管秀璐，沈詩(shī)嫄，張 琳，宋靖宇，劉金霞，常金花，毛曉霞，劉翠哲△

(承德醫(yī)學(xué)院：1.河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.病原生物學(xué)教研室，河北 承德 067000)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)又稱(chēng)代謝性脂肪性肝炎，是病理變化與酒精性肝炎相似但無(wú)過(guò)量飲酒史的臨床綜合征，易發(fā)于中年且超重肥胖個(gè)體[1]。NASH是非酒精性脂肪性肝病的炎癥亞型，可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病，是慢性肝病的重要病理階段[2]。NASH的發(fā)病率和致死率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，我國(guó)超五分之一的人受到NASH等肝臟疾病的困擾。NASH的發(fā)生可能是環(huán)境、遺傳、飲食和代謝等因素相互作用的結(jié)果,其組織病理學(xué)改變可能是由于多種機(jī)制所致,包括脂肪酸堆積、線粒體功能障礙、自由基的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化和內(nèi)毒素介導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放等[3]。目前，臨床上主要是從改善代謝功能、脂肪性變和抗炎等方面進(jìn)行NASH治療藥物的研發(fā)，但尚缺乏有效治療NASH的藥物[4-5]，現(xiàn)階段防治NASH的手段主要是控制飲食和鍛煉[6]，但絕大多數(shù)患者難以有效減重，更難長(zhǎng)期維持健康體重，因此，迫切需要尋找新型有效的NASH治療藥物。

黃芩是臨床常用中藥[7]。黃芩苷是黃芩的主要有效成分[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有抗炎、抗氧化、抗脂質(zhì)沉積和保肝等作用[9-12]，且黃芩苷對(duì)病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝纖維化等疾病均具有一定的保護(hù)作用[13-14]。在2020版《中華人民共和國(guó)藥典》中收錄的中藥處方制劑，如清開(kāi)靈注射劑、三黃片和銀黃顆粒等制劑均采用黃芩苷代替黃芩藥材投料[15]。但目前黃芩苷存在溶解度差、生物利用度低等問(wèn)題[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用藥劑學(xué)手段和結(jié)構(gòu)修飾等方法改善這一問(wèn)題，然而這些方法工藝復(fù)雜，難以適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)[17-18]。針對(duì)以上問(wèn)題，有學(xué)者從黃芩水提取物中分離得到一種水溶性較好的黃芩苷，即黃芩苷鎂鹽(結(jié)構(gòu)為1個(gè)鎂離子結(jié)合2個(gè)黃芩苷分子)[19]。有研究證實(shí)，黃芩苷能夠改善NASH大鼠的炎性反應(yīng)和脂質(zhì)沉積情況[20]，但黃芩苷鎂能否治療NASH尚缺乏相關(guān)研究。

本研究擬通過(guò)高脂飲食(HFD)建立Sprague-Dawley(SD)大鼠NASH模型，通過(guò)測(cè)定大鼠的體重、肝濕重、肝指數(shù)、血清生化指標(biāo)及病理等情況，比較不同造模時(shí)間、給藥時(shí)間和給藥劑量對(duì)大鼠NASH成模及黃芩苷鎂對(duì)NASH模型大鼠治療作用的影響，旨在為后期進(jìn)一步研究黃芩苷鎂治療NASH的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠64只，體重(120±20)g。大鼠購(gòu)自北京華阜康生物股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施許可證編號(hào)：SYXK(冀)2017-001。高脂飼料采用88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇的配比制得，購(gòu)自北京華阜康生物股份有限公司。動(dòng)物倫理號(hào)：LAC2021032。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 MSE125P電子分析天平(德國(guó)塞多利斯集團(tuán))，JA-2003電子天平(上海精科天平有限公司)，R2002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋(上海譜振生物股份有限公司)，1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫有限公司)，R510-25 RWD麻醉機(jī)(瑞沃德科技有限公司)，Velocity 14R型高速低溫離心機(jī)(澳大利亞生命動(dòng)力有限公司)，LW C400全自動(dòng)生化分析儀(深圳藍(lán)韻醫(yī)療器械)，RM2235型石蠟切片機(jī)和EG1150型石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)，Excelsior TMES 型自動(dòng)組織脫水機(jī)(美國(guó)賽默飛公司)，DM6000電子顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，LGJ-22D冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)有限公司)，DW-HL528S超低溫冰箱(中科美菱有限公司)，4510070移液槍、1 mL移液槍槍頭(德國(guó)賽默飛公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑 黃芩苷鎂(純度80.98%，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所劉翠哲教授課題組自制)；蘇木精-伊紅(HE)染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)邁瑞達(dá)科技股份有限公司)；磷酸(色譜純，美國(guó)邁瑞達(dá)科技股份有限公司)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LCL-C)試劑盒(寧波普瑞柏生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1溶液配制 精密稱(chēng)取黃芩苷鎂凍干粉0.14、0.28、0.56、0.84 g，分別溶于4 mL滅菌注射用水中，得到黃芩苷鎂25、50、100、150 mg/kg劑量溶液。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 將SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、黃芩苷鎂組1～4組(劑量分別為25、50、100、150 mg/kg)，空白組和模型組分別16只，其余每組各8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，空白組喂飼基礎(chǔ)飼料，模型組及黃芩苷鎂各劑量組喂飼高脂飼料。在第6、8周末禁食、禁飲12 h后，從空白組和模型組中分別隨機(jī)選取4只大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血處死，其余剩余大鼠及給藥組大鼠繼續(xù)喂飼高脂飼料，同時(shí)給藥組尾靜脈注射黃芩苷鎂，空白組和模型組尾靜脈注射生理鹽水。給藥1周后，每組隨機(jī)選取4只大鼠處死；給藥2周后，所有大鼠禁食、禁飲12 h后麻醉，腹主動(dòng)脈取血處死并取肝組織。

1.2.3指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天在同一時(shí)間測(cè)量大鼠體重，并觀察大鼠的飲食、活力和毛色等情況；處死前對(duì)大鼠進(jìn)行稱(chēng)重，處死后取出大鼠完整肝組織，稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100%)。大鼠麻醉后充分暴露腹腔進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，將血液樣本離心后取上清液，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定大鼠血清HDL-C、LDL-C、TC、TG、ALT、AST水平。

1.2.4病理檢查 各組大鼠處死后，取新鮮肝組織浸泡在4%甲醛溶液中固定，甲醛固定完成后，進(jìn)行洗滌、脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、展片、烤片等處理，然后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理學(xué)變化，參照《非酒精性脂肪性肝病中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見(jiàn)(2017年)》[21]，并計(jì)算非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度積分(NAS)。

2 結(jié) 果

2.1造模時(shí)間對(duì)NASH大鼠模型形成的影響 造模6周時(shí)，與空白組比較，模型組大鼠體重、肝濕重和肝指數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組大鼠血清中ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模8周時(shí)，與空白組比較，模型組大鼠毛發(fā)粗糙，活動(dòng)減弱，體重、肝濕重和肝指數(shù)，以及血清中ALT、AST、TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、2。如圖1病理結(jié)果顯示，造模8周時(shí)模型組大鼠肝臟表面有油脂覆蓋，邊緣輪廓鈍厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與造模6周時(shí)的模型組相比，肝指數(shù)和血清生化指標(biāo)較空白組的差異更大。

表1 不同造模時(shí)間的大鼠體重相關(guān)指標(biāo)比較

表2 不同造模時(shí)間的大鼠血清生化指標(biāo)比較

注：A.造模6周空白組；B.造模6周模型組；C.造模8周空白組；D.造模8周模型組。圖1 造模6、8周空白組和模型組大鼠肝臟病理圖(HE染色，400×)

2.2給藥時(shí)間和劑量對(duì)黃芩苷鎂治療NASH模型大鼠各指標(biāo)的影響 給藥1周時(shí)，與模型組比較，空白組各指標(biāo)差別明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芩苷鎂1組各指標(biāo)無(wú)顯著性變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；黃芩苷鎂2組大鼠部分指標(biāo)水平降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；黃芩苷鎂3、4組大鼠體重相關(guān)指標(biāo)有所下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；黃芩苷鎂3組大鼠血清ALT、LDL-C水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AST、TC、TG水平降低，HDL-C水平升高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；黃芩苷鎂4組大鼠血清ALT、AST、TC、TG及LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥2周時(shí)，與模型組比較，黃芩苷鎂1組各指標(biāo)無(wú)顯著性變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；黃芩苷鎂2組大鼠肝濕重、ALT、AST、TC、TG水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余指標(biāo)稍有變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；黃芩苷鎂3、4組大鼠體重、肝濕重和肝指數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，血清生化指標(biāo)ALT、AST、TC、TG、LDL-C的水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3～6。

表3 不同給藥時(shí)間各組大鼠體重相關(guān)指標(biāo)比較

2.3給藥時(shí)間和劑量對(duì)黃芩苷鎂治療NASH病理學(xué)的影響 如圖2病理結(jié)果顯示，空白組大鼠肝索排列整齊，肝組織結(jié)構(gòu)正常。與模型組比較，黃芩苷鎂1組大鼠NAS無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；脂肪變性程度強(qiáng)，氣球樣變多，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黃芩苷鎂2～4組大鼠的脂質(zhì)沉積和炎性反應(yīng)均顯著改善，NAS均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。特別是黃芩苷鎂4組，從圖2可見(jiàn)其對(duì)病理?yè)p傷的改善作用更明顯，且NAS更低。給藥2周時(shí)各組大鼠NAS比較見(jiàn)圖3。

A.空白組；B.模型組；C.黃芩苷鎂1組；D.黃芩苷鎂2組；E.黃芩苷鎂3組；F.黃芩苷鎂4組。圖2 給藥2周時(shí)各組大鼠肝臟病理圖(HE染色，400×)

表4 不同給藥時(shí)間各組大鼠ALT、AST指標(biāo)比較

表5 不同給藥時(shí)間各組大鼠TC、TG指標(biāo)比較

表6 不同給藥時(shí)間各組大鼠HDL-C、LDL-C指標(biāo)比較

注：與黃芩苷鎂4組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.01。圖3 給藥2周時(shí)各組大鼠NAS比較

3 討 論

近年來(lái)，NASH的發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅到人類(lèi)身體健康[22]，目前尚缺乏有效的治療手段。NASH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且造模方式多樣，因此，NASH動(dòng)物模型的成功復(fù)制對(duì)于深入研究NASH的發(fā)病機(jī)制和合理治療意義重大。飲食模型是最常用的NASH模型，HFD誘導(dǎo)的NASH可引起增重、肥胖和胰島素抵抗等，與人類(lèi)的發(fā)病機(jī)制相近[23]，所以本研究采用HFD誘導(dǎo)方式建立NASH大鼠模型，通過(guò)比較造模6、8周時(shí)體重、肝濕重、肝指數(shù)、血清生化指標(biāo)和病理情況，最終選取8周為HFD誘導(dǎo)NASH的成模時(shí)間。

黃芩苷可以抑制毒性物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的損傷[24]，減輕肝損傷過(guò)程中的炎性反應(yīng)及纖維化改變；在急性肝損傷模型中，黃芩苷能夠顯著改善肝功能，減輕肝臟病理?yè)p傷[25]。目前，黃芩苷在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗、肝細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激方面的作用已被證實(shí)[26-28]。QIAO等[29]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有治療作用；ZHAO等[30]研究者運(yùn)用葛根素、黃芩苷和小檗堿聯(lián)合治療來(lái)改善高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NASH?；诖耍狙芯吭u(píng)價(jià)了黃芩苷鎂對(duì)NASH大鼠模型的治療作用，結(jié)果顯示，尾靜脈注射黃芩苷鎂1周時(shí)治療效果不明顯，給藥2周時(shí)，NASH大鼠體重相關(guān)指標(biāo)、血清生化指標(biāo)和病理狀況明顯好轉(zhuǎn)。通過(guò)考察不同給藥劑量下大鼠血清指標(biāo)及病理學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，給藥劑量為25 mg/kg時(shí)對(duì)NASH大鼠治療效果不明顯，50、100、150 mg/kg對(duì)相關(guān)指標(biāo)均具有不同程度的改善作用，且呈劑量依賴(lài)性。

綜上所述，黃芩苷鎂對(duì)NASH大鼠模型具有治療作用，且呈劑量依賴(lài)性，給藥2周時(shí)治療效果更好，為后期進(jìn)一步深入研究黃芩苷鎂治療NASH的作用機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。