內(nèi)的乙蟲腈單體濃度不斷降低，最終在14 d達到最低值，之后保持平穩(wěn)狀態(tài)到28 d。

蚯蚓體內(nèi)的EF值變化情況如圖1所示，隨著暴露時間的增加，蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體的EF值不斷降低。這說明蚯蚓更傾向于吸收（-）-乙蟲腈。

圖1 0.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體的EF值

2個對映體的BSAF計算結(jié)果如圖2所示，隨著暴露時間增加，BSAF值在第2天達到最高，隨后不斷降低，最終趨于平穩(wěn)。

圖2 0.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體的BSAF值

2.3 蚯蚓在5.0 mg·kg-1條件下的累積行為

乙蟲腈對映體在人工土中表現(xiàn)穩(wěn)定。蚯蚓體內(nèi)（-）-乙蟲腈和（+）-乙蟲腈在第3天達到最大值，隨后在14 d達到最低值，之后保持平穩(wěn)狀態(tài)到28 d。蚯蚓體內(nèi)的EF值如圖3所示。蚯蚓在吸收乙蟲腈對映體過程中存在選擇性，更易吸收（-）-乙蟲腈。BSAF結(jié)果如圖4所示，（+）-乙蟲腈在第2天達到峰值，隨后開始不斷下降。（-）-乙蟲腈在第3天達到峰值，隨后開始不斷下降。（+）-乙蟲腈的BSAF值為0.05~0.23，（-）-乙蟲腈的BSAF值為0.09~0.27。

圖3 5.0 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體的EF值

圖4 5.0 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體的BSAF值

2.4 蚯蚓在12.5 mg·kg-1條件下的累積行為

試驗結(jié)果顯示，乙蟲腈對映體在人工土中表現(xiàn)穩(wěn)定。蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體EF值變化情況由圖5所示。蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈的EF值低于0.5，說明（-）-乙蟲腈優(yōu)先被累積，存在對映體選擇性。兩個對映體的BSAF計算結(jié)果如圖6所示，（+）-乙蟲腈的BSAF值均小于（-）-乙蟲腈，說明（-）-乙蟲腈在蚯蚓體內(nèi)的濃度高。（+）-乙蟲腈的BSAF值為0.04~0.12，（-）-乙蟲腈的BSAF值為0.07~0.17。

圖5 12.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體的EF值

圖6 12.5 mg·kg-1濃度下蚯蚓體內(nèi)乙蟲腈對映體的BSAF值

在低中高3個濃度組中，乙蟲腈對映體在人工土中不易降解。3個濃度組中，蚯蚓體內(nèi)的EF值均低于0.5，這表明蚯蚓對（-）-乙蟲腈優(yōu)先在蚯蚓體內(nèi)富集。

2.5 不同濃度下蚯蚓體內(nèi)單體累積量

空白對照組中，蚯蚓體內(nèi)并未檢測出（+）-乙蟲腈。由圖7可以看出，在0.5 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內(nèi)（+）-乙蟲腈累積量在第2天達到最高值，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，之后開始下降，在第7天略有升高后，第10天開始下降，然后保持平穩(wěn)狀態(tài)。在5.0 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內(nèi)（+）-乙蟲腈在第2天達到峰值，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05），第3天開始下降，在第10天升高之后下降并保持平穩(wěn)。在12.5 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內(nèi)（+）-乙蟲腈在第1天達到最高濃度，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，在第10天下降到最低，之后保持穩(wěn)定狀態(tài)。

圖7 蚯蚓體內(nèi)（+）-乙蟲腈的累積濃度

空白對照組中，蚯蚓體內(nèi)并未檢測出（-）-乙蟲腈。從圖8中可以看出，在0.5 mg·kg-1處理組中，蚯蚓體內(nèi)（-）-乙蟲腈累積量在第2天達到最高，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，在第14天達到最低，接下來保持平穩(wěn)。在5.0 mg·kg-1處理組中，（-）-乙蟲腈累積量在第2天達到最高，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，然后開始降低，最終保持穩(wěn)態(tài)。在12.5 mg·kg-1處理組中，（-）-乙蟲腈累積量在第1天達到最高，與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，然后開始降低，最終保持穩(wěn)定狀態(tài)。

圖8 蚯蚓體內(nèi)（-）-乙蟲腈的累積濃度

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

乙蟲腈在蚯蚓體內(nèi)累積行為試驗結(jié)果顯示，乙蟲腈在中性土壤中表現(xiàn)穩(wěn)定，這與田發(fā)軍[11]和梁旭陽[12]得出的結(jié)論一致。但是，在0.5 mg·kg-1的人工土處理組中，前21 d EF值表現(xiàn)平穩(wěn)，在第28天（+）-乙蟲腈濃度降低，導(dǎo)致人工土中的乙蟲腈EF值降低。此時（+）-乙蟲腈降解率超過20%，21 d的降解率低于20%。因此，在21 d時更換人工土，更換土壤后EF值表現(xiàn)平穩(wěn)。本研究結(jié)果與高成玲[13]的呋蟲胺在蚯蚓體內(nèi)富集研究相似。

在0.5、5.0 mg·kg-1處理組中，（+）-乙蟲腈和（-）-乙蟲腈在第2天達到最高，此時蚯蚓體內(nèi)蓄積量與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，第14、21、28天差異不顯著（P＞0.05），達到穩(wěn)態(tài)。在12.5 mg·kg-1處理組中，（+）-乙蟲腈和（-）-乙蟲腈在第1天達到最高，此時蚯蚓體內(nèi)蓄積量與其他時間點的蓄積量差異顯著（P＜0.05)，第10、14、21、28天差異不顯著（P＞0.05），達到穩(wěn)態(tài)。這說明乙蟲腈生物累積主要發(fā)生在前期，污染程度越大，蓄積量越高。楊廣斌等[14]做過毒死蜱對蚯蚓累積特征研究，其結(jié)果與本研究類似。

通過3組乙蟲腈對映體的BSAF值對比筆者發(fā)現(xiàn)，隨著暴露濃度的增加，BSAF值反而降低。這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在溴敵隆[15]和全氟烷基物質(zhì)[16]中。原因可能是在高濃度的土壤或者沉積物中，生物體內(nèi)可用于吸附的結(jié)合位點飽和疏水有機物的抗解吸性導(dǎo)致。Kelly等[17]在研究中表示log Kow在2~5的范圍內(nèi)代表可能有吸附和累積的潛力。在PPDB（農(nóng)藥特性數(shù)據(jù)庫）中獲得的乙蟲腈的logKow為1.99小于2。因此，乙蟲腈對映體在蚯蚓體內(nèi)累積的可能性很低。高成玲[13]做過呋蟲胺在蚯蚓體內(nèi)的富集行為研究，本研究結(jié)果與其相似。

3.2 結(jié)論

本研究建立了一種蚯蚓和人工土中的乙蟲腈對映體的超臨界流體-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法的靈敏度、精密度、準確度均符合檢測要求，具有綠色、簡便、快捷的特點，可用于處理人工土壤和蚯蚓。蚯蚓對乙蟲腈對映體吸收具有選擇性。在3組不同濃度人工土中，蚯蚓對乙蟲腈對映體均不存在生物累積效應(yīng)。但土壤中污染物濃度越大，蚯蚓體內(nèi)前期累積量越大。這項工作為今后乙蟲腈的生物累積提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可作為環(huán)境風(fēng)險評估的參考。