管曉偉， 王冬梅， 陳 睿， 曲偉華

(中國海洋大學海洋生命學院, 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室， 山東 青島 266003)

紫菜作為一種典型的紅藻品種，是世界上最重要的海藻經(jīng)濟作物之一，在東亞國家中被廣泛養(yǎng)殖[1]。條斑紫菜主要分布在潮間帶，由于潮汐作用和大風的影響，周期性地經(jīng)歷潮汐變化引起滲透壓、溫度和光照的脅迫[2-3]，這些脅迫通常會使條斑紫菜產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)。過量的活性氧，比如超氧陰離子(O2·—)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)，會導致膜損傷、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷，甚至導致無法修復的代謝功能障礙和細胞死亡，并對植物的生長產(chǎn)生不利影響[4]。植物體內(nèi)存在著活躍的酶促防御系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶(SOD)是最重要的酶，可以將有毒的超氧陰離子歧化為O2和H2O2，過氧化物酶和氧化物酶可以進一步催化H2O2變成H2O[5-6]。

SOD廣泛存在于真核與原核生物中，根據(jù)其活性中心結(jié)合的金屬輔因子，可分為4類：Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD[7]。Fe-SOD是最原始的SOD，與Mn-SOD有較高的同源性，存在于原生生物和少數(shù)植物的葉綠體中，而Mn-SOD分布在線粒體和細胞質(zhì)中；植物中，Cu/Zn-SOD主要定位在高等植物細胞質(zhì)和葉綠體；Ni-SOD發(fā)現(xiàn)較晚，目前僅在鏈霉菌和藍藻中發(fā)現(xiàn)，與其他蛋白的重復序列較少[8-11]。

在一些藻類受到脅迫時，SOD的活性將發(fā)生變化。赤潮異彎藻中SOD活性在響應紫外輻射增強時變化明顯；在重金屬脅迫下，巴夫藻中SOD活性增加[12]。在條斑紫菜赤腐病的免疫過程中SOD的表達量上調(diào)[13]。本文基于本實驗室前期獲得的條斑紫菜基因組數(shù)據(jù)庫，對條斑紫菜中SOD基因家族進行全基因組鑒定和分析，進一步研究SOD基因在溫度和失水脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達變化，并對表達豐度高的SOD基因進行qPCR驗證，為探究條斑紫菜SOD基因家族的生物學特性和抗逆特性提供了有價值的信息，同時為分子育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗室培養(yǎng)的純系條斑紫菜(Pyropiayezoensis)RZ。

1.2 方法

1.2.1 條斑紫菜中SOD基因的鑒定 從Pfam數(shù)據(jù)庫(https://pfam.xfam.org/)下載Cu/Zn-SOD(PF00080)和Fe-SOD(PF02777和PF00081)的隱馬爾可夫模型(Hindden Markov Model，HMM)[14]，通過hmmsearch在本實驗室建立的條斑紫菜基因組本地數(shù)據(jù)庫中檢索條斑紫菜中SOD蛋白序列(閾值E<1×10-20)；根據(jù)檢索到的SOD蛋白序列構建條斑紫菜特異性的HMM模型，利用該模型在數(shù)據(jù)庫中再次檢索并提取條斑紫菜SOD蛋白序列。將2次檢索到的蛋白序列合并，手動去除重復序列，并將這些序列上傳到NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，確認提取出的蛋白含有SOD結(jié)構域。使用SnapGene分析條斑紫菜SOD蛋白的等電點(pI)及分子量(Mw)，并通過在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT tool(https://wolfpsort.hgc.jp/)、CELLO v2.5 ( http://cello.life.nctu.edu.tw/ )和PredAlgo ( https://giavap-genomes.ibpc.fr/cgi-bin/predalgodb.perl?page=main )共同預測條斑紫菜中SOD基因的亞細胞定位。若在2種以上網(wǎng)站中顯示同一預測結(jié)果，則該結(jié)果為正確預測結(jié)果。

1.2.2 條斑紫菜SOD家族系統(tǒng)進化分析 系統(tǒng)進化分析中條斑紫菜(P.yezoensis)的相關序列來自本實驗室測序獲得的基因組，擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和大葉藻(Zosteramarina)的SOD相關序列來自文獻[15]。使用Mega7構建條斑紫菜和以上物種的SOD蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹，建樹方法為最大似然法，迭代1 000次。

1.2.3 條斑紫菜SOD蛋白結(jié)構分析 使用在線網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/index.html)對SOD蛋白保守結(jié)構域進行分析和預測，設置分布模型為anr、預測保守基序數(shù)量為10、最短motif設置為6 aa、最長motif設置為50 aa。根據(jù)條斑紫菜SOD家族成員的蛋白序列，通過在線網(wǎng)站Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對SOD蛋白的二級結(jié)構進行分析，并使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/ )預測SOD蛋白的三級結(jié)構。

1.2.4 染色體定位和基因復制分析 利用TBtools對基因家族成員進行染色體定位分析及可視化。為探究PySOD家族的基因復制情況，本研究進一步利用McScanX進行基因組復制事件分析，并利用DnaSP6計算Ka/Ks值。根據(jù)條斑紫菜SOD基因家族的基因組信息和轉(zhuǎn)錄組ID進行基因結(jié)構注釋，使用TBtools對條斑紫菜GFF注釋文件中獲得的SOD基因家族的基因位置信息進行分析，獲取基因內(nèi)含子-外顯子分布的信息。

1.2.5 條斑紫菜SOD基因啟動子區(qū)域順式作用元件預測 調(diào)取條斑紫菜中的SOD基因起始密碼子上游序列(2 000 bp)并上傳至PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測條斑紫菜啟動子區(qū)域的順式作用元件，并通過TBtools將預測結(jié)果可視化。

1.2.6 條斑紫菜SOD基因在環(huán)境脅迫下的表達模式分析 基于實驗室前期所獲得的條斑紫菜在溫度[16]和失水脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究條斑紫菜SOD基因在不同脅迫下的表達模式。使用BWKCloud平臺(http://www.biomarker.com.cn/biocloud)對不同溫度脅迫條件下SOD基因的log2(差異倍數(shù))值繪制熱圖(在不同脅迫條件下FPKM值均小于5的SOD基因不參與熱圖的繪制)，其中溫度脅迫和失水脅迫差異倍數(shù)是實驗組與對照組的比值，復水組的差異倍數(shù)是復水組同80%失水組的比值。

1.2.7 環(huán)境脅迫材料處理及定量驗證 其他培養(yǎng)條件不變，分別收集0、8、10和24 ℃條件下培養(yǎng)6 h的條斑紫菜葉狀體材料；在10 ℃培養(yǎng)箱中恒溫條件下，收集失水0%、30%、50%、80%和失水80%后復水30 min的條斑紫菜葉狀體材料。條斑紫菜的失水率按以下公式計算：

式中：WL為藻體失水率；FW為藻體鮮質(zhì)量；TW為失水后藻體質(zhì)量；DW為60 ℃下將新鮮藻體烘干至藻體質(zhì)量不再變化時測得的質(zhì)量[17]。

提取RNA后進行反轉(zhuǎn)錄，得到相關樣品的cDNA。選取條斑紫菜SOD家族中表達豐度較高的成員(PySOD4、PySOD7和PySOD8)驗證PySOD在不同環(huán)境脅迫下的表達模式。以10 ℃培養(yǎng)的未失水材料為對照組，溫度脅迫或失水脅迫的材料為實驗組，通過qPCR技術檢測目的基因在不同環(huán)境脅迫下的表達變化，引物序列如表1所示。選用PyUBC作為內(nèi)參基因，用△CT法計算目的基因在不同環(huán)境脅迫下的相對表達量[18]。

表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 條斑紫菜SOD基因家族成員的鑒定

通過HMM搜索，最終在條斑紫菜(P.yezoensis,Py)基因組中鑒定出12個SOD基因，依次命名為PySOD1～PySOD12(見表2)。這些基因的cDNA序列長度在294～1 132 bp之間，編碼的氨基酸長度在97～307 aa之間；所編碼的蛋白質(zhì)分子量為10.77～29.17 kDa，PI為3.53～11.87。根據(jù)不同網(wǎng)站的亞細胞定位預測結(jié)果， 有5個蛋白定位于葉綠體； 1個定位于線粒體；1個屬于分泌途徑；4個蛋白的定位在不同預測網(wǎng)站中未獲得一致結(jié)果。

表2 條斑紫菜SOD基因和所編碼蛋白的特征

2.2 條斑紫菜SOD家族系統(tǒng)進化分析

將條斑紫菜中的SOD蛋白質(zhì)序列與來自擬南芥(A.thaliana,At)、水稻(O.sativa,Os)和大葉藻(Z.marina,Zm)中的22條SOD蛋白序列一起進行進化分析，根據(jù)聚類結(jié)果可將其分為3類(見圖1)。PySOD1、PySOD2、PySOD3、PySOD5、PySOD7、PySOD8、PySOD9、PySOD12和其他物種中的Cu/Zn-SOD類蛋白聚在一起，并且具有Cu/Zn-SOD結(jié)構域，屬于條斑紫菜中的Cu/Zn-SOD；PySOD4、PySOD6、PySOD11和其他物種中的Mn-SOD類蛋白聚在一起，并且具有Fe-Mn SOD α-折疊結(jié)構域和碳端結(jié)構域，屬于條斑紫菜中的Mn-SOD；PySOD10和其他物種中的Fe-SOD類蛋白聚在一起，并且具有Fe-Mn SOD碳端結(jié)構域，屬于條斑紫菜中的Fe-SOD。

圖1 條斑紫菜SOD家族系統(tǒng)進化分析

2.3 條斑紫菜SOD蛋白結(jié)構預測

條斑紫菜保守基序分析顯示(見圖2)，Cu/Zn-SOD成員蛋白保守基序均包含motif1、motif2、motif3、motif9和motif10，這5個motif在Cu/Zn-SOD中高度保守。此外，除PySOD3和PySOD7外其他Cu/Zn-SOD中均含有motif8，保守性較高。Fe-SOD和Mn-SOD成員中，Mn-SOD成員中都存在motif4和9，F(xiàn)e-SOD成員PySOD10和Mn-SOD成員PySOD4、PySOD6都包含motif5。

圖2 條斑紫菜SOD家族保守基序分析

在對條斑紫菜SOD蛋白的二級結(jié)構預測中(見表3)，F(xiàn)e-SOD和Mn-SOD成員中α螺旋占比為44%～68%，而Cu/Zn-SOD成員中α螺旋占比均未超過13%；Fe和Mn-SOD成員中，除PySOD11中β折疊占比22%，其余成員占比均未超過10%；Cu/Zn-SOD成員中β折疊最低占比為16%。在對PySOD蛋白的三級結(jié)構預測中(見圖3)，PySOD1、PySOD2、PySOD3、PySOD7和PySOD8具有一個銅離子結(jié)合位點；PySOD4和PySOD6具有一個錳離子結(jié)合位點；PySOD5具有1個銅離子和1個鋅離子結(jié)合位點；PySOD9具有2個鋅離子結(jié)合位點；PySOD12具有一個鋅離子結(jié)合位點。

表3 條斑紫菜SOD蛋白二級結(jié)構預測

圖3 條斑紫菜SOD蛋白家族三級結(jié)構預測

2.4 條斑紫菜SOD基因染色體定位和基因復制分析

基因在染色體上的分布與其生物學功能有一定的相關性。染色體定位結(jié)果(見圖4)表明，PySOD4、PySOD7和PySOD12定位于條斑紫菜1號染色體；PySOD1、PySOD2、PySOD3、PySOD5、PySOD10和PySOD11定位于2號染色體；PySOD6、PySOD8和PySOD9定位在3號染色體?；驈椭品治鼋Y(jié)果表明，PySOD1和PySOD2是串聯(lián)重復基因，其非同義替換位點替換率Ka=0.069 2、同義替換位點替換率Ks=0.078 3，所以Ka/Ks=0.883 7，Ka/Ks<1。這表明PySOD1和PySOD2基因在進化中受純化選擇。如圖5所示，條斑紫菜SOD基因結(jié)構說明，Cu/Zn-SOD成員基因結(jié)構簡單，8個基因均無內(nèi)含子， Fe-SOD和Mn-SOD成員中，PySOD4、PySOD10和PySOD11具有3個外顯子和2個內(nèi)含子；PySOD6含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。

圖4 條斑紫菜SOD基因家族染色體定位

圖5 條斑紫菜SOD基因結(jié)構示意圖

2.5 條斑紫菜SOD基因順式作用元件分析

為進一步探索條斑紫菜中SOD基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，調(diào)取SOD基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp的序列來預測啟動子區(qū)域順式作用元件(見圖6)。條斑紫菜SOD基因家族成員有大量與激素響應相關的順式作用元件，包括脫落酸響應元件(ABRE)、生長素響應元件(TGA-box)、茉莉酸甲酯響應元件(CGTCA-motif)、赤霉素響應元件(GARE-motif)和水楊酸響應元件(TCA-element)；與逆境響應相關的順

式作用元件包括光響應元件(Sp1、G-box和ACE等)、MYBHv1 結(jié)合位點相關元件(CCAAT-box)、低溫響應元件(LTR)、干旱誘導作用相關元件(MBS)和缺氧性誘導作用相關元件(GC-motif)。此外，還有一些與生長發(fā)育相關的順式作用元件，包括玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)相關元件(O2-site)、分生組織表達相關元件(CAT-box)、胚乳表達相關元件(GCN4_motif)和分化相關元件(HD-Zip1)。

圖6 條斑紫菜SOD基因家族順式作用元件分布

2.6 條斑紫菜SOD基因在溫度脅迫下的表達模式分析

如圖7所示，在受到不同的脅迫時，PySOD會有不同的表達模式。在受到高溫脅迫時，PySOD4、PySOD5和PySOD9表達量上調(diào)，PySOD6和PySOD11表達量變化不大，其他3個PySOD表達量下調(diào)；受到0 ℃低溫脅迫時，PySOD7表達量上調(diào)，PySOD5和PySOD6表達量變化不大，其他5個PySOD表達下調(diào)；受到-8 ℃的低溫脅迫時，PySOD7表達量上調(diào)，PySOD5、PySOD8和PySOD9表達量變化不大，其他4個PySOD表達下調(diào)。在受到失水脅迫時，PySOD5、PySOD7和PySOD9在不同失水程度的條斑紫菜中表達量均上調(diào)；PySOD8在中、高度失水(失水50%、80%)時表達量上調(diào)；PySOD4在中度失水時表達下調(diào)，其他失水程度變化量不大；PySOD6在輕度失水(30%)時變化量不大，在中、高度失水時表達下調(diào)；PySOD10在不同失水程度時表達量變化均不大；PySOD11在不同失水程度的表達量均下調(diào)。條斑紫菜在失水80%后復水30 min時，PySOD5、PySOD6和PySOD11表達量變化不大，其他5個PySOD表達量下調(diào)，不存在表達量上調(diào)的PySOD，推測這可能與失水脅迫的解除相關。PySOD1、PySOD2、PySOD3和PySOD12在溫度和失水脅迫下FPKM值均小于5，不參與熱圖繪制。

(A：不同溫度脅迫；B：不同失水脅迫；C：失水80%后復水30 min。A: different temperature stresses; B:different dehydration stress; C: rehydrate for 30 min after 80% dehydration.)

本研究對表達豐度高的PySOD4、PySOD7和PySOD8采用qPCR方法，對其在溫度和失水脅迫下的轉(zhuǎn)錄動態(tài)進行驗證。結(jié)果顯示，這3個基因與本研究在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中觀察到的轉(zhuǎn)錄表達變化一致。PySOD4在24 ℃高溫脅迫時表達量極顯著上調(diào)，但在0 ℃和-8 ℃時表達量極顯著下調(diào)；在中度失水脅迫時，表達量極顯著下調(diào)，輕度和高度失水脅迫時表達量無顯著變化。PySOD7在24 ℃高溫脅迫時表達量極顯著下調(diào)，但在0 和-8 ℃時表達量極顯著上調(diào)，并且隨溫度降低，表達量增加；在不同程度的失水脅迫下，PySOD7的表達量隨失水程度的增加而增加，且表達量均呈極顯著上調(diào)。PySOD8在受到不同溫度脅迫時相對表達量均顯著下調(diào)；在受到輕度失水脅迫時，表達量變化無顯著差異，在失水50%時表達量極顯著上調(diào)，失水80%時表達量顯著上調(diào)。當條斑紫菜失水率達到80%后復水30 min，PySOD4表達量顯著下調(diào)，PySOD7和PySOD8表達量極顯著下調(diào)(見圖8)。

(：0.01

3 討論

許多研究表明，ROS對細胞有毒害作用，其濃度增加會引起DNA鏈斷裂、蛋白降解，并破壞細胞結(jié)構和功能[19]。生物在長期進化過程中形成了可以清除活性氧的酶類和非酶類物質(zhì)，以此完善抗氧化系統(tǒng)，使活性氧維持在較低水平，保障生物體正常生長代謝[20]。植物細胞中ROS的產(chǎn)生和清除是動態(tài)平衡的，但植物在受到高溫、鹽堿和重金屬等非生物脅迫時，細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的ROS[19]，而SOD酶是清除活性氧過程中第一個起作用的抗氧化酶[21]。

條斑紫菜作為一種潮間帶藻類，在生長過程中會受到很多脅迫，包括溫度或者失水脅迫。溫度脅迫會影響植物中的ROS平衡，在大葉藻中，溫度過高或過低都會引起H2O2的增加，從而導致膜脂過氧化[15]。本研究觀察到條斑紫菜受到溫度脅迫時會提高SOD基因的轉(zhuǎn)錄表達，其中在高溫脅迫下有3個SOD基因的轉(zhuǎn)錄呈現(xiàn)上調(diào)，低溫下有1個SOD基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄表達的SOD基因要多于低溫脅迫，這與在角叉菜中的研究一致[22]。在高溫脅迫下表達的PySOD包括Cu/Zn-SOD和Mn-SOD，低溫脅迫下只有Cu/Zn-SOD表達，不同脅迫條件下表達的SOD基因也不同，說明在不同的溫度脅迫條件下，PySOD響應調(diào)控的模式存在差異。

在低溫脅迫和失水脅迫下表達量上調(diào)的SOD都屬于Cu/Zn-SOD，條斑紫菜復水過程中所有的Cu/Zn-SOD表達下調(diào)，并且在高溫脅迫中表達量上調(diào)的3種SOD，也有2種屬于Cu/Zn-SOD。這些結(jié)果共同表明了，Cu/Zn-SOD在條斑紫菜的抗逆過程中發(fā)揮著更重要的作用。從內(nèi)含子數(shù)量上看，Cu/Zn-SOD不含內(nèi)含子，這很大程度上縮短了基因表達的過程，使條斑紫菜在面對脅迫時能快速表達SOD，減少脅迫帶來的損害。Cu/Zn-SOD的三級結(jié)構也為其快速響應脅迫提供便利，Cu/Zn-SOD二級結(jié)構以β折疊為主，其活性位點位于β折疊外，這與其疏水界面一同保障Cu/Zn-SOD結(jié)構穩(wěn)定性，從而可以快速進行催化功能[23]。

近期在玉米中發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會促使脫落酸積累；而茉莉酸甲酯處理可以明顯提高小麥幼苗細胞中的SOD酶活性[24-25]。在0和-8 ℃種低溫脅迫下均上調(diào)表達的PySOD7被預測到有5種順式作用元件，其中脫落酸和茉莉酸甲酯的響應元件可能在條斑紫菜低溫脅迫響應時發(fā)揮重要作用。PySOD5、PySOD8和PySOD10被預測到含有低溫響應的順式作用元件，但在0 和-8 ℃低溫脅迫過程中，這些基因表達量變化不大甚至下調(diào)。鑒于所使用的plantCARE是植物順式作用元件的預測網(wǎng)站，這暗示條斑紫菜和植物的低溫脅迫受到不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。PySOD4、PySOD5和PySOD9響應高溫脅迫表達，PySOD5和PySOD9的順式作用元件種類基本相同，并且在低溫脅迫下表達量變化不大，是響應高溫脅迫的主要的Cu/Zn-SOD。同樣，在失水條件下Cu/Zn-SOD表達量上調(diào)，其8種SOD基因順式作用元件類型基本相同，這可能是因為受相同的分子機制調(diào)控。PySOD4是本文設置脅迫環(huán)境下唯一上調(diào)表達的Mn-SOD(高溫脅迫下表達)，并且PySOD4表達量的差異倍數(shù)小于PySOD9，說明Mn-SOD和Fe-SOD也能夠響應環(huán)境脅迫，但不是主要發(fā)揮作用的SOD。

4 結(jié)語

本研究首次對條斑紫菜SOD基因家族進行生物信息學分析，解析了條斑紫菜SOD基因家族的組成、分類、基因結(jié)構蛋白結(jié)構和進化特點，并進一步探究了PySOD基因在溫度或失水脅迫下的表達變化，為進一步研究SOD基因潛在的生物學功能以及改良條斑紫菜育種提供了參考。