李 鑫，徐浩南，李世興，張化為，姜 祎，李玉澤，宋小妹，張東東，王 薇

“太白七藥”朱砂七化學(xué)成分研究

李 鑫，徐浩南，李世興，張化為，姜 祎，李玉澤，宋小妹，張東東*，王 薇*

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046

研究朱砂七（毛脈首烏var.根）的化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性和抗病毒活性。采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜以及半制備HPLC等方法進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)鑒定所得化合物的結(jié)構(gòu)。采用MTT法測(cè)定其細(xì)胞毒活性，CCK-8法測(cè)定其抗病毒活性。從朱砂七75%乙醇提取物中分離得到20個(gè)化合物，分別鑒定為大黃素甲醚（1）、大黃素（2）、β-谷甾醇（3）、1,8-二羥基蒽醌（4）、1-methyl emodin（5）、(＋)-丁香樹(shù)脂酚（6）、(＋)-lirioresinol A（7）、反式對(duì)羥基肉桂酸（8）、大黃素-1--β--葡萄糖苷（9）、ω-羥基大黃素（10）、(＋)-兒茶素（11）、(?)-表兒茶素（12）、南燭木糖苷（13）、(＋)-異落葉松脂素-9--β--吡喃木糖苷（14）、反式-4-甲氧基肉桂酸（15）、順式-4-甲氧基肉桂酸（16）、槲皮素（17）、槲皮素-3--β--葡萄糖苷（18）、胡蘿卜苷（19）、dermolutein（20）。化合物1、2、10對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為21.77～46.71 μmol/L；化合物2對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的IC50值為24.21 μmol/L；化合物2、5、10對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的IC50值為14.61～90.13 μmol/L；化合物2對(duì)人類腸道病毒A71型（enterovirus-A71，EV-A71）病毒的抑制率為65.16%。化合物5、20為首次從蓼科植物中分離得到?；衔?、6、7、13～16為首次從何首烏屬植物中分離得到，化合物8、9、11、12、17、18為首次從朱砂七中分離得到，化合物1對(duì)A549細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，化合物2對(duì)A549、HCT116、SW620細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，化合物5對(duì)SW620細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，化合物10對(duì)A549、SW620細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，此外，化合物2對(duì)EV-A71病毒有一定的抑制作用。

朱砂七；細(xì)胞毒活性；抗病毒活性；大黃素甲醚；大黃素；1-methyl emodin；ω-羥基大黃素；1,8-二羥基蒽醌

朱砂七為蓼科（Polygonaceae）何首烏屬Turcz.植物毛脈首烏Thunb. var.(Nakai) Yonekura & H. Ohashi的干燥塊根，是陜西秦巴山區(qū)特色“太白七藥”之一[1-3]。性涼，味苦、微澀，具有清熱解毒、涼血止血、祛風(fēng)濕、強(qiáng)腰膝、滋養(yǎng)肝腎的效果[2]。臨床用于扁桃體炎、胃炎、腸炎、尿路感染；外用治跌打損傷、外傷出血等[3]。國(guó)內(nèi)對(duì)朱砂七的研究主要集中于抗炎、抗腫瘤、抗病毒等藥理研究，而對(duì)朱砂七化學(xué)成分的報(bào)道較少[4-6]。課題組在前期研究基礎(chǔ)上對(duì)朱砂七進(jìn)行系統(tǒng)性研究[7]，從朱砂七75%乙醇提取物中分離鑒定出20個(gè)化合物，分別為大黃素甲醚（physcion，1）、大黃素（emodin，2）、β-谷甾醇（β-sitosterol，3）、1,8-二羥基蒽醌（1,8-dihydroxy-anthraquinone，4）、1-methyl emodin（5）、(＋)-丁香樹(shù)脂酚[(＋)-syringaresinol，6]、(＋)-lirioresinol A（7）、反式對(duì)羥基肉桂酸（-hydroxy-cinnamic acid，8）、大黃素-1--β--葡萄糖苷（emodin-1--β--glucoside，9）、-羥基大黃素（-hydroxyemodin，10）、(＋)-兒茶素[(＋)-catechin，11]、(?)-表兒茶素[(?)-epicatechin 12]、南燭木糖苷（lyoniside，13）、(＋)-異落葉松脂素-9--β--吡喃木糖苷[(＋)-isolariciresinol-9-- β--xylopyranoside，14]、反式-4-甲氧基肉桂酸（-4-methoxycinnamic acid，15）、順式-4-甲氧基肉桂酸（-4-methoxycinnamic acid，16）、槲皮素（quercetin，17）、槲皮素-3--β--葡萄糖苷（quercetin-3--β--glucooside，18）、胡蘿卜苷（daucosterol，19）、dermolutein（20）。其中化合物5、20為首次從蓼科中分離得到，化合物4、6、7、13～16為首次從何首烏屬中分離得到，化合物8、9、11、12、17、18為首次從該植物中分離得到?；衔?對(duì)人肺癌A549細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，化合物2可抑制A549細(xì)胞、人結(jié)腸癌HCT116和SW620細(xì)胞增殖，化合物5對(duì)SW620細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，化合物10對(duì)A549、SW620細(xì)胞均有細(xì)胞毒活性，此外，化合物2對(duì)人類腸道病毒A71型病毒（enterovirus A71，EV-A71）具有一定的抑制作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AVANCE型核磁共振波譜儀（德國(guó)Burker公司）；YMC-Pack Pro C18半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司）；LC-6AD型半制備液相色譜儀（日本島津公司）；Sephadex LH-20凝膠柱色譜（GE Healthcare Bio-Sciences AB公司）；Rudolph Autopol VI型旋光分析儀（美國(guó)魯?shù)婪蚬荆?；NU-5800E型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Nuaire公司）；MultiskanGO型酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）；DLSB series型低溫冷凝循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司）；硅膠柱色譜（100～200、200～300目，青島海洋化工廠）；薄層硅膠板（煙臺(tái)江友硅膠發(fā)展有限公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 材料

順鉑（批號(hào)H20023460）購(gòu)自齊魯醫(yī)藥公司；Peptide 2由武漢病毒研究所自制的病毒抑制靶向肽；單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus-1，HSV-1，批號(hào)VR-733）、EV-A71（批號(hào)VR-1432）購(gòu)自ATCC；寨卡病毒（zika virus，ZIKV，批號(hào)GZ01）購(gòu)自武漢病毒學(xué)研究所。

朱砂七于2021年5月采自陜西秦嶺太白山地區(qū)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王薇教授鑒定為蓼科何首烏屬植物毛脈首烏Thunb. var.(Nakai) Yonekura & H. Ohashi的干燥塊根。標(biāo)本（20180627）保存于陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物標(biāo)本室。

2 提取與分離

朱砂七藥材干燥根10.0 kg，用100 L 75%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。合并提取液，減壓濃縮，分別用石油醚、水飽和正丁醇萃取3次，濃縮干燥得石油醚部位15 g，正丁醇部位570 g。取石油醚部位采用硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（80∶1→0∶1）梯度洗脫，得到4個(gè)組分Fr. 1～4。其中Fr. 2（7.20 g）經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-醋酸乙酯（50∶1→0∶100）梯度洗脫，得到3個(gè)組分Fr. 2.1～2.3。Fr. 2.2（1.20 g）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）反復(fù)純化，得到化合物1（200 mg）和2（300 mg）。取正丁醇部位經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（100∶0→0∶1）梯度洗脫，得到8個(gè)組分FE. 1～8。FE. 1（5.00 g）硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇（100∶1→10∶1）梯度洗脫，得到4個(gè)組分FE. 1.1～1.4。FE. 1.1（0.74 g）經(jīng)凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）分離、重結(jié)晶得到化合物3（30 mg），F(xiàn)E. 1.2（0.50 g）經(jīng)凝膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）分離，重結(jié)晶得到化合物4（18 mg）。FE. 3（43 g）經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇（80∶1→0∶100）梯度洗脫得到5個(gè)組分FE. 3.1～3.5。FE. 3.3（11.27 g）經(jīng)半制備HPLC純化（甲醇-水75∶25，1.50 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm）得到化合物20（25 mg，R＝26.6 min）、10（10 mg，R＝30.1 min）、5（25 mg，R＝35.3 min）。FE. 4（58.40 g）經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇（80∶1→0∶100）梯度洗脫得到5個(gè)組分FE. 4.1～4.5。FE. 4.2（20.20 g）經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇（80∶1→0∶1）梯度洗脫得到3個(gè)組分FE. 4.2.1～4.2.3。FE. 4.2.1經(jīng)半制備HPLC純化（甲醇-水70∶30，1.50 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm），得到化合物11（13 mg，R＝25.7 min）、7（5 mg，R＝32.6 min）、6（10 mg，R＝33.7 min）。FE. 4.2.2經(jīng)半制備HPLC純化（甲醇-水65∶35，1.50 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm），得到化合物17（25 mg，R＝23.9 min）、12（13 mg，R＝29.4 min）。FE. 4.2.3經(jīng)重結(jié)晶得到化合物19（50 mg）。FE. 5（50.1 g）采用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（60∶1→0∶100）梯度洗脫，得到5個(gè)組分FE. 5.1～5.5。FE. 5.1（7.50 g）采用凝膠柱色譜分離（甲醇），再經(jīng)半制備HPLC純化（甲醇-水60∶40，1.50 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm）分離，得到化合物8（9 mg，R＝19.3 min）、15（13 mg，R＝20.9 min）、16（13 mg，R＝35.1 min）。FE. 5.3（15.80 g）采用凝膠柱色譜分離（甲醇），再經(jīng)半制備HPLC純化（甲醇-水55∶45，1.50 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）分離，得到化合物13（30 mg，R＝25.0 min）、9（15 mg，R＝32.7 min）。FE. 6（150 g）采用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（60∶1→0∶1）梯度洗脫，得到5個(gè)組分FE. 6.1～6.5。FE. 6.2（23 g）采用凝膠柱色譜分離（甲醇），經(jīng)半制備HPLC純化（甲醇-水40∶60，1.50 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm）分離，得到化合物18（25 mg，R＝24.2 min）、14（16 mg，R＝35.5 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：橙黃色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS/:285.1 [M＋H]+，分子式為C16H12O5。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.65 (1H, d,= 2.6 Hz, H-2), 7.32 (1H, d,= 2.6 Hz, H-4), 7.58 (1H, d,= 1.6 Hz, H-5), 7.05 (1H, d,= 1.6 Hz, H-7), 2.44 (3H, s, 6-CH3), 3.93 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 165.3 (C-1), 106.9 (C-2), 166.7 (C-3), 108.3 (C-4), 121.4 (C-5), 148.6 (C-6), 124.6 (C-7), 162.3 (C-8), 190.8 (C-9), 182.1 (C-10), 133.3 (C-9a), 113.8 (C-9b), 110.4 (C-10a), 135.4 (C-10b), 22.3 (6-CH3), 56.2 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行對(duì)比[8]，鑒定化合物1為大黃素甲醚。

化合物2：黃色粉末，ESI-MS/:271.1 [M＋H]+，分子式為C15H10O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 11.95 (1H, s, 1-OH), 11.31 (1H, s, 3-OH), 12.07 (1H, s, 8-OH), 7.21 (1H, d,= 1.0 Hz, H-2), 7.47 (1H, d,= 1.0 Hz, H-4), 7.04 (1H, d,= 2.5 Hz, H-5), 6.51 (1H, d,= 2.5 Hz, H-7), 2.40 (3H, s, 6-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 164.5 (C-1), 107.3 (C-2), 166.0 (C-3), 109.2 (C-4), 120.0 (C-5), 147.8 (C-6), 124.4 (C-7), 161.2 (C-8), 190.0 (C-9), 181.7 (C-10), 134.4 (C-4a), 133.1 (C-4b), 113.8 (C-8a), 108.3 (C-8b), 22.8 (6-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[9]，鑒定化合物2為大黃素。

化合物3：白色針狀結(jié)晶（三氯甲烷），ESI-MS/: 413.4 [M－H]?，分子式為C29H50O。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 3.54 (1H, m, H-3), 5.37 (1H, d,= 5.0 Hz, H-6), 0.70 (3H, s, H-18), 1.03 (3H, s, H-19), 0.94 (3H, d,= 6.5 Hz, H-21)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 36.0 (C-1), 28.6 (C-2), 71.3 (C-3), 39.3 (C-4), 140.3 (C-5), 121.2 (C-6), 31.2 (C-7, 8), 49.6 (C-9), 35.7 (C-10), 19.3 (C-11), 36.8 (C-12), 41.8 (C-13), 56.3 (C-14), 22.6 (C-15), 25.6 (C-16), 55.6 (C-17), 11.5 (C-18), 18.5 (C-19), 33.4 (C-20), 18.3 (C-21), 31.4 (C-22), 23.8 (C-23), 45.3 (C-24), 27.8 (C-25), 18.9 (C-26, 27), 20.6 (C-28), 11.4 (C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致[10]，鑒定化合物3為β-谷甾醇。

化合物4：黃色粉末，ESI-MS/: 241.1 [M＋H]+，分子式為C14H8O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.74 (2H, t,= 7.9 Hz, H-3, 6), 7.59 (2H, d,= 7.5 Hz, H-4, 5), 7.29 (2H, d,= 8.3 Hz, H-2, 7)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 161.8 (C-1, 8), 124.9 (C-2, 7), 137.9 (C-3, 6), 119.7 (C-4, 5), 181.3 (C-9), 192.4 (C-10), 116.3 (C-8a, 9a), 133.8 (C-4a, 10a)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致[11]，鑒定化合物4為1,8-二羥基蒽醌。

化合物5：粉色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS/:285.1 [M＋H]+，分子式為C16H12O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.77 (1H, d,= 2.4 Hz, H-2), 7.13 (1H, d,= 2.4 Hz, H-4), 7.32 (1H, d,= 1.8 Hz, H-5), 7.03 (1H, s, H-7), 3.88 (3H, s, 8-OCH3), 2.35 (3H, s, 6-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 164.5 (C-1), 104.9 (C-2), 161.7 (C-3), 106.9 (C-4), 119.1 (C-5), 146.6 (C-6), 124.1 (C-7), 163.4 (C-8), 186.3 (C-9), 182.3 (C-10), 114.4 (C-9a), 112.6 (C-9b), 132.0 (C-10a), 136.8 (C-10b), 56.3 (8-OCH3), 21.4 (6-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行對(duì)比[12]，鑒定化合物5為1-methyl emodin。

化合物8：淡黃色粉末，ESI-MS/: 163.0 [M－H]?，分子式為C9H8O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.44 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.80 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 7.62 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 6.33 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 127.3 (C-1), 131.3 (C-2, 6), 116.9 (C-3, 5), 161.4 (C-4), 146.7 (C-7), 115.1 (C-8), 169.9 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[15]，鑒定化合物8為反式對(duì)羥基肉桂酸。

化合物9：黃色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS/:433.1 [M＋H]+，分子式為C21H20O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.16 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2), 7.46 (1H, d,= 1.7 Hz, H-4), 7.28 (1H, d,= 2.4 Hz, H-5), 7.0 (1H, d,= 2.4 Hz, H-7), 2.40 (3H, s, 6-CH3), 5.05 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1), 3.35 (1H, m, H-2), 3.43 (1H, m, H-3), 3.49 (1H, m, H-4), 3.56 (1H, m, H-5), 3.94 (1H, dd,= 2.3, 12.1 Hz, H-6), 3.75 (1H, dd,= 5.7, 12.1 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 161.0 (C-1), 124.1 (C-2), 164.2 (C-3), 119.2 (C-4), 108.3 (C-5), 146.9 (C-6), 108.3 (C-7), 161.7 (C-8), 186.4 (C-9), 182.1 (C-10), 113.3 (C-9a), 114.5 (C-9b), 136.5 (C-10a), 132.1 (10b), 21.4 (6-CH3), 100.8 (C-1), 73.2 (C-2), 76.4 (C-3), 69.4 (C-4), 77.3 (C-5), 60.6 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[16]，鑒定化合物9為大黃素-1--β--葡萄糖苷。

化合物10：橙黃色針狀結(jié)晶（甲醇），ESI-MS/:287.1 [M＋H]+，分子式為C15H10O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.57 (1H, d,= 2.5 Hz, H-2), 7.10 (1H, d,= 2.5 Hz, H-4), 7.61 (1H, d,= 1.6 Hz, H-5), 7.23 (1H, d,= 1.6 Hz, H-7), 4.61 (2H, s, 6-CH2OH)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 164.5 (C-1, 3), 107.9 (C-2), 108.8 (C-4), 117.0 (C-5), 152.8 (C-6), 120.8 (C-7), 161.4 (C-8), 189.6 (C-9), 181.3 (C-10), 108.9 (C-9a), 114.0 (C-9b), 135.1 (C-10a), 132.9 (C-10b), 62.0 (6-CH2OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[17]，鑒定化合物10為-羥基大黃素。

化合物13：黃色油狀物，ESI-MS/: 553.2 [M＋H]+，分子式為C27H36O12。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.54 (1H, s, H-6), 2.67 (2H, m, H-7), 1.70 (1H, m, H-8), 3.63 (1H, m, H-9), 6.40 (1H, s, H-2, 6), 4.22 (1H, d,= 7.0 Hz, H-7), 1.98 (1H, m, H-8), 3.79 (2H, m, H-9), 4.10 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1), 3.12 (2H, m, H-2), 3.23 (1H, m, H-3), 3.55 (1H, m, H-4), 3.16 (1H, m, H-5), 3.83 (3H, s, 3, 5-OCH3), 3.23 (3H, s, 3-OCH3), 3.74 (3H, s, 5-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 130.2 (C-1), 126.4 (C-2), 148.6 (C-3), 138.9 (C-4), 147.5 (C-5), 107.7 (C-6), 34.1 (C-7), 40.4 (C-8), 65.9 (C-9), 139.6 (C-1), 106.8 (C-2, 6), 148.9 (C-3, 5), 134.4 (C-4), 43.0 (C-7), 46.8 (C-8), 70.8 (C-9), 105.8 (C-1), 74.8 (C-2), 78.0 (C-3), 71.2 (C-4), 67.0 (C-5), 56.7 (3, 5-OCH3), 56.5 (3-OCH3), 60.0 (5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[20]，鑒定化合物13為南燭木糖苷。

化合物15：白色粉末，ESI-MS/: 177.1 [M－H]?，分子式為C10H10O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.44 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.80 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 7.62 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.33 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 3.75 (3H, s, 4-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 127.1 (C-1), 131.3 (C-2, 6), 116.9 (C-3, 5), 161.4 (C-4), 146.7 (C-7), 115.1 (C-8), 169.9 (C-9), 52.1 (4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[22]，鑒定化合物15為反式-4-甲氧基肉桂酸。

化合物16：白色粉末，ESI-MS/: 177.1 [M－H]?，分子式為C10H10O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.21 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.58 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 7.63 (1H, d,= 12.8 Hz, H-7), 6.45 (1H, d,= 12.8 Hz, H-8), 3.73 (3H, s, 4-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 127.7 (C-1), 133.6 (C-2, 6), 116.3 (C-3, 5), 160.1 (C-4), 145.1 (C-7), 115.9 (C-8), 168.9 (C-9), 51.7 (4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[23]，鑒定化合物16為順式-4-甲氧基肉桂酸。

化合物17：白色粉末，ESI-MS/: 303.0 [M＋H]+，分子式為C15H10O7。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.38 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 6.18 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 7.38 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2), 6.52 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 7.24 (1H, dd,= 8.5, 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 147.5 (C-2), 136.5 (C-3), 178.3 (C-4), 156.3 (C-5), 98.5 (C-6), 162.4 (C-7), 94.3 (C-8), 162.5 (C-9), 102.5 (C-10), 122.3 (C-1), 118.2 (C-2, 6), 144.3 (C-3), 148.6 (C-4), 115.2 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[24]，鑒定化合物17為槲皮素。

化合物18：白色粉末，ESI-MS/: 465.1 [M＋H]+，分子式為C21H20O12。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.38 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 6.18 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 7.38 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2), 6.52 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 7.24 (1H, dd,= 8.5, 2.2 Hz, H-6), 5.50 (1H, d,= 7.3 Hz, H-1), 3.08 (1H, m, H-2), 3.19 (1H, m, H-3), 3.25 (1H, m, H-4), 3.31 (1H, m, H-5), 3.92 (1H, m, H-6a), 3.64 (1H, m, H-6b)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d): 147.5 (C-2), 136.5 (C-3), 178.3 (C-4), 156.3 (C-5), 98.5 (C-6), 162.4 (C-7), 94.3 (C-8), 162.5 (C-9), 102.5 (C-10), 122.3 (C-1), 118.2 (C-2), 144.3 (C-3), 148.6 (C-4), 115.2 (C-5), 118.2 (C-6), 102.8 (C-1), 74.9 (C-2), 78.0 (C-3), 71.4 (C-4), 78.2 (C-5), 62.6 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[25]，鑒定化合物18為槲皮素-3--β--葡萄糖苷。

化合物19：白色粉末，ESI-MS/: 575.4 [M－H]?，分子式為C35H60O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 4.42 (1H, t,= 5.8 Hz, H-3), 5.33 (1H, s, H-6), 0.66 (3H, s, H-18), 0.96 (3H, s, H-19), 0.90 (3H, d,= 6.5 Hz, H-21), 0.80 (3H, d,= 6.9 Hz, H-27), 0.84 (3H, t,= 6.2 Hz, H-29), 4.23 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 36.8 (C-1), 29.2 (C-2), 76.8 (C-3, 3), 38.3 (C-4), 140.4 (C-5), 121.2 (C-6), 31.4 (C-7), 31.3 (C-8), 49.6 (C-9), 36.3 (C-10), 20.6 (C-11), 41.8 (C-13), 56.1 (C-14), 23.8 (C-15), 27.8 (C-16), 55.4 (C-17), 11.8 (C-18), 19.0 (C-19), 35.4 (C-20), 18.7 (C-21, 26), 33.3 (C-22), 25.4 (C-23), 45.1 (C-24), 28.6 (C-25), 19.6 (C-27), 22.6 (C-28), 11.6 (C-29), 100.7 (C-1), 73.4 (C-2), 70.0 (C-4), 76.7 (C-5), 61.0 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[15,26]，鑒定化合物19為胡蘿卜苷。

化合物20：橙黃色固體（甲醇），ESI-MS/:329.1 [M＋H]+，分子式為C17H12O7。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 6.71 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 7.07 (1H, d,= 2.3 Hz, H-4), 7.36 (1H, s, H-5), 3.82 (3H, s, 1-OCH3), 2.30 (3H, s, 6-CH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 158.1 (C-1), 107.1 (C-2), 164.6 (C-3, 8), 104.9 (C-4), 119.2 (C-5), 141.9 (C-6), 136.6 (C-7), 186.0 (C-9), 181.7 (C-10), 112.5 (C-9a), 114.6 (C-9b), 131.6 (C-10a), 130.6 (C-10b), 167.3 (7-COOH), 56.3 (1-OCH3), 19.4 (6-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[27]，鑒定化合物20為dermolutein。

4 生物活性測(cè)定

4.1 MTT法檢測(cè)化合物抗腫瘤活性

采用MTT法測(cè)定化合物1～20對(duì)A549、HCT116、SW620細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。A549、HCT116和SW620細(xì)胞保存在RPMI 1640培養(yǎng)基中，添加100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素以及10%胎牛血清，然后將培養(yǎng)基放入37℃、5% CO2的細(xì)胞培育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)基中的細(xì)胞，加入適量胰蛋白酶使細(xì)胞消化。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)基中細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞質(zhì)回縮時(shí)停止消化，用移液槍吸出消化液，然后PBS清洗細(xì)胞去除殘液，加入培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移置離心管進(jìn)行離心，去掉上清液，加入新鮮培養(yǎng)基吹打形成細(xì)胞懸浮液。在96孔板上每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞（100 μL培養(yǎng)基）培養(yǎng)24 h，將化合物用DMSO溶解，加入不同濃度（1、3、10、30、50 μmol/L）的化合物，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照藥，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后去除培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT，同樣條件培養(yǎng)4 h后，吸出上清液，然后加入100 μL DMSO，振蕩使其溶解，用酶標(biāo)儀（530 nm）測(cè)每孔的吸光度（）值，并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）[28-29]。

4.2 CCK-8法檢測(cè)化合物抗病毒活性

采用CCK-8法測(cè)定化合物1～20對(duì)HSV-1、ZIKV和EV-A71病毒的抗病毒活性。將病毒宿主細(xì)胞（A549、人腦膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞、人惡性胚胎橫紋肌瘤RD細(xì)胞）保存在RPMI 1640培養(yǎng)基中，分別添加100 μg/mL青霉素和鏈霉素以及10%胎牛血清，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，去除舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)基中的細(xì)胞，加入適量胰蛋白酶使細(xì)胞消化。顯微鏡下觀察培養(yǎng)基中細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞質(zhì)回縮時(shí)停止消化，用移液槍吸出消化液，然后PBS清洗細(xì)胞，加入培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移置離心管進(jìn)行離心，去除上清液，加入新鮮培養(yǎng)基吹打形成細(xì)胞懸浮液。在96孔板上每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞（100 μL培養(yǎng)基）培養(yǎng)24 h，將ZIKV、HSV-1、EV-A71病毒分別感染于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549、U373和RD細(xì)胞上，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培育箱中培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的病變效應(yīng)，待病變效應(yīng)達(dá)到90%時(shí)停止病毒細(xì)胞的培養(yǎng)，即完成病毒擴(kuò)增。將培養(yǎng)好單層A549細(xì)胞的96孔板取出，每孔加入100 μL化合物（1、5、10、30、50 μmol/L），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，然后加入100倍細(xì)胞半數(shù)感染量的EV-A71病毒懸浮液，陽(yáng)性對(duì)照為P2[30]，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)4 h，當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)到“＋＋＋＋”（80%左右的細(xì)胞病變），棄去上清液，加入100 μL 5 mg/mL的CCK-8溶液，置細(xì)胞培育箱中培育2 h，棄去上清液，加入100 μL DMSO，振蕩搖勻，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)530 nm下測(cè)每孔的值，計(jì)算化合物的病毒抑制率。

抑制率＝(藥物實(shí)驗(yàn)－藥物對(duì)照孔平均)/(細(xì)胞對(duì)照孔平均－藥物對(duì)照孔平均)

4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.3.1 MTT法檢測(cè)化合物抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，化合物1對(duì)A549細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，IC50值為（26.98±2.69）μmol/L；化合物2對(duì)A549、HCT116和SW620細(xì)胞均有細(xì)胞毒活性，IC50值分別為（21.77±1.07）、（24.21±0.8）、（14.61±0.53）μmol/L；化合物5對(duì)SW620細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，IC50值為（75.65±0.16）μmol/L；化合物10對(duì)A549和SW620細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，IC50值分別為（46.71±0.63）、（90.13±0.41）μmol/L，陽(yáng)性對(duì)照順鉑對(duì)A549、HCT116和SW620細(xì)胞的IC50值分別為（32.06±1.31）、（43.54±3.30）、（32.47±3.39）μmol/L，其余化合物均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性。

4.3.2 CCK-8法檢測(cè)化合物抗病毒活性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，化合物2在10 μmol/L對(duì)EV-A71病毒表現(xiàn)出抑制作用，抑制率為（65.16±2.31）%，陽(yáng)性對(duì)照P2的抑制率為（100.91±2.63）%，其余化合物均未表現(xiàn)出抗病毒活性。

5 討論

本研究綜合運(yùn)用多種現(xiàn)代色譜分離技術(shù)和波譜鑒定手段對(duì)“太白七藥”朱砂七的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離鑒定了20個(gè)化合物，其中化合物5、20首次從蓼科中分離得到，化合物4、6、7、13～16首次從何首烏屬中分離得到，化合物8、9、11、12、17、18首次從朱砂七中分離得到，進(jìn)一步豐富了朱砂七的化學(xué)成分。細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)顯示化合物1、2、5、10具有細(xì)胞毒活性，化合物2具有抗病毒活性，但本研究?jī)H測(cè)定了20個(gè)化合物的體外細(xì)胞毒活性及抗病毒活性，關(guān)于這些化合物的其他活性有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on chemical constituents of “Taibai Qi Yao”var.

LI Xin, XU Hao-nan, LI Shi-xing, ZHANG Hua-wei, JIANG Yi, LI Yu-ze, SONG Xiao-mei, ZHANG Dong-dong, WANG Wei

School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China

To study the chemical constituents ofvar.and its cytotoxic and antiviral activities.The compounds were isolated and purified by silica, Sephadex LH-20 and semi-preparative HPLC, and the structures were identified based on the physicochemical properties and spectral data analysis. The cytotoxic activity was determined by MTT method and the antiviral activity was determined by CCK-8 method.Twenty compounds were isolated from 75% ethanol extract ofvar.and identified as physcion (1), emodin (2), β-sitosterol (3), 1,8-dihydroxy-anthraquinone (4), 1-methyl emodin (5), (＋)-syringaresinol (6), (＋)-lirioresinol A (7),-hydroxy-cinnamic acid (8), emodin-1--β--glucoside (9), ω-hydroxyemodin (10), (＋)-catechin (11), (?)-epicatechin (12), lyoniside (13), (＋)-isolariciresinol- 9--β--xylopyranoside (14),-4-methoxycinnamic acid (15),-4-methoxycinnamic acid (16), quercetin (17), quercetin-3--β--glucooside (18), daucosterol (19) and dermolutein (20). The half maximal inhibitory concentration (IC50) of compounds 1, 2 and 10 for human lung cancer A549 cells was 21.77—46.71 μmol/L, The IC50value of compound 2 against human colon cancer HCT116 cells was 24.21 μmol/L, and The IC50values of compounds 2, 5 and 10 against human colon cancer SW620 cells were 14.61—90.13 μmol/L. The inhibitory rate of compound 2 against human enterovirus-A71 (EV-A71) virus was 65.16%.Compounds 5, 20 were first isolated from Polygonaceae, compounds 4, 6, 7, 13—16 were isolated from the genusfor the first time, and compounds 8, 9, 11, 12, 17, 18 were isolated from this plantfor the first time, compounds 1, 2, 5 and 10 showed cytotoxic activities against A549, HCT116 and SW620 cells, compound 2 showed inhibitory effect on EV-A71 virus.

Thunb. var.(Nakai) Yonekura & H. Ohashi; cytotoxic activity; antiviral activity; physcion; emodin; 1-methyl emodin; ω-hydroxyemodin; 1,8-dihydroxy-anthraquinone

R284.1

A

0253 - 2670(2023)04 - 1043 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.004

2022-06-18

陜西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022SF-254）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)科創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019-YL12）

李 鑫（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴帣z驗(yàn)與質(zhì)量分析。E-mail: 2463763362@qq.com

王 薇（1972—），女，博士，教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及中藥炮制研究。Tel: (029)38185165 E-mail: 2051003@sntcm.edu.cn

張東東（1990—），男，博士，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: (029)38185165 E-mail: zhangnatprod@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]