劉朝波，聞偉鍔，李肇高，羅婷婷，徐德林，錢 剛*，何芋岐，李 林*

不同產地鐵皮石斛莖中內生真菌群落結構與農藝性狀差異相關性分析

劉朝波1，聞偉鍔1，李肇高1，羅婷婷1，徐德林1，錢 剛1*，何芋岐2，李 林1*

1. 遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，貴州 遵義 563099 2. 遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州 遵義 563099

對不同產地鐵皮石斛莖中的內生真菌群落與農藝性狀進行分析，為內生真菌與鐵皮石斛差異農藝性狀形成的相關性研究提供基礎。對采自安徽霍山（AHHS）、貴州獨山（GZDS）、云南孟連（YNML）的112份鐵皮石斛進行農藝性狀測量，ITS測序分析內生真菌群落結構，R語言分析不同產地內生真菌豐度與宿主農藝性狀的相關性。差異性分析發(fā)現(xiàn)3個產地的鐵皮石斛在株高、莖長、莖粗均具有顯著性差異（＜0.05）。內生真菌ITS檢測共獲得923條特征序列，可注釋到3個門、138個屬，產地間的鐵皮石斛內生真菌在屬水平上存在差異，其中AHHS的真菌群落多樣性與其他產地具有顯著性差異。相關分析表明，內生真菌與宿主的株高、莖長、莖粗呈顯著負相關（＜0.05）。不同產地鐵皮石斛莖的差異農藝性狀形成與共有內生真菌的豐度的改變密切相關。

鐵皮石斛；內生真菌；ITS測序；多樣性分析；農藝性狀；相關性分析

鐵皮石斛Kimura et Migo是重要的蘭科石斛屬藥用植物，具有養(yǎng)胃生津、滋陰清熱的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，鐵皮石斛具有抗氧化、抗癌、降血糖等多種藥理作用，受到市場廣泛關注[2]。由于自然環(huán)境下繁殖率較低，加上民間過度采挖，鐵皮石斛野生資源已近枯竭，利用人工種植方式生產成為當前解決鐵皮石斛供需矛盾的重要方式[3-4]。受種植方式、光照、微生物等因素的影響，不同產地人工種植鐵皮石斛在有效藥用成分含量、農藝性狀、生物量等方面差異較大[5]。

已有研究表明，內生真菌是影響植物生長發(fā)育、次生代謝產物積累的重要生物因子，與植物的根系發(fā)育、植株形態(tài)建成等具有密切關系[6-7]。Waqas等[8]從大田種植黃瓜根中分離得到2株能分泌赤霉素（gibberellins）和吲哚乙酸（indoleacetic acid）的內生真菌（LWL2、sp. LWL3），與黃瓜植株共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)內生真菌處理組的植株莖長顯著高于未處理組。Qin等[9]將植物內生真菌與植物共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在提供有機氮源的條件下，多數(shù)內生真菌能將有機氮轉化為無機氮，從而促進植物生長，提高植物株高。任穎[10]發(fā)現(xiàn)內生真菌定殖后可增加黃芪葉片數(shù)、株高、地下干質量，有利于黃芪抗旱能力提高。因此，內生真菌與植物的農藝性狀改變具有密切的關系，同時在以株高、莖長等農藝性狀為產量指標的藥用植物研究中具有重要的意義。

對玄參[11]、杜仲[12]等多種藥用植物研究發(fā)現(xiàn)，內生真菌廣泛的存在于藥用植物各組織器官中，且同種植物不同產地的內生真菌的種群結構組成、相對豐度及優(yōu)勢類群均存在差異。內生真菌的種群結構組成與宿主對不同環(huán)境的適應等密切相關[13]，其核心菌群、豐度變化也被證實與不同產地間藥用植物次生代謝產物含量差異積累、道地性形成等密切相關[14]。但這些真菌的群落結構、豐度變化與相關農藝性狀的變化的關系鮮有報道。

目前所研究的內生真菌主要為可培養(yǎng)內生真菌，但是宿主中可分離培養(yǎng)的內生真菌數(shù)量極少，導致多數(shù)內生真菌功能未被發(fā)掘。然而高通量測序技術具有準確、高效等優(yōu)點，不依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，成為植物內生真菌分析重要技術手段[15-16]。本研究以安徽霍山（AHHS）、貴州獨山（GZDS）、云南孟連（YNML）產地人工種植鐵皮石斛為材料，通過ITS測序對3個產地鐵皮石斛莖中內生真菌生物多樣性進行分析，并對不同產地鐵皮石斛之間差異內生真菌與差異農藝性狀進行相關性分析，篩選影響鐵皮石斛生物產量的內生真菌，為鐵皮石斛高效生產等提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

本研究從AHHS、GZDS、YNML 3個鐵皮石斛產地共采集112叢人工種植的鐵皮石斛進行農藝性狀分析，進一步從每個產地中分別選擇9個有典型特征的樣本的2年生新鮮莖條經表面消毒后用于鐵皮石斛內生真菌的ITS測序，所有材料均由遵義醫(yī)科大學細胞生物學教研室錢剛教授鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛Kimura et Migo。

1.2 試劑與儀器

用E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒（批號D5625-02，美國Omega公司）進行石斛莖條內DNA的提??；用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒（批號AP-PCR-4G，英國Axygen公司）來回收目的片段；ITS的測序在Illumina NovaSeq高通量測序平臺（杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司）進行。

2 方法

2.1 鐵皮石斛株高、莖長和莖粗測量及差異性分析

利用直尺共測量112叢（GZDS、AHHS、YNML分別為34、25、53叢）鐵皮石斛的株高，并從每叢鐵皮石斛中隨機選取3根莖測量莖長、莖粗。對莖長和莖粗平均值以及株高進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性檢驗后利用R語言中bartlett. test函數(shù)進行方差齊檢驗，不符合正態(tài)性檢驗應用R語言coin包中kruskal. test函數(shù)進行多樣本秩和檢驗，＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義，方差齊后應用R語言中aov函數(shù)進行方差分析，方差不齊時應用R語言中利用oneway test進行方差分析（＜0.05具有統(tǒng)計學差異）。

2.2 內生真菌DNA的提取

按照E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒說明書對次氯酸鈉法消毒滅菌后的鐵皮石斛莖提取內生真菌DNA。提取得到的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。

2.3 DNA的測序

使用引物ITS1 FI2（5’-GTGARTCAT- CGAATCTTTG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATT- GATATGC-3’）對真菌（ITS2）可變區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒對目標片段進行回收。純化后的PCR產物采用Quant-iT PicoGreen ds DNA Assay Kit在Qubit（美國Invitrogen公司）熒光定量系統(tǒng)上對文庫進行定量。根據測序所需要求制備合格的文庫，使用NovaSeq測序儀進行2×250 bp的雙端測序。

2.4 測序數(shù)據注釋與分析

根據雙端序列的重疊區(qū)，采用Pear將R1、R2序列拼接成長的tag序列，并使用cutadapter去除barcode以及引物序列，然后Fqtrim（v0.94）過濾低質量序列，采用Vsearch（v2.3.4）過濾嵌合體，通過區(qū)分擴增子降噪算法（divisive amplicon denoising algorithm 2，DADA2）去重復后得到特征表和特征序列。物種注釋采用QIIME2的插件feature-classifier進行序列比對，比對數(shù)據庫為SILVA和unite數(shù)據庫，以SILVA數(shù)據庫注釋結果為準。使用QIIME2流程進行α多樣性分析，用R（v3.5.2）對測得數(shù)據進行統(tǒng)計分析及作圖。α多樣性分析利用Anova法進行整體差異分析、利用Wilcox Test法對不同產地鐵皮石斛莖的內生真菌群落物種多樣性指數(shù)之間的差異性進行研究。

2.5 內生真菌與鐵皮石斛形態(tài)特征相關性分析

對27個ITS測序的鐵皮石斛的株高、莖長和莖粗數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，方法同“2.1”項。應用R語言kruskal. test函數(shù)對不同產地ITS測序數(shù)據注解到的共有內生真菌進行多重比較，F(xiàn)SA包中的dunnTest函數(shù)對多重比較結果-value進行矯正，共有內生真菌為不同產地2/3以上樣本能檢測到的內生真菌。另外，應用R語言PerformanceAnalytics包（R version 3.6.1）將具有統(tǒng)計學差異的農藝性狀與不同產區(qū)共有差異內生真菌做相關性分析，相關性計算采用spearman方法。

3 結果與分析

3.1 鐵皮石斛農藝性狀測量及差異性分析結果

對3個產地共112份材鐵皮石斛石斛的株高、莖長和莖粗進行測量，分析不同產地間這些農藝性狀指標的差異性，結果如圖1所示。3個產地中，YNML鐵皮石斛的株高（18.3～49.2 cm）和莖長（18.73～61.00 cm）顯著高于其他2個產地（＜0.05），其他2個產地之間株高、莖長差異沒有統(tǒng)計學差異。此外，AHHS鐵皮石斛的莖粗（4.04～7.40 mm）顯著低于其他2個產地，具有統(tǒng)計學意義（＜0.05），而其他2個產地之間莖粗沒有統(tǒng)計學意義。

圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，相同字母表示不顯著

3.2 鐵皮石斛莖中內生真菌群落結構組成分析結果

對27個樣品中測序獲得的原始數(shù)據質控、過濾和拼接后共得到2 235 602條有效序列，平均每個樣品產生82 800條有效序列，90.41%的有效序列在200～300 bp，且序列的有效率均在90%以上。各樣品的測序質量結果如表1所示，說明該次測序結果具有較高的可信度。

表1 測序數(shù)據質量評估

按產地將測序數(shù)據注解的內生真菌進行組成分析發(fā)現(xiàn)，3個產地的鐵皮石斛內生菌可注釋為子囊菌門（Ascomycota，92.57%）、擔子菌門（Basidiomycota，6.30%）、子囊菌類門（Asmycota，1.00%）組成（圖2-A），其中子囊菌類門（Asmycota）僅存在于AHHS產地樣品中。

圖2 內生真菌在門(A)、屬(B) 水平的組成

進一步分析發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛內生真菌分布于138個屬，其中AHHS分布94屬，GZDS分布65屬，YNML分布35屬。內生真菌屬的豐度在不同產地間具有差異，對相對百分數(shù)前20屬進行分析（圖2-B），結果顯示AHHS產地豐度最高的為石座菌屬Malloch & Cain（15.45%），GZDS產地豐度最高的為小戴衛(wèi)霉屬Crous & U. Braun（14.99%），YNML產地豐度最高的為小戴衛(wèi)霉屬（33.76%）。對共有菌屬進行分析發(fā)現(xiàn)，根堅囊菌屬D.F. Farr（12.16%）、鏈格孢屬Nees（4.9%）、石座菌屬（15.45%）在AHHS產地中的豐度遠高于其它2個產地；不整小球殼屬Kleb.（8.86%）、黑團孢屬Tode（15.23%）在GZDS產地中豐度明顯高于其他2個產地；枝頂孢屬Link（9.40%）在YNML產地中豐度明顯高于其他2個產地。此外，接柄孢屬Mont.（3.06%）、毛殼菌屬Kunze（4.30%）為GZDS產地的特有屬內生真菌。

3.3 內生真菌群落多樣性分析結果

使用QIIME2流程對樣品中內生真菌的α多樣性指數(shù)進行分析，用箱線圖來展示不同產地鐵皮石斛莖中內生真菌的觀察特征值和香農指數(shù)。從觀察特征值圖中（圖3-A）可以看出，3個不同產地的內生真菌群落豐度存在差異，觀察特征值表明，3個產地features豐度從高到低依次為AHHS、GZDS、YNML；從香農指數(shù)箱式圖（圖3-B）中可以看出，AHHS的內生真菌多樣性明顯大于其他產地，其次為GZDS、YNML，其中AHHS與GZDS 2個產地的內生真菌多樣性具有顯著性差異（＜0.05），AHHS與YNML 2個樣本組的內生真菌多樣性具有顯著性差異（＜0.05），GZDS與YNML 2個產地的內生真菌多樣性沒有明顯的差異。

*表示在0.05水平差異顯著

3.4 內生真菌與鐵皮石斛農藝性狀相關性分析

為了進一步探索鐵皮石斛形態(tài)差異形成與差異內生真菌的關系，首先應用R語言將ITS測序樣本鐵皮石斛形態(tài)特征（株高、莖長、莖粗）進行差異性分析，發(fā)現(xiàn)不同產地的27叢材料的農藝性狀差異顯著性與總體樣本的結果一致（表2）。

對不同產地鐵皮石斛共有內生真菌組成進行分析，篩選出相對豐度排名前20且3個產地均有2/3以上樣本都能檢測出的內生真菌屬進行多重比較，結果發(fā)現(xiàn)獲得的5個共有屬中僅赤霉菌屬（Sacc.）在AHHS和YNML產地間具有顯著差異（表3）。而AHHS和YNML產地的鐵皮石斛在株高、莖長、莖粗農藝性狀上均具有顯著性水平差異（表2）。將赤霉菌屬與鐵皮石斛株高、莖長、莖粗進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)赤霉菌屬的豐度與宿主的株高、莖長和莖粗具有顯著相關性（＜0.05），呈負相關（圖4-A）。尖孢鐮刀菌和為赤霉菌屬中的2個種，進一步將尖孢鐮刀菌和與宿主農藝性狀作相關性分析，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌與宿主的株高、莖長和莖粗具有顯著相關性（＜0.05），呈負相關；而菌僅與宿主的株高和莖長具有顯著相關性（＜0.05），呈負相關（圖4-B）。

表2 鐵皮石斛農藝性狀差異分析(, n = 9)

同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，相同字母表示不顯著

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, while the same letters indicate no significant difference

表3 共有內生真菌的差異性分析

Table 3 Difference analysis of common endophytic fungi

unadj為未矯正值；adj為矯正后-value；表中*表示在0.05水平差異顯著

unadj is uncorrected-value;adj is the corrected-value;*in the table indicates significant difference at the 0.05 level

*P＜0.05 **P＜0.001 ***P＜0.0001

4 討論

本研究分析了不同產地人工種植鐵皮石斛株高、莖長和莖粗的生長狀況，比較了不同產地間人工種植鐵皮石斛3種農藝性狀的差異，并對內生真菌與農藝性狀進行相關性分析，明確了不同產地之間鐵皮石斛主要農藝性狀的差異以及莖中內生真菌的結構組成，初步探索了內生真菌與宿主農藝性狀差異產生的相關性。本研究表明，不同產地間人工種植鐵皮石斛株高、莖長和莖粗表現(xiàn)出顯著差異，且與產地間共有內生真菌赤霉菌屬豐度呈負相關。

通過比較不同產地藥用植物內生真菌結構，發(fā)現(xiàn)不同產地間內生真菌的種屬組成不同、優(yōu)勢屬不同。從門的水平上來看，不同地區(qū)的鐵皮石斛內生真菌被注釋到子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、子囊菌類門（Asmycota）。所有的樣本中超過99%的內生真菌在門水平獲得注釋，說明本次注釋具有很高的覆蓋率。其中Ascomycota為相對豐度最高的門，依次為擔子菌門和子囊菌門，這與毛益婷等[17]的研究結果相似，但在他們的研究中并未發(fā)現(xiàn)子囊類菌門。從屬的水平上來說，在不同樣本組中均存在明顯的優(yōu)勢屬，石座菌屬為AHHS產地的優(yōu)勢屬內生真菌，小戴維斯殼屬為GZDS產地中內生真菌優(yōu)勢屬，小戴維斯殼屬為YNML樣本組中內生真菌優(yōu)勢屬。3個產地的研究結果均與陳澤斌等[18]認為構巢裸殼孢菌為鐵皮石斛葉中內生真菌的優(yōu)勢真菌群的研究結果不同，這可能因為樣本為不同組織或者不同生存環(huán)境有關。

對人參[19]、黃芪[20]等植物內生真菌群落結構及多樣性分析表明赤霉菌屬真菌的宿主較為廣泛，其在植物中能引起宿主發(fā)病，如小麥赤霉病[21]、玉米穗腐病[22]和水稻惡苗病[23]等。本研究中，在3個產地鐵皮石斛莖中屬水平均檢測到赤霉菌屬真菌，在種水平被注釋為尖孢鐮刀菌和。其中尖孢鐮刀菌菌株被證實對苜蓿幼苗根部病害的嚴重程度和生長有顯著影響，尤其對苜蓿株高以及根系的影響較顯著（＜0.05）[24]；而未有相關報道。在本課題組的研究中發(fā)現(xiàn)AHHS與YNML鐵皮石斛株高、莖長和莖粗具有差異，其中這些莖的農藝性狀與共有內生菌赤霉菌屬具有顯著負相關性，進一步對注釋為赤霉菌屬的尖孢鐮刀菌和的2個種與宿主的農藝性狀做相關性分析表明不同產地鐵皮石斛農藝性狀差異受尖孢鐮刀菌和豐度的影響，從而引起AHHS與YNML產地鐵皮石斛農藝性狀差異。

綜合以上分析看出，赤霉菌屬內生真菌與植物農藝性狀形成有密切關系，豐度越高影響越顯著。此結果為當前人工種植鐵皮石斛赤霉菌屬病原菌生物防治具有重要指導意義，為提高人工種植鐵皮石斛品質做出貢獻。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Correlation analysis between endophytic fungal and agronomic traits infrom different habitats

LIU Chao-bo1, WEN Wei-e1, LI Zhao-gao1, LUO Ting-ting1, XU De-lin1, QIAN Gang1, HE Yu-qi2, LI Lin1

1. Department of Cell Biology, School of Preclincal Medicine, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China. 2. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563099, China

To analyze the endophytic fungal communities and agronomic characters ofstems collected from different habitats, in order to provide the basis for the correlation studies between endophytic fungi and formation of variations agronomic traits of.A total of 112samples were respectively collected from Anhui Huoshan (AHHS), Guizhou Dushan (GZDS) and Yunnan Menglian (YNML) and surveyed for their agronomic traits. The endophytic fungi community structure was analyzed by ITS sequencing, and the correlation between the abundance of endophytic fungi in different habitats and the host agronomic traits were analyzed by R language.The difference analysis showed that there were significant differences in plant height, stem length and stem diameter offrom the three habitats (＜0.05). A total of 923 characteristic sequences of endophytic fungi were obtained by ITS assay, which could be annotated to three phylum, 138 genus. The distribution difference of endophytic fungi infrom different habitats were shown at genus level, and the diversities of AHHS fungal community were significantly different from that of other places. The relative correlation analysis showed there were negative correlation between endophytic fungusand the plant height, stem length, stem diameter of the host (< 0.05).The different agronomic traits formation of stems in different habitats were closely related to the changes in abundance of endophytic fungi which were common in.

Kimura et Migo; endophytic fungi; ITS sequencing; diversity analysis; agronomic trait; correlation analysis

R286.2

A

0253 - 2670(2023)04 - 1236 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.024

2022-08-12

國家自然科學基金項目（31960074）；貴州省科學技術基金項目（黔科平臺人才[2019]-027，黔科合平臺人才[2017]5733-050，黔科合支撐[2019]2961號）；遵義市科技局遵義醫(yī)科大學科學技術聯(lián)合資金招標專項（遵義市合HZ字（2020）91號）

劉朝波，碩士研究生，從事中藥材遺傳改良與基因工程研究。E-mail: 1947261933@qq.com

錢 剛，從事植物細胞與分子遺傳學研究。E-mail: qiangang69@sina.cn

李 林，從事中藥材遺傳改良與基因工程研究。E-mail: 191129104@qq.com

[責任編輯 時圣明]