王亭亭，張雅昆，張洪艷，薛 站，霍曉敏，曾艷榮，譚承建*

黃花棘豆中1個(gè)新的喹諾里西啶生物堿

王亭亭1, 2，張雅昆1, 2，張洪艷1, 2，薛 站1, 2，霍曉敏1, 2，曾艷榮1，譚承建1*

1. 貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025 2. 貴州民族大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025

研究黃花棘豆的生物堿成分。采用硅膠、反相RP-18、Sephadex LH-20柱色譜、半制備高效液相色譜等分離方法對(duì)黃花棘豆生物堿進(jìn)行分離純化，通過(guò)波譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)算對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定；采用浸蟲(chóng)浸葉法對(duì)含量相對(duì)較大的化合物4、7進(jìn)行抗斜紋夜蛾殺蟲(chóng)試驗(yàn)，采用MTT法對(duì)化合物1進(jìn)行抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）活性試驗(yàn)。從黃花棘豆生物堿分離得到10個(gè)化合物，分別鑒定為黃花棘豆堿H（1）、sophoridine（2）、allomatrine（3）、isosophoridine（4）、sophoramine（5）、7α-hydroxysophoramine（6）、oxylupanine（7）、lehmannine（8）、flavesine G（9）、13β-hydroxymatrine（10），化合物4、7殺斜紋夜蛾的半數(shù)致死濃度（50% lethal concentration，LC50）分別為44.02、8.72 mg/mL。濃度為1×10?4mol/L時(shí)，化合物1對(duì)乙肝表面抗原分泌的抑制率為（33.87±3.20）%?；衔?為1個(gè)新的喹喏里西啶二聚體生物堿，化合物7～10為首次從黃花棘豆中分離得到。化合物7對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，化合物1表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗HBV生物活性。

黃花棘豆；斜紋夜蛾；抗乙型肝炎病毒；喹諾里西啶生物堿；黃花棘豆堿H；oxylupanine；lehmannine；flavesine G

黃花棘豆Bunge又稱(chēng)馬絆腸、醉馬草、團(tuán)巴草，是分布于我國(guó)西部草場(chǎng)的豆科棘豆屬多年生有毒植物[1]。黃花棘豆在青海與甘肅的面積多達(dá)1.899×106hm2，分別占毒雜草面積的71.81%和34.19%[2-4]。據(jù)《青藏高原甘南藏藥植物志》中記載，黃花棘豆全草味甘、微苦，性溫，可治腹水、止腸痛，其根味甘，性溫，可治慢性腎炎浮腫、久病衰弱、貧血等癥[5]。

黃花棘豆含有黃酮類(lèi)、三萜皂苷類(lèi)、生物堿類(lèi)等化學(xué)成分[6]，其中生物堿類(lèi)成分表現(xiàn)出抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和殺蟲(chóng)活性[7]。課題組前期從中發(fā)現(xiàn)了苦豆堿型、苦參堿型和金雀花堿型等生物堿成分。Ochrocephalamines C～D表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗HBV生物活性[8]，化合物ochrocephalamine A、sophoramine、5β,7β- sophoramine對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲(chóng)具有顯著的殺滅效果[9-10]。為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其潛在活性成分，為資源化利用提供依據(jù)，本研究繼續(xù)對(duì)黃花棘豆生物堿成分進(jìn)行研究，分離鑒定了10個(gè)化合物，分別為黃花棘豆堿H（ochrocephalamine H，1）、sophoridine （2）、allomatrine（3）、isosophoridine（4）、sophoramine （5）、7α-hydroxysophoramine（6）、oxylupanine（7）、lehmannine（8）、flavesine G（9）、13β-hydroxy matrine （10），其中化合物1為新的喹喏里西啶二聚體生物堿，化合物7～10為首次從黃花棘豆中分離得到?；衔?表現(xiàn)出明顯的抗HBV活性，化合物7具有較強(qiáng)的抗斜紋夜蛾活性。

1 材料與儀器

高效液相色譜儀UltiMate3000（賽默飛世爾科技有限公司）；XB bridge BEH C18色譜柱（美國(guó)Waters公司）；AV Neo-400 MHz型核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）；Agilent G6230飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Agilent公司）；UV-2700紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；Nicolet iS10 Thermo中紅外光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Jasco P-1020全自動(dòng)數(shù)字旋光儀（Jasco公司）；Applied Photophysics數(shù)字式圓二色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司，BUCHI Rotavapor R-3）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；ZF-6型三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；SephadexLH-20（Amersham Biosciences）；GF254薄層板、柱色譜硅膠（100～200、200～300、300～400目，青島海洋化工廠分廠）；LiChroprep RP-18（40～63 μm，EMD Millipore Corporation）；甲醇、二氯甲烷、丙酮、醋酸乙酯、石油醚（分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司）；甲醇（色譜級(jí)）、乙腈（色譜級(jí)）、碘化鉀、次硝酸鉍（瑞金特化學(xué)品有限公司）；濃鹽酸、氨水、冰醋酸（川東化工有限公司）；三氟乙酸（TFA，阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚山梨酯80（成都金山化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（安徽澤升科技有限公司）；氫氧化鈉（成都金山化學(xué)試劑有限公司）；Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；酶標(biāo)儀MD190（MD公司）；倒置相差顯微鏡Nikon TS2FL（Nikon公司）；生物凈化工作臺(tái)BCM-1000A（江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；胎血牛請(qǐng)（FBS，杭州四季青生物工程材料公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基（MEM）、噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司）；抗原檢測(cè)試劑盒（英科新創(chuàng)科技股份有限公司，乙肝表面抗原（HBsAg）批號(hào)2022045112；乙肝e抗原（HBeAg）批號(hào)2021065308）；金絲桃苷（上海詩(shī)丹得生物技術(shù)有限公司）。

黃花棘豆于2017年8月采自青海省湟中縣，由青海大學(xué)莫重輝教授鑒定為黃花棘豆Bunge，憑證標(biāo)本（ZhaoBy-201708）保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院有毒植物研究所。

2 提取與分離

黃花棘豆全草50 kg，粉碎后用95%乙醇熱回流提取，合并濾液，得粗浸膏5 kg。沸水捻溶后，用2 mol/L HCl調(diào)pH 1～3，等體積二氯甲烷萃取3次，酸水層用2 mol/L NaOH調(diào)pH 9～11，等體積二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷層，減壓濃縮，得總生物堿310 g。取210 g樣品用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，梯度洗脫（二氯甲烷-甲醇100∶1～甲醇），得到A1～A8。

A4（30.8 g）通過(guò)反相柱色譜（RP-18）（水-甲醇90∶1～甲醇）進(jìn)行分離，得到22個(gè)組分B1～B22。B17（198.3 mg）用SephadexLH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）進(jìn)行分離，得到C1～C6。C4用硅膠柱色譜進(jìn)行3次分離純化，二氯甲烷-甲醇（15∶1）、醋酸乙酯-甲醇（10∶1）、丙酮-甲醇（10∶1）洗脫，得到化合物6（5.9 mg）。C3用硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇20∶1）進(jìn)行分離得到化合物5（19.7 mg）和D5。D5用硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯-甲醇20∶20∶1）分離，得到化合物3（8.2 mg）和8（6.3 mg）。

A5（14.53 g）通過(guò)反相柱色譜（RP-18）（水-甲醇90∶1～甲醇）進(jìn)行分離，得到E1～E7。E4（1.2 g）用硅膠柱色譜法進(jìn)行分離（二氯甲烷-甲醇15∶1），得到F1～F8。F4用硅膠柱色譜法進(jìn)行純化（二氯甲烷-甲醇18∶1），得到化合物2（16.8 mg）。F6用硅膠柱色譜法進(jìn)行純化（二氯甲烷-甲醇10∶1），得到G1～G7。G5用半制備HPLC [水-甲醇-三氟乙酸（TFA）90∶10∶0.05，體積流量1 mL/min] 純化得到化合物10（15.2 mg），R＝12.620 min。G6（48.2 mg）用硅膠柱色譜（石油醚-丙酮-甲醇20∶20∶1體系中加入0.05%氨水），得到H3，繼續(xù)用半制備HPLC（水-乙腈-TFA 96∶4∶0.05，體積流量1.2 mL/min）純化得到化合物1（8.6 mg，R＝16.125 min）。

A7（7.66 g）用SephadexLH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）進(jìn)行分離，得到I1～I(xiàn)5。I2（4.21 g）用硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇10∶1、5∶1）進(jìn)行分離得到化合物4（0.76 g）和J5，J5用硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇25∶1，加入0.01%氨水）進(jìn)行分離，得到化合物7（246.23 mg）和K4。K4用硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇15∶1，加入0.05%氨水）進(jìn)行分離，得到化合物9（30.23 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

1H-NMR (400 MHz, CD3OD)（表1）譜圖中顯示2個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)H7.30 (1H, d,= 7.7 Hz), 6.30 (1H, d,= 7.5 Hz)；4個(gè)苦參堿型特征質(zhì)子信號(hào)H4.97 (1H, dd,= 13.8, 5.5 Hz), 3.29 (1H, t,= 13.6 Hz), 4.33 (1H, dd,= 12.6, 4.2 Hz), 3.10 (1H, t,= 12.4 Hz)。13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 譜圖中顯示30個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合DEPT譜圖發(fā)現(xiàn)化合物1中有4個(gè)季碳信號(hào)（包含2個(gè)酰胺羰基信號(hào)C163.2, 170.9），10個(gè)次甲基信號(hào)，16個(gè)亞甲基信號(hào)。信號(hào)C51.7 (C-2), 64.2 (C-6), 56.5 (C-10), 58.3 (C-2′), 65.4 (C-6′), 58.2 (C-10′) 分別與原子相連。核磁圖譜中呈現(xiàn)苦參堿的核磁信號(hào)C58.3 (C-2′), 22.5 (C-3′), 28.7 (C-4′), 37.3 (C-5′), 65.4 (C-6′), 42.6 (C-7′), 27.5 (C-8′), 21.8 (C-9′), 58.2 (C-10′), 53.6 (C-11′), 170.9 (C-15′), 43.6 (C-17′)，除了C-12′ (C29.8)、C-13′ (C30.2)、C-14′ (C37.5)，較苦參堿分別向低場(chǎng)位移了1.0、10.6、4.1。其他信號(hào)與7β-sophroamine[11]相似，除了C-13 (C135.9)、C-15 (C163.2)，較7β-sophroamine分別向高場(chǎng)位移了5.3、2.9，C-14 (C131.0) 向低場(chǎng)位移了14.6。以上數(shù)據(jù)表明該化合物可能是1個(gè)苦參堿與7β-sophroamine通過(guò)C-13′/C-14聚合而成的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

表1 化合物1的1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 和13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 數(shù)據(jù)

在HMBC譜圖（圖1）中，H-11與C-13和C-15相關(guān)，H-13與C-11、C-15、C-14和C-13相關(guān)，H-13與C-13′、C-15和C-11相關(guān)，H-12與C-14、C-13和C-11相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)化合物1的2個(gè)亞結(jié)構(gòu)通過(guò)C-13′/C-14相連接?；衔?的相對(duì)構(gòu)型通過(guò)與生源相關(guān)化合物ochrocephalamine A比較及ROESY實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。ROESY譜圖中，H-17′α與H-5′相關(guān)、H-5′分別與H-6′和H-7′相關(guān)，表明H-5′、H-6′和H-7′為α型。H-13′與H-5′相關(guān)，表明H-13′為α型，H-13′與H-14′ (H2.50) 相關(guān)，表明H-14 (H2.50) 為α型。H-17′β (H4.33) 與H-11′相關(guān)，說(shuō)明H-11′為β型。H-17α (H3.29) 與H-5、H-6相關(guān)，則H-5、H-6均為α型。ROESY圖譜中沒(méi)有觀察到H-7與H-6的相關(guān)。H-7位的β取向，通過(guò)與化合物7β- sophroamine的核磁數(shù)據(jù)對(duì)照來(lái)確定。綜上所述，化合物1相對(duì)構(gòu)型得以確定（圖1）。

化合物1的絕對(duì)構(gòu)型通過(guò)化學(xué)計(jì)算來(lái)確定。在分子力學(xué)力場(chǎng)（MMFF94）下進(jìn)行構(gòu)象搜索，在B3LYP/6-311＋G(d)水平下，使用密度泛函理論（DFT）優(yōu)化構(gòu)象，采用TDDFT方法對(duì)化合物1進(jìn)行ECD計(jì)算，ECD計(jì)算曲線與實(shí)驗(yàn)吻合（圖2），故化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定如圖1所示，經(jīng)檢索為1個(gè)新化合物，命名為黃花棘豆堿H（ochrocephalamine H）。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)及主要1H-1H COSY、HMBC和NOESY相關(guān)信號(hào)

圖2 化合物1的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算ECD譜圖

化合物2：無(wú)色透明針狀結(jié)晶（二氯甲烷-甲醇），ESI-MS/: 249 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 3.38～3.15 (3H, m, H-11, 17), 2.79 (2H, m, H-2a, 10a), 2.25 (3H, m, H-14, 6), 2.11 (2H, m, H-2b, 10b), 1.94 (2H, m, H-3a, 5), 1.86～0.99 (12H, m, H-3b, 4, 7, 8, 9, 12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 172.5 (C-15, s), 63.5 (C-6, d), 57.5 (C-2, t), 56.6 (C-11, d), 50.6 (C-10, t), 48.7 (C-17, t), 41.6 (C-7, d), 33.0 (C-14, t), 31.4 (C-5, d), 30.6 (C-12, t), 28.6 (C-4, t), 23.5 (C-3, t), 22.9 (C-8, t), 22.8 (C-9, t), 19.4 (C-13, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物2為sophoridine。

化合物3：淺黃色油狀物，ESI-MS/: 249 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 3.28～3.16 (3H, m, H-11, 17), 2.90～2.78 (2H, m, H-2a, 10a), 2.43～2.24 (3H, m, H-14, 6), 2.14 (2H, t,= 13.1 Hz, H-2b, 10b), 2.00～1.83 (2H, m, H-3a, 5), 1.83～1.41 (12H, m, H-3b, 4, 7～9, 12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 171.7 (C-15, s), 71.5 (C-6, d), 61.3 (C-11, d), 57.3 (C-2, t), 56.7 (C-10, t), 47.3 (C-17, t), 47.0 (C-7, d), 40.1 (C-5, d), 33.4 (C-14, t), 29.0 (C-12, t), 28.1 (C-4, t), 27.4 (C-3, t), 25.3 (C-8, t), 25.2 (C-9, t), 19.8 (C-13, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物3為allomatrine。

化合物4：無(wú)色透明片狀結(jié)晶（二氯甲烷-甲醇），ESI-MS/: 249 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 4.50 (1H, dd,= 11.8, 2.0 Hz, H-17a), 3.40 (2H, m, H-17b, 11), 3.20～3.00 (3H, m, H-14, 6), 2.91 (1H, dd,= 12.7, 2.4 Hz, H-2a), 2.66 (1H, dd,= 13.8, 3.3 Hz, H-10a), 2.25～2.14 (2H, m, H-2b, 10b), 2.14～2.00 (2H, m, H-3a, 5), 2.00～1.89 (2H, m, H-3b, 7), 1.88～1.03 (10H, m, H-4, 8, 9, 12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 172.6 (C-15, s), 63.3 (C-6, d), 60.4 (C-11, d), 53.7 (C-10, t), 46.3 (C-17, t), 46.2 (C-2, t), 35.6 (C-5, d), 35.4 (C-7, d), 33.3 (C-14, t), 27.1 (C-12, t), 25.9 (C-8, t), 23.9 (C-3, t), 21.5 (C-4, t), 19.4 (C-13, t), 19.1 (C-9, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物4為isosophoridine。

化合物5：白色結(jié)晶（二氯甲烷-甲醇），ESI-MS/: 245 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.54 (1H, dd,= 8.9, 7.3 Hz, H-13), 6.59 (1H, dd,= 7.4, 2.4 Hz, H-14), 6.48 (1H, dd,= 9.0, 2.4 Hz, H-12), 4.13 (1H, dd,= 7.2, 15.2 Hz, H-17a), 3.84 (1H, dd,= 15.2, 12.4 Hz, H-17b), 3.09 (1H, m, H-7), 2.81 (2H, m, H-2a, 10a), 2.50 (1H, m, H-2b), 2.38 (1H, t,= 6.5 Hz, H-10b),2.28～2.11 (2H, m, H-4), 2.03～1.74 (4H, m, H-5, 6, 8), 1.67～1.51 (4H, m, H-3, 9)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 57.7 (C-2, t), 21.3 (C-3, t), 27.7 (C-4, t), 32.8 (C-5, d), 61.5 (C-6, d), 39.5 (C-7, d), 28.7 (C-8, t), 22.2 (C-9, t), 57.5 (C-10, t), 150.1 (C-11, s), 106.6 (C-12, d), 141.1 (C-13, d), 116.4 (C14, d), 166.1 (C-15, s), 45.3 (C-17, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物5為sophoramine。

化合物6：黃色油狀物，ESI-MS/: 261 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.60 (1H, dd,= 7.3, 9.0 Hz, H-13), 6.76 (1H, dd,= 7.5, 1.2 Hz, H-12), 6.58 (1H, dd,= 8.9, 1.2 Hz, H-14), 4.62 (1H, s), 4.09 (1H, dd,= 15.4, 7.5 Hz, H-17β), 3.80 (1H, dd,= 15.4, 12.3 Hz, H-17α), 2.86 (2H, m, H-5, 10β), 2.77 (1H, m, H-8β), 2.69 (1H, m, H-2β), 2.18～2.06 (4H, m, H-6, 8α, 4), 1.96～1.65 (6H, m, H-2α, 10α, 3, 9)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 165.9 (C-15, s), 149.9 (C-l1, s), 141.2 (C-13, d), 118.4 (C-14, d), 106.7 (C-12, d), 70.1 (C-7, s), 67.8 (C-6, d), 57.5 (C-2, t), 57.2 (C-10, t), 45.3 (C-17, t), 37.5 (C-8, t), 27.5 (C-4, t), 26.6 (C-5, d), 23.2 (C-9, t), 21.0 (C-3, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物6為7α-hydroxysophoramine。

化合物7：黃色油狀物，ESI-MS/: 265 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 4.71 (1H, dd,= 13.7, 2.1 Hz, H-10a), 3.78 (1H, td,= 12.7, 3.5 Hz, H-17a), 3.50 (1H, m, H-15a), 3.35 (1H, m, H-15b), 3.16 (1H, m, H-17b), 3.09 (2H, dd,= 11.7, 4.3 Hz, H-10b), 2.86 (1H, m, H-11), 2.77 (1H, m, H-7), 2.49～2.27 (3H, m, H-3, 13a), 2.06～1.97 (1H, m, H-8a), 1.97～1.85 (1H, m, H-12a), 1.77～1.62 (3H, m, H-12b, 13b, 14a), 1.33～1.20 (2H, m, H-8b, 14b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 172.6 (C-2, s), 77.3 (C-11, d), 71.3 (C-15, t), 60.7 (C-6, d), 57.9 (C-17, t), 46.9 (C-10, t), 40.1 (C-7, d), 33.3 (C-3, t), 31.4 (C-8, t), 27.7 (C-9, d), 26.1 (C-12, t), 22.7 (C-14, t), 21.4 (C-5, t), 20.8 (C-13, t), 19.6 (C-4, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物7為oxylupanine。

化合物8：黃色油狀物，ESI-MS/: 247 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, C5D5N): 5.76～5.61 (2H, m, H-12, 13), 4.59 (1H, dd,= 12.4, 4.3 Hz, H-17β), 4.37 (1H, m, H-11β), 3.08 (1H, t,= 24.7 Hz, H-17α), 2.99 (2H, m, H-14), 2.62 (2H, m, H-2a, 10a), 1.83～1.66 (4H, m, H-2b, 10b, 5, 6)；13C-NMR (100 MHz, C5D5N): 165.7 (C-15, s), 124.0 (C-12, d), 122.6 (C-13, d), 63.6 (C-6, d), 57.2 (C-11, d), 57.0 (C-10, t), 54.6 (C-2, t), 44.4 (C-17, t), 41.6 (C-7, d), 40.0 (C-5, d), 32.0 (C-14, t), 27.8 (C-4, t), 26.7 (C-8, t), 21.2 (C-3, t), 20.9 (C-9, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物8為lehmannine。

化合物9：黃色油狀物，ESI-MS/: 261 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.64 (1H, s, H-17a), 3.51～3.42 (4H, m, H-2, 10), 2.81～2.70 (6H, m, H-4, 8, 12),2.24 (2H, t,= 7.2 Hz, H-14), 2.04～1.84 (8H, m, H-13, 3, 4, 9)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 181.3 (C-15, s), 153.6 (C-6, s), 150.0 (C-11, s), 135.6 (C-17, d), 116.7 (C-5, s), 115.2 (C-7, s), 51.2 (C-2, t), 50.6 (C-10, t), 37.9 (C-14, t), 31.3 (C-12, t), 26.4 (C-13, t), 25.1 (C-4, t), 23.2 (C-8, t), 20.9 (C-9, t), 20.7 (C-3, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物9為flavesine G。

化合物10：黃色油狀物，ESI-MS/: 265 [M＋H]+。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 4.34 (1H, dd,= 12.8, 4.4 Hz, H-17α), 4.04 (1H, td,= 10.3, 5.6 Hz, H-13), 3.13 (1H, t,= 12.7 Hz, H-17β), 2.88 (2H, t,= 15.6 Hz, H-10β, 2β), 2.56 (1H, dd,= 17.3, 3.7 Hz, H-14α), 2.40 (1H, dd,= 17.1, 5.8 Hz, H-14β), 2.26 (1H, s, H-6), 2.19 (1H, m, H-12β), 2.08 (2H, m, H-2α, 10β), 1.98 (1H, m, H-4β), 1.96 (1H, m, H-3β), 1.74 (2H, m, H-3α, 9α), 1.72～1.57 (5H, m, H-5, 12α, 7, 8), 1.50 (1H, m, H-9β), 1.49 (1H, m, H-4α)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.3 (C-15, s), 65.0 (C-6, d), 63.1 (C-13, d), 58.2 (C-2, t), 58.2 (C-10, t), 50.9 (C-11, d), 44.3 (C-7, d), 42.4 (C-17, t), 40.8 (C-14, t), 36.6 (C-5, d), 34.4 (C-12, t), 28.7 (C-4, t), 27.2 (C-8, t), 22.0 (C-3, t), 21.5 (C-9, t)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，故鑒定化合物10為13β-hydroxymatrine。

4 斜紋夜蛾幼蟲(chóng)殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)

采用浸蟲(chóng)浸葉的方法對(duì)含量相對(duì)較大的化合物4、7進(jìn)行殺蟲(chóng)活性測(cè)試。將化合物4配制成40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL，7配制成20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的溶液待用，溶劑為5%的聚山梨酯-80。將0.8 cm2的圓形菜葉在不同濃度待測(cè)液中浸泡20 s取出，置于培養(yǎng)皿中（每個(gè)培養(yǎng)皿中放置1張濾紙，防止?jié)穸冗^(guò)重），每個(gè)培養(yǎng)皿30片。取30只大小一致且健康的3齡斜紋夜蛾幼蟲(chóng)，在待測(cè)液中浸漬5 s取出放在培養(yǎng)皿中，用封口膜封口并扎孔通氣。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行，空白對(duì)照為5%的聚山梨酯-80溶液。統(tǒng)計(jì)24、48、72 h幼蟲(chóng)的死亡只數(shù)，通過(guò)SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，化合物4、7的半數(shù)致死濃度（50% lethal concentration，LC50）值分別為44.02、8.72 mg/mL。

5 抗HBV活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法測(cè)定化合物1抗HBV活性，準(zhǔn)確稱(chēng)取化合物1，用DMSO溶液分別配制成濃度分別為1×10?4、1×10?5、1×10?6mol/L的待測(cè)液。人肝癌HepG2.2.15細(xì)胞以每孔2×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL置恒溫箱中培養(yǎng)24 h。棄去上清液后，分別加入60 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL的待測(cè)液，以金絲桃苷為陽(yáng)性對(duì)照。培養(yǎng)72 h后重復(fù)之前操作步驟再培養(yǎng)48 h，測(cè)定吸光度（）值，檢測(cè)HBsAg和HBeAg分泌情況。結(jié)果顯示，化合物1濃度為1×10?4mol/L時(shí)對(duì)HBsAg和HBeAg的分泌抑制率分別為（33.87±3.20）%、（5.00±6.40）%，與陽(yáng)性對(duì)照金絲桃苷的抑制能力相近，且對(duì)HBsAg分泌的抑制作用強(qiáng)于HBeAg（表2）。

表2 化合物1對(duì)細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用

6 討論

從黃花棘豆總生物堿中得到10個(gè)化合物，化合物1為苦參堿與7β-sophroamine通過(guò)C-13′/C-14聚合而成的新化合物，化合物7～10首次從黃花棘豆中分離得到?；衔?和7表現(xiàn)出抗斜紋夜蛾生物活性，其LC50分別為44.02、8.72 mg/mL。濃度為1×10?4mol/L時(shí)，化合物1對(duì)HBsAg分泌的抑制率為（33.87±3.20）%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗HBV生物活性。

以苦參堿、槐胺堿、槐定堿等為主的喹諾里西啶生物堿具有豐富的藥理活性，在抗HBV及抗癌中有廣泛的應(yīng)用[20]。有研究者發(fā)現(xiàn)苦參堿C-13或C-14位強(qiáng)吸電子基取代可增強(qiáng)其抗HBV活性，且安全性較高[21]。富含苦參堿、槐胺堿的苦參是我國(guó)常用藥用植物。本課題組前期從黃花棘豆中分離得到大量苦參堿、槐胺堿等化合物[22]，該研究在一定程度上拓展了上述生物堿的來(lái)源。同時(shí)，黃花棘豆也是我國(guó)青藏、新疆等西部地區(qū)的常用民間藥材?！肚嗪Ｖ嗅t(yī)單驗(yàn)方選》中記載，黃花棘豆花或根煎湯涼服可治水腫跟脾臟病[23]。本次從黃花棘豆中分離鑒定出喹諾里西啶生物堿，并表現(xiàn)出一定的抗HBV生物活性，該研究能為黃花棘豆的臨床應(yīng)用及資源化利提供依據(jù)，也能夠一定程度緩解作為毒害草的黃花棘豆給草原經(jīng)濟(jì)帶來(lái)的損失。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 趙延濤, 萬(wàn)學(xué)攀, 樊月圓, 等. 黃花棘豆生物堿薄層層析分析 [J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2006(3): 51-53.

[2] 趙寶玉. 瘋草(甘肅棘豆)生物堿系統(tǒng)分析及其毒性的比較病理學(xué)研究 [D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2001.

[3] 鄧建梅. 天祝天然草地主要有毒植物資源調(diào)查及黃花棘豆化感作用研究 [D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[4] 李明源, 王繼蓮, 姚拓, 等. 祁連山高寒草地扁蓿豆和黃花棘豆耐冷PGPB的篩選及促生特性研究 [J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2021, 29(11): 2074-2086.

[5] 杜品. 青藏高原甘南藏藥植物志 [M]. 蘭州: 甘肅科學(xué)技術(shù)出版社, 2006, 248.

[6] 徐超, 劉斌, 石任兵. 棘豆屬植物化學(xué)成分與藥理作用 [J]. 國(guó)外醫(yī)藥: 植物藥分冊(cè), 2008, 23(1): 1-7.

[7] Wang L S, You Y J, Wang S Q,. Synthesis, characterization andanti-tumor activities of matrine derivatives [J]., 2012, 22(12): 4100-4102.

[8] Zhou K S, Yi P, Yang T,. Ochrocephalamines B—D, three alkaloids fromBunge [J]., 2019, 21(13): 5051-5054.

[9] Liu L N, Ran J Q, Li L J,. Ochrocephalamine A, a new quinolizidine alkaloid fromBunge [J]., 2016, 57(46): 5047-5049.

[10] 薛站. 黃花棘豆生物堿成分及其生物活性研究 [D]. 貴陽(yáng): 貴州民族大學(xué), 2022.

[11] He L J, Liu J S, Luo D,. Quinolizidine alkaloids fromand their anti-inflammatory activities [J]., 2019, 139: 104391.

[12] Galasso V, Asaro F, Berti F,. On the molecular and electronic structure of matrine-type alkaloids [J]., 2006, 330(3): 457-468.

[13] Ibragimov B T, Tishchenko G N, Talipov S A,. Structure of isosophoridine [J]., 1981, 17(4): 340-344.

[14] Ueno A, Morinaga K, Fukushima S,. Studies on the lupin alkaloids. VII. isolation and structure of (-)-.DELTA.7-dehydrosophoramine [J]., 1978, 26(6): 1832-1836.

[15] Choudhary M I, Parvez K,. Quinolizidine alkaloids from[J]., 2000, 63(2): 190-192.

[16] Zhang S Y, Li W, Nie H,. Five new alkaloids from the roots of[J]., 2018, 15(3): e1700577.

[17] 劉斌, 李金亮, 元英進(jìn). 苦豆子種子中生物堿的分離及l(fā)ehmannine的結(jié)構(gòu)確定 [J]. 中草藥, 2001, 32(4): 293-296.

[18] Zhang Y B, Luo D, Yang L,. Matrine-type alkaloids from the roots ofand their antiviral activities against the hepatitis B virus [J]., 2018, 81(10): 2259-2265.

[19] Tang Q, Luo D, Lin D C,. Five matrine-type alkaloids from[J]., 2021, 75(3): 682-687.

[20] Tan C J, Zhao Y, Goto M,. Alkaloids fromand antiproliferative activity of sophoridine derivatives against cancer cell lines [J]., 2016, 26: 1495-1497.

[21] Gao L M, Han Y X, Wang Y P, et al. Design and synthesis of oxymatrine analogues overcoming drug resistance in hepatitis B virus through targeting host heat stress cognate 70 [J]., 2011, 54: 869-876

[22] 薛站, 霍曉敏, 張雅昆, 等. 黃花棘豆生物堿成分及其抗斜紋夜蛾活性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2022, 50(19): 110-116.

[23] 鄒寒雁. 青海中醫(yī)單驗(yàn)方選[M]. 西寧: 青海人民出版社, 1991: 155-156.

A new quinolizidine alkaloid from

WANG Ting-ting1, 2, ZHANG Ya-kun1, 2, ZHANG Hong-yan1, 2, XUE Zhan1, 2, HUO Xiao-min1, 2, ZENG Yan-rong1, TAN Cheng-jian1

1. College of Ethnic Medicine, Guizhou Minzu University, Guiyang 550025, China 2. College of Chemical Engineering, Guizhou Minzu University, Guiyang 550025, China

To study the alkaloids from.The compounds were isolated and purified by silica gel column, reverse-phase column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatography and semi-preparative-HPLC, and the chemical structures were identified by extensive spectroscopic analysis and electronic circular dichroism (ECD) calculations. The activities againstof compounds 4 and 7 were evaluated on the insect-dipping and leaf-dipping method and the activities against HBV of compound 1 were evaluated by the MTT method.Ten alkaloids were obtianed and identified as ochrocephalamine H (1), sophoridine (2), allomatrine (3), isosophoridine (4), sophoramine (5), 7-hydroxysophoramine (6), oxylupanine (7), lehmannine (8), flavesine G (9) and 13β-hydroxymatrine (10), respectively. Compounds 4 and 7 indicated bioactivities against Spodoptera litura with LC50of 44.02 and 8.72 mg/mL. When the concentration was 1×10?4mol/L, the inhibition rates of compound 1 on HBsAg secretion were (33.87±3.20)%.Ochrocephalamine H (1) is a new quinolizidine dimeric alkaliod, while compounds 7—10 were obtained fromfor the first time. Compound 7 showed significant insecticidal activity against the third-instar larvae of. Compound 1 showed strong anti-HBV biological activity.

Bunge;;HBV; quinolizidine alkaloid; ochrocephalamine H; oxylupanine; lehmannine; flavesine G

R284.1

A

0253 - 2670(2023)04 - 1026 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.002

2022-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32160110）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660103）

王亭亭（1996—），女，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物提取與分離。E-mail: 1719982992@qq.com

譚承建，男，博士，教授，從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail: tcj1229@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]