程 庚， 徐成勛， 李永國， 李 琪,2??

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

長牡蠣(Crassostreagigas)作為中國北方牡蠣主要養(yǎng)殖品種在海水養(yǎng)殖中占有重要地位。為提高長牡蠣的生產(chǎn)性能，國內(nèi)外相繼開展了遺傳改良工作。選擇育種作為水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類品種改良的一種常用育種方法，能夠改良生產(chǎn)性狀，在世界范圍內(nèi)長牡蠣家系選育和群體選育均取得了成功[1]。在國內(nèi)，通過家系選育和群體選育培育出外殼和外套膜均為金黃色、生長快速的長牡蠣“海大2號”[2]。然而，同普通二倍體牡蠣一樣，因夏季性腺發(fā)育和產(chǎn)卵導(dǎo)致其存在口感差、夏季不能上市、產(chǎn)卵后死亡率高等問題[3]，這阻礙了長牡蠣“海大2號”的市場全年供給。與二倍體相比，三倍體牡蠣由于其高度不育可全年上市，這填補(bǔ)二倍體牡蠣的夏季市場空缺。同時，利用其性腺不育性可以有效保護(hù)新品種的知識產(chǎn)權(quán)[4-8]。

使用牡蠣四倍體與二倍體雜交可獲得100%三倍體牡蠣[9]，但四倍體牡蠣的獲得需要三倍體牡蠣作為基礎(chǔ)[10]。因此，由二倍體誘導(dǎo)三倍體仍然是獲取三倍體的重要途徑。利用貝類卵子發(fā)育成熟后在第一次減數(shù)分裂中期的停滯期[11]，以物理或化學(xué)刺激手段抑制其極體排放，可實(shí)現(xiàn)增加一套染色體的目的[8]。其中，化學(xué)方法為通過細(xì)胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因等化學(xué)藥物處理[12-13]影響微絲、微管的正?；顒?，干擾極體的正常排出；物理方法則是通過鹽度脅迫、溫度休克、靜水壓等處理[14-16]達(dá)到增加染色體數(shù)目的目的。兩種方式各有優(yōu)劣，化學(xué)法三倍體誘導(dǎo)率高但幼蟲成活率低且試劑昂貴[17-18]，物理法成本低但誘導(dǎo)率不穩(wěn)定[15,19]。因此，將物理法和化學(xué)法相結(jié)合有望在保證三倍體誘導(dǎo)率的同時提高幼蟲成活率。

目前，在牡蠣三倍體誘導(dǎo)優(yōu)化方面進(jìn)行了大量研究，但是不同物種以及同一物種不同品系或群體的最佳誘導(dǎo)條件仍存在一定差異[12,20]。本研究以長牡蠣“海大2號”為實(shí)驗(yàn)材料，將化學(xué)法(6-DMAP)與物理法(低滲)相結(jié)合來誘導(dǎo)牡蠣三倍體，旨在得到誘導(dǎo)率高且幼蟲成活率穩(wěn)定的三倍體誘導(dǎo)方法，為培育長牡蠣“海大2號”三倍體提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2021年5月自山東榮成桑溝灣養(yǎng)殖海區(qū)取2齡長牡蠣“海大2號”二倍體，轉(zhuǎn)移至煙臺萊州育苗場進(jìn)行暫養(yǎng)。促熟期間每日投喂足量等鞭金藻(Isochrysisgalbana)。2周后挑選外殼無損傷的個體作為實(shí)驗(yàn)親貝。

1.2 精卵獲取與授精

通過人工解剖獲取牡蠣精卵，顯微鏡下辨別雌雄并觀察精卵成熟度。挑選卵子呈卵圓形且卵質(zhì)均勻的個體為母本，精子活力高的個體為父本。使用300目篩絹過濾卵子去除組織塊及雜質(zhì)，隨后置于砂濾海水中熟化1 h，精子于授精前5 min擠出備用。授精前鏡檢卵子是否污染，水溫嚴(yán)格控制在(25±0.5) ℃。

1.3 三倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 低滲誘導(dǎo)三倍體 參考于瑞海[21]等方法，確定低滲誘導(dǎo)三倍體最佳條件組合。授精后，在顯微鏡下不斷取樣觀察，當(dāng)受精卵第一極體(PB1)出現(xiàn)30%、40%和50%時，分別于鹽度為8、10和12的低滲海水中持續(xù)處理15 min (共9組)，然后轉(zhuǎn)移到正常海水中孵化。

1.3.2 6-DMAP誘導(dǎo)三倍體 參考Gérard等[12]方法，確定6-DMAP誘導(dǎo)三倍體最佳條件組合。當(dāng) PB1出現(xiàn)30%、40%和50%時，分別采用濃度為50、75和100 mg/L的6-DMAP持續(xù)處理15 min后(共9組)進(jìn)行洗卵，并轉(zhuǎn)移到正常海水中孵化。

1.3.3 低滲與6-DMAP配合使用誘導(dǎo)三倍體 當(dāng)PB1出現(xiàn)30%、40%和50%時，在鹽度為8、10和12的低滲海水中分別采用濃度為50、75和100 mg/L的6-DMAP持續(xù)處理15 min后(共27組)。以上每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，同時設(shè)置二倍體對照組。

1.4 幼蟲培養(yǎng)

授精24 h后進(jìn)行選幼，每日投喂等鞭金藻3次，每日換水1/3，持續(xù)充氧，幼蟲培養(yǎng)至第8天。

1.5 數(shù)據(jù)測量與分析

測量各實(shí)驗(yàn)組的卵裂率、孵化率、三倍體率、幼蟲成活率和綜合評價指數(shù)等指標(biāo)。卵裂率為受精后4 h卵裂數(shù)占總卵數(shù)的百分比，孵化率為受精后24 h D形幼蟲占總受精卵數(shù)量的百分比。綜合評價指數(shù)為孵化率與三倍體率的乘積。分別在第2天和第8天取各組幼蟲進(jìn)行三倍體率及幼蟲成活率測定。三倍體率利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。采用SPSS 24.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 低滲誘導(dǎo)效果

隨著鹽度的增加，各組的卵裂率和孵化率逐漸增加，而三倍體率逐漸降低。隨著起始處理時間點(diǎn)的后移，各組卵裂率、孵化率、三倍體率呈先增加后降低的趨勢。海水鹽度為8、40% PB1出現(xiàn)時(以下簡稱“8%+40% PB1”組)開始進(jìn)行低滲處理獲得的幼蟲三倍體率最高，達(dá)到73.77%±1.89%，且顯著高于其他處理組(P<0.05)，綜合評價指數(shù)最大，為34.33%(見圖1(a))。8日齡時，低滲處理組的三倍體率和存活率與2日齡相比均有不同幅度的降低。隨著鹽度的增加，各組三倍體率的下降幅度呈減小趨勢，“8+40% PB1”組三倍體率為50.65%±4.89%，下降幅度最大，為23.12%?！?+40% PB1”組三倍體率與“10+40% PB1”組(48.47%±5.58%)差異不顯著，但顯著高于其他處理組(P<0.05)。隨著鹽度的增加，2日齡幼蟲存活率無顯著差異(P>0.05)，8日齡幼蟲存活率逐漸增加(見圖1(b))。綜合比較以上結(jié)果，海水鹽度為8、40% PB1出現(xiàn)時開始處理是誘導(dǎo)三倍體的最佳條件。

(1. 8+30% PB1, 2. 8+40% PB1, 3. 8+50% PB1, 4. 10+30% PB1, 5. 10+40% PB1, 6. 10+50% PB1, 7. 12+30% PB1, 8. 12+40% PB1, 9. 12+50% PB1, 10. 對照組。不同上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)，下同。1. 8+30% PB1, 2. 8+40% PB1, 3. 8+50% PB1, 4. 10+30% PB1, 5. 10+40% PB1, 6. 10+50% PB1, 7. 12+30% PB1, 8. 12+40% PB1, 9. 12+50% PB1, 10. Control. The different letter indicates signifi-cant difference(P<0.05)， The same below.)

2.2 6-DMAP誘導(dǎo)效果

隨著6-DMAP濃度增加，各組的卵裂率和孵化率逐漸降低，三倍體率逐漸增加。隨著起始處理時間點(diǎn)的變化，各組的卵裂率和孵化率無顯著差異。6-DMAP濃度為100 mg/L、40% PB1出現(xiàn)時(以下簡稱“100 mg/L+40% PB1”組)開始處理三倍體率最高，為77.75%±1.85%，與“75 mg/L+40% PB1”組(74.81%±0.68%)、“100 mg/L+30% PB1”組(74.05%±3.28%)、“100 mg/L+50% PB1”組(71.17%±5.17%)差異不顯著(P>0.05)?！?5 mg/L+40% PB1”組綜合評價指數(shù)最大，為36.53%(見圖2(a))。8日齡時，“75 mg/L+40% PB1”組三倍體率最高(60.37%±0.61%)，與“100 mg/L+40% PB1”組(60.22%±2.94%)和“100 mg/L+50% PB1”組(58.13%±2.59%)差異不顯著(P>0.05)。8日齡幼蟲“50 mg/L+40% PB1”組的成活率最高(41.85%±3.68%)，與“50 mg/L+50% PB1”組(39.10%±3.52%)、“75 mg/L+40% PB1”組(30.25%±2.85%)差異不顯著，但顯著高于其他處理組(P<0.05)(見圖2(b))。因此，6-DMAP濃度為75 mg/L、第一機(jī)體出現(xiàn)40%時開始處理是誘導(dǎo)三倍體最佳條件。

(1. 50 mg/L+30% PB1, 2. 50 mg/L+40% PB1, 3. 50 mg/L+50% PB1, 4. 75 mg/L+30% PB1, 5. 75 mg/L+40% PB1, 6. 75 mg/L+50% PB1, 7. 100 mg/L+30% PB1, 8. 100 mg/L+40% PB1, 9. 100 mg/L+50% PB1, 10. 對照組。1. 50 mg/L+30% PB1, 2. 50 mg/L+40% PB1, 3. 50 mg/L+50% PB1, 4. 75 mg/L+30% PB1, 5. 75 mg/L+40% PB1, 6. 75 mg/L+50% PB1,7. 100 mg/L+30% PB1, 8. 100 mg/L+40% PB1, 9. 100 mg/L+50% PB1, 10. Control.)

2.3 低滲與6-DMAP配合使用誘導(dǎo)效果

2.3.1 鹽度為8時6-DMAP誘導(dǎo)效果 鹽度為8時，隨著6-DMAP濃度的增加，處理組的卵裂率和孵化率逐漸降低，各處理組間無顯著差異，但顯著低于對照組(P<0.05)?！?0 mg/L+50% PB1”組三倍體率和綜合評價指數(shù)最高，分別為54.58%±3.87%和24.96%(見圖3(a))。8日齡時處理組僅“50 mg/L+30% PB1”組和“50 mg/L+40% PB1”組和“50 mg/L+50% PB1”組幼蟲存活，其他處理組幼蟲大量死亡。“50 mg/L+40% PB1”組三倍體率最高(43.82%±2.16%)，“50 mg/L+50% PB1”組存活率最高(19.07%)(見圖3(b))。

(1. 50 mg/L+30% PB1, 2. 50 mg/L+40% PB1, 3. 50 mg/L+50% PB1, 4. 75 mg/L+30% PB1, 5. 75 mg/L+40% PB1, 6. 75 mg/L+50% PB1, 7. 100 mg/L+30% PB1, 8. 100 mg/L+40% PB1, 9. 100 mg/L+50% PB1, 10. 對照組。圖中(a)和(b)鹽度條件為8，(c)和(d)鹽度條件為10，(e)和(f)鹽度條件為12。 1. 50 mg/L+30% PB1, 2. 50 mg/L+40% PB1, 3. 50 mg/L+50% PB1, 4. 75 mg/L+30% PB1, 5. 75 mg/L+40% PB1, 6. 75 mg/L+50% PB1, 7. 100 mg/L+30% PB1, 8. 100 mg/L+40% PB1, 9. 100 mg/L+50% PB1, 10. Control. (In the figure, the salinity in (a) and (b) is 8，the salinity in (c) and (d) is 10，the salinity in (e) and (f) is 12.)

2.3.2 鹽度為10時6-DMAP誘導(dǎo)效果 鹽度為10時，“50 mg/L+50% PB1”組三倍體率最高(56.28%±2.13%)，與“50 mg/L+40% PB1”組(51.25%±4.50%)、“75 mg/L+40% PB1”組(52.55%±2.67%)差異不顯著，但顯著高于其他處理組(P<0.05)?！?0 mg/L+50% PB1”綜合評價指數(shù)最高(26.40%)(見圖3(c))。8日齡時,“50 mg/L+50% PB1”組三倍體率最高(50.33%±1.30%)，顯著高于其他處理組(P<0.05)?！?5 mg/L+50% PB1”組存活率最高(29.53%±3.45%)，與其他各組無顯著差異 (見圖3(d))。

2.3.3 鹽度為12時6-DMAP誘導(dǎo)效果 鹽度為12時，“50 mg/L+40%PB1”組三倍體率最高(74.34%±3.49%)，與“50 mg/L+50% PB1”組(68.90%±4.17%)差異不顯著， 但顯著高于其他處理組(P<0.05)?！?0 mg/L+50% PB1”組綜合評價指數(shù)最高，為36.18%(見圖3(e))。8日齡時“50 mg/L+40% PB1”組三倍體率最高(68.23%±2.52%)，與“50 mg/L+50% PB1”組(62.77%±6.04%)差異不顯著，但顯著高于其他處理組(P<0.05)?！?0 mg/L+40% PB1”組存活率最高(40.42%±4.30%)(見圖3(f))。因此，海水鹽度為12、6-DMAP濃度為50 mg/L、第一機(jī)體出現(xiàn)40%時開始處理是誘導(dǎo)三倍體的最佳條件。

2.3.4 三種方法對比結(jié)果 6-DMAP處理組中，通過75 mg/L的6-DMAP在40% PB1出現(xiàn)時開始處理綜合評價指數(shù)最高(36.52%)，略高于低滲處理組中最高值(34.33%,鹽度為8、40% PB1出現(xiàn)時)和配合組中最高值(36.18%，鹽度為12、6-DMAP濃度為50 mg/L、40% PB1出現(xiàn)時)。三種方法之間無明顯差異。通過進(jìn)一步比較3種方法的8日齡幼蟲三倍體率和存活率發(fā)現(xiàn)，配合組8日齡三倍體率和存活率最高(68.23%±2.52%，40.42%±4.30%)，遠(yuǎn)大于低滲處理組(50.65%±4.89%，21.17%±5.54%)和6-DMAP處理組(60.37%±0.61%，30.25%±2.85%)。因此，當(dāng)受精卵PB1出現(xiàn)40%時，相比低滲或6-DMAP單獨(dú)處理，配合使用鹽度12的海水和50 mg/L 6-DMAP處理受精卵來誘導(dǎo)三倍體，會使三倍體倍率更穩(wěn)定、幼蟲存活率更高，這是誘導(dǎo)三倍體的最佳處理組合。

3 討論

3.1 三種誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)三倍體的原理分析

6-DMAP是一種蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑，能夠抑制微管生長，阻止極體排除，且阻礙作用可逆，去除后允許細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育[22]。6-DMAP誘導(dǎo)多倍體效果穩(wěn)定，已在多種貝類中得以證實(shí)[17,23-24]。低滲誘導(dǎo)三倍體原理可能是低滲使受精卵受氧化脅迫而導(dǎo)致糖代謝或滲透調(diào)節(jié)受阻，因此發(fā)生了染色體異常分離[25]。而根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同等強(qiáng)度處理下，相比于低滲組和6-DMAP處理組，配合組的三倍體率和幼蟲成活率在8日齡時均有不同程度提升。說明通過合理調(diào)整6-DMAP濃度和海水鹽度，同時對受精卵施加物理處理和化學(xué)藥物處理兩方面的作用，同樣能夠起到提高三倍體率的效果，且比同等強(qiáng)度刺激下6-DMAP和低滲單獨(dú)作用效果更好。孔靜等發(fā)現(xiàn)受精卵卵徑隨著鹽度的降低逐漸增大[19]，在低滲條件下，一方面低滲處理本身能夠干擾受精卵的正常生理活動導(dǎo)致染色體異常分離，另一方面，低滲處理使得受精卵卵徑增大，導(dǎo)致受精卵與誘導(dǎo)劑相接觸的表面積增加，從而6-DMAP能夠更好地進(jìn)入受精卵內(nèi)部發(fā)揮作用。

3.2 三倍體率的影響因素

誘導(dǎo)劑類型、處理濃度、誘導(dǎo)時機(jī)及持續(xù)時間等因素都會影響三倍體誘導(dǎo)率[6,12,17]。Qin等[26]發(fā)現(xiàn)海水溫度會影響卵子生發(fā)泡破裂時間和極體排出時間，同時生發(fā)泡破裂比例也會影響極體排出時間，而極體排出比例正是誘導(dǎo)處理的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[27]。此外，水溫、卵子來源、不同繁育批次以及同一批次不同個體性腺成熟度也會有很大差異，這些均會造成卵子發(fā)育不同步，從而降低三倍體誘導(dǎo)率。因此，為提高三倍體誘導(dǎo)率，本研究中采用同批次繁育的長牡蠣“海大2號”群體作為親本，鏡檢并選擇性腺發(fā)育飽滿的個體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，受精前將卵子充分熟化至生發(fā)泡破裂，并控制水溫為(25.0±0.5) ℃，最大程度保證卵子發(fā)育的同步性。盡管如此，本實(shí)驗(yàn)通過低滲法誘導(dǎo)三倍體率最高僅為73.77%，與孔靜等相同誘導(dǎo)方法獲得的89.13%三倍體率仍有差異。除上述因素外，孵化時海水鹽度不同也可能是差異產(chǎn)生的原因[28]。

3.3 三倍體率與幼蟲成活率

在幼蟲培養(yǎng)階段，各處理組的幼蟲存活率和三倍體率均呈不斷下降的趨勢。6-DMAP和低滲環(huán)境阻礙了受精卵的正常生理發(fā)育過程[22,25]，這可能是導(dǎo)致培養(yǎng)期間幼蟲成活率和三倍體率降低的原因之一。同時，Nell等[29]通過6-DMAP誘導(dǎo)悉尼巖牡蠣(Saccostreacommercialis)三倍體時發(fā)現(xiàn)幼蟲群體中存在1%～11%的非整倍體。而非整倍體存活能力低，也會導(dǎo)致誘導(dǎo)群體存活率下降[30]。本研究表明，通過增大藥物濃度或降低海水鹽度來提高受精卵處理強(qiáng)度，有利于提高三倍體誘導(dǎo)率。然而，這不可避免地增加了對受精卵的損傷，導(dǎo)致卵裂率、孵化率和成活率下降。因此，需要探索一種在保證幼蟲成活率的前提下能夠最大限度地提高三倍體誘導(dǎo)率的方法。本研究發(fā)現(xiàn)6-DMAP和低滲配合比兩者單獨(dú)使用誘導(dǎo)效果更好、三倍體率更穩(wěn)定、幼蟲成活率更高且降低了誘導(dǎo)成本。這一研究結(jié)果為長牡蠣“海大2號”三倍體的培育提供了基礎(chǔ)資料。

4 結(jié)語

本研究在不同誘導(dǎo)時機(jī)和誘導(dǎo)強(qiáng)度下綜合比較了三種處理方式(低滲處理、6-DMAP處理以及6-DMAP和低滲配合處理)誘導(dǎo)長牡蠣“海大2號”三倍體的效果。通過分析綜合評價指數(shù)和8日齡幼蟲的三倍體率、存活率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)受精卵PB1出現(xiàn)40%時，相比低滲或6-DMAP單獨(dú)處理，配合使用鹽度12的海水和50 mg/L 6-DMAP處理受精卵來誘導(dǎo)三倍體，會使三倍體倍率更穩(wěn)定、幼蟲存活率更高，這是誘導(dǎo)長牡蠣“海大2號”三倍體的最佳處理組合。研究結(jié)果為長牡蠣“海大2號”三倍體的培育提供了基礎(chǔ)資料。