高 銘，張 霞，羅戴民，楊若聰，饒志粒，曾 南*

荊防顆粒對急性醉酒模型小鼠的解酒作用及作用機(jī)制

高 銘1, 2，張 霞1, 2，羅戴民1, 2，楊若聰1, 2，饒志粒1, 2，曾 南1, 2*

1. 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

建立小鼠醉酒模型，探究荊防顆粒的解酒作用及其作用機(jī)制。將雌雄各半SPF級昆明種小鼠隨機(jī)分為模型組和荊防顆粒組，模型組ig生理鹽水，荊防顆粒組ig荊防顆粒30 min后，小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg）構(gòu)建急性醉酒模型，以翻正反射消失/恢復(fù)時(shí)間評價(jià)各組小鼠醉酒潛伏期和睡眠時(shí)間，并計(jì)算醉酒率；轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)觀察小鼠ig白酒10 min后的在棒時(shí)間，并觀察小鼠胃黏膜損傷情況。進(jìn)一步基于急性醉酒小鼠模型，觀察藥物對小鼠肝組織酒精代謝酶乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、過氧化氫酶（catalyse，CAT）、細(xì)胞色素P450第二家族E亞型多肽1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的調(diào)節(jié)作用；Western blotting考察荊防顆粒對細(xì)胞自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。與模型組比較，荊防顆粒降低小鼠醉酒率，并明顯延長小鼠在棒時(shí)間及減輕胃黏膜損傷，表現(xiàn)出解酒作用；荊防顆粒顯著提高模型小鼠肝組織ADH、CAT活力（＜0.05、0.01、0.001），逆轉(zhuǎn)過量飲酒導(dǎo)致的CYP2E1蛋白表達(dá)升高（＜0.001），升高模型小鼠肝組織ADH1、ALDH2蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01）；明顯上調(diào)模型小鼠肝組織微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ（microtubule-associated protein1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）/LC3I值（＜0.01），降低p62蛋白表達(dá)（＜0.05）。荊防顆粒能降低小鼠醉酒率，改善過度飲酒引起的中樞抑制及胃黏膜損傷表現(xiàn)，呈現(xiàn)出解酒作用；其作用機(jī)制可能與提高酒精代謝酶ADH、CAT、ALDH活力或表達(dá)以加速機(jī)體酒精代謝，激活自噬，緩解CYP2E1誘導(dǎo)的損傷有關(guān)。

解酒；荊防顆粒；酒精代謝；自噬；急性醉酒模型小鼠

自古以來，酒精與人類的文化生活密切相關(guān)。然而過量飲酒會引起急性、慢性酒精中毒，給身體帶來許多危害，如增加心臟負(fù)擔(dān)、破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起消化、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多組織器官損傷，導(dǎo)致人體出現(xiàn)頭昏、惡心、嘔吐、動作遲緩、記憶力減退、昏迷等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可致死亡[1-2]。為緩解單次過量飲酒給機(jī)體造成的損害，提高大眾健康質(zhì)量，解酒護(hù)肝產(chǎn)品的研發(fā)成為研究熱點(diǎn)。荊防顆粒源自荊防敗毒散，該方最早記載于明代張時(shí)徹《攝生眾妙方》，由荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡、川芎、桔梗、前胡、枳殼、茯苓、甘草11味中藥組成，具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕之功效[3-4]。研究報(bào)道，荊防顆粒連續(xù)ig給藥8周對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化有明顯保護(hù)作用，可降低模型小鼠血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）活性及總膽汁酸（total bile acid，TBA）和三酰甘油（triglyceride，TG）水平，并減輕肝細(xì)胞變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤；同時(shí)發(fā)現(xiàn)荊防顆粒能降低肝組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平[5]，表明荊防顆粒對機(jī)體主要解毒器官——肝臟有一定保護(hù)作用。荊防敗毒散加減方單次預(yù)防給藥能明顯降低急性酒精中毒小鼠醉酒率并延長醉酒潛伏期；單次治療給藥可降低急性酒精中毒小鼠血液乙醇濃度，提高小鼠肝臟和胃組織乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、SOD活性，降低MDA含量，促進(jìn)酒精代謝，表現(xiàn)出良好解酒促醒作用[6]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明荊防敗毒散對四氯化碳和酒精引起的肝臟損傷有保護(hù)作用，本課題組既往研究亦發(fā)現(xiàn)荊防顆粒能降低醉酒小鼠血液中乙醇含量，其解酒作用可能與激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路有關(guān)[7]。一般而言，攝入機(jī)體的酒精90%以上會經(jīng)胃腸道吸收，僅少量通過呼吸、汗液、尿液等排出體外。由胃腸道吸收的部分酒精在胃腸道的首過代謝下被氧化，更多的酒精則是通過門靜脈進(jìn)入肝臟，經(jīng)肝臟內(nèi)豐富的酶進(jìn)行代謝[8]。此外，進(jìn)入血液循環(huán)后的少量酒精還可透過血腦屏障，由大腦中的酶系統(tǒng)代謝?？傊?，進(jìn)入肝臟的酒精通過氧化途徑和非氧化途徑進(jìn)行代謝，前者主要涉及ADH和微粒體乙醇氧化系統(tǒng)（microsomal ethanol oxidizing system，MEOS）如細(xì)胞色素P450第二家族E亞型多肽1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）和過氧化氫酶（catalyse，CAT），后者參與酒精代謝的比例較低，一般是在酶介導(dǎo)下酒精與內(nèi)源性代謝物如葡萄糖醛酸、硫酸鹽、磷脂和脂肪酸的結(jié)合，生成相應(yīng)代謝物[9]。本研究基于前期研究基礎(chǔ)及部分人群服用體驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建小鼠急性醉酒模型，擬進(jìn)一步明確荊防顆粒的解酒效應(yīng)表現(xiàn)及可能相關(guān)的作用機(jī)制，旨在為荊防顆粒臨床應(yīng)用的拓展提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院動物觀察室，許可證號SYXK（川）2020-124。所有動物均自由進(jìn)食進(jìn)水，在明暗各12 h的環(huán)境中飼養(yǎng)，光照時(shí)間為8: 00～20: 00時(shí)，環(huán)境溫度保持在（22±2）℃。本實(shí)驗(yàn)符合動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求，獲成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20200320）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（批號0012008009）購自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司；-乙酰--半胱氨酸（-acetyl--cysteine，NAC，批號824O033）購自北京索萊寶科技有限公司；56°紅星二鍋頭（批號20191204）購自北京紅星股份有限公司；CAT檢測試劑盒（批號071321220513）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）/還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）檢測試劑盒（批號052021220128）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠ADH試劑盒（批號8AKF434LSX）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；ADH1兔抗（批號5295S）、p62兔抗（批號23214S）購自美國CST公司；CYP2E1兔抗（批號54i7601）購自Affinity Antibody公司；乙醛脫氫酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）兔抗（批號323861）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）兔抗（批號334372）購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司；β-actin兔抗（批號AC220227008）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗（批號AC2111013A）、β-tubulin兔抗（批號AC2101019B）購自武漢賽維爾公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號BST17G08A17H54）購自博士德生物公司。

1.3 儀器

MDF-U50V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；UPT-2-5T型超純水儀（成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司）；ZB-200型疲勞轉(zhuǎn)棒儀（成都泰盟軟件有限公司）；KZ-II型高效組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；ST16R型低溫高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、ImageLab凝膠分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 荊防顆粒預(yù)防給藥對小鼠的解酒作用

將SPF級昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為模型組和荊防顆粒高、中、低劑量（15、10.5、5.25 g/kg）組，每組20只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），模型組ig等體積生理鹽水，給藥30 min后，各組小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg），隨即觀察小鼠行為狀態(tài)，小鼠醉酒以翻正反射消失為標(biāo)準(zhǔn)：小鼠背向下的姿勢保持30 s以上，則認(rèn)為翻正反射消失，即為醉酒，計(jì)算各組小鼠醉酒率。記錄各組小鼠醉酒潛伏期時(shí)間（從ig白酒到翻正反射消失的時(shí)間）和睡眠時(shí)間。以小鼠ig白酒的時(shí)間開始計(jì)時(shí)觀察8 h，若8 h后醉酒狀態(tài)仍然未恢復(fù)的小鼠，按照480 min進(jìn)行計(jì)算。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)中荊防顆粒3個(gè)劑量組對急性醉酒模型小鼠醉酒率的影響結(jié)果，選擇具有明顯效應(yīng)的2個(gè)劑量開展后續(xù)醉酒小鼠在棒時(shí)間及胃黏膜損傷實(shí)驗(yàn)研究，并重復(fù)觀察小鼠醉酒率。

醉酒率＝醉酒小鼠只數(shù)/該組小鼠總只數(shù)

2.2 荊防顆粒預(yù)防給藥對醉酒小鼠在棒時(shí)間及胃黏膜損傷的影響

SPF級昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為4組，雌雄各半，其中對照組8只，4個(gè)處理時(shí)間批次（給酒后30、60、90、120 min）的模型組50只、荊防顆粒15 g/kg組40只及荊防顆粒10.5 g/kg組40只。各組小鼠禁食不禁水12 h后，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），模型組ig等體積生理鹽水，給藥30 min后，除對照組外，其余各組小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg），對照組ig等體積的生理鹽水。ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg）10 min后將未進(jìn)入醉酒狀態(tài)的小鼠放在轉(zhuǎn)棒儀上，觀察記錄小鼠在棒時(shí)間，觀察時(shí)間為2 min，超過2 min未掉下者按2 min計(jì)，同法觀察對照組小鼠ig生理鹽水10 min后的在棒時(shí)間。4個(gè)處理時(shí)間批次的小鼠分別于給酒后30、60、90、120 min處死并剖取胃，結(jié)扎胃部賁門和幽門，以2 mL 10%福爾馬林固定5 min后，沿胃大彎剖開，觀察酒精對胃黏膜的影響。對照組小鼠同法取樣觀察。采用半定量分析方法，損傷程度按照整個(gè)胃黏膜中肉眼觀察到的胃出血點(diǎn)數(shù)目作為分級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 胃黏膜肉眼觀察評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 荊防顆粒預(yù)防給藥對醉酒小鼠酒精代謝酶活性及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

SPF級昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為5組，雌雄各半，分別為對照組8只，模型組12只，荊防顆粒高、低劑量（15、10.5 g/kg）組各12只和NAC（300 mg/kg）組12只。小鼠禁食不禁水12 h后，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig等體積生理鹽水，給藥1 h（依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果）后，除對照組外，其余各組小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg），對照組ig等體積的生理鹽水。ig白酒1 h（酒后30～60 min血液乙醇濃度可達(dá)高峰[10]）后小鼠眼眶取血并頸椎脫臼處死，剖取肝臟、胃組織將其凍存?zhèn)溆?。取肝臟、胃組織，按試劑盒說明書加入提取液，進(jìn)行組織研磨，制成10%組織勻漿，檢測肝組織中ADH、CAT活力以及肝、胃組織中NAD+/NADH值。

加入RIPA裂解液提取肝組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)等濃度后，加上樣緩沖液使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%牛血清白蛋白溶液封閉90 min，分別加入一抗ADH1（1∶1000）、CYP2E1（1∶1000）、ALDH2（1∶2000）、LC3（1∶1000）、p62（1∶1000）、β-actin（1∶2000）、GAPDH（1∶2000）、β-tubulin（1∶2000），4 ℃孵育過夜，洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶5000）孵育90 min，再次洗膜后在顯影成像儀中顯色曝光，采用Image Lab 6.0.1軟件分析條帶。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 荊防顆粒預(yù)防給藥對小鼠的解酒作用

以小鼠ig白酒至翻正反射消失的時(shí)間為醉酒潛伏期，翻正反射消失至翻正反射恢復(fù)的時(shí)間為小鼠睡眠時(shí)間。如表2所示，模型組小鼠的醉酒率為90%，而荊防顆粒（15、10.5、5.25 g/kg）組小鼠的醉酒率分別為0、25%、75%，表明荊防顆粒預(yù)防給藥具有一定解酒作用，尤以15、10.5 g/kg劑量組效果明顯。后續(xù)在棒時(shí)間實(shí)驗(yàn)中重復(fù)觀察了15、10.5 g/kg劑量組小鼠的醉酒率，結(jié)果表明模型組小鼠醉酒率為90%，而荊防顆粒15、10.5 g/kg劑量組小鼠醉酒率分別為7.31%、10%；進(jìn)一步在解酒機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)中，再次觀察荊防顆粒對小鼠醉酒率的影響，結(jié)果表明模型組、荊防顆粒15、10.5 g/kg以及NAC組的醉酒率分別為75%、8%、17%和67%。綜上，荊防顆粒15、10.5 g/kg預(yù)防給藥具有明確解酒作用，能顯著降低醉酒率。

表2 荊防顆粒對小鼠醉酒率及醉酒時(shí)間的影響(, n = 20)

與模型組比較：###＜0.001

###< 0.001model group

3.2 荊防顆粒預(yù)防給藥對小鼠在棒時(shí)間的影響

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)主要檢測嚙齒類動物運(yùn)動功能，當(dāng)其中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害或藥物對其運(yùn)動協(xié)調(diào)功能產(chǎn)生影響時(shí)，可通過測量動物在滾筒上行走的持續(xù)時(shí)間評定。小鼠過量飲酒后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)被抑制，協(xié)調(diào)性會變差，致使小鼠很快從轉(zhuǎn)棒上掉落，在棒時(shí)間縮短。如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠ig白酒10 min后，在轉(zhuǎn)棒儀上的時(shí)間明顯縮短（＜0.001），提示動物出現(xiàn)步態(tài)、平衡功能障礙；與模型組比較，荊防顆粒能延長模型小鼠的在棒時(shí)間。

3.3 荊防顆粒對醉酒小鼠胃黏膜的影響

急性大量飲酒會直接損傷胃黏膜，甚至造成胃出血，因此在解酒實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察荊防顆粒對胃黏膜的保護(hù)作用。如圖1和表4所示，與模型組比較，小鼠ig白酒后30、60、90、120 min，荊防顆粒15、10.5 g/kg劑量組小鼠胃黏膜損傷程度有明顯減輕表現(xiàn)（＜0.05、0.01、0.001），小鼠胃黏膜出血表現(xiàn)有所緩解，出血點(diǎn)數(shù)顯著降低。

表3 荊防顆粒對小鼠ig白酒10 min后在棒時(shí)間的影響()

與對照組比較：***＜0.001

***< 0.001control group

圖1 荊防顆粒對醉酒小鼠胃黏膜損傷的影響

表4 荊防顆粒對醉酒小鼠胃黏膜損傷的影響()

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001model group, same as below tables

3.4 荊防顆粒對醉酒小鼠肝、胃組織NAD+/NADH值的影響

NAD是存在于所有細(xì)胞中的一種輔酶，包括NAD+（氧化型）和NADH（還原型）2種形式。乙醇代謝過程中，其首先在ADH的作用下氧化成乙醛，此過程中NAD+被還原成NADH。因此通過比較各組NAD+/NADH值，可間接判斷ADH活力。如表5所示，與模型組比較，荊防顆粒（15、10.5 g/kg）組胃組織NAD+/NADH值均顯著降低（＜0.05），荊防顆粒（15 g/kg）組小鼠肝組織NAD+/ NADH值顯著降低（＜0.05），說明荊防顆粒促進(jìn)了NAD+向NADH的轉(zhuǎn)化，增加了NADH，表明藥物可提高ADH對乙醇的代謝能力。

3.5 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH、CAT活性的影響

ADH是機(jī)體代謝酒精最主要的酶，荊防顆?？纱龠M(jìn)NAD+被還原成NADH，提示藥物對該酶活性有提高作用；CAT分布非常廣泛，在肝臟、腎臟和紅細(xì)胞中水平高，是清除能導(dǎo)致氧化損傷的過氧化氫的主要場所，乙醇代謝過程中，CAT也參與部分乙醇代謝，同時(shí)生成水和氧氣。因此對醉酒小鼠肝組織ADH、CAT活力進(jìn)行檢測。如表6所示，與模型組比較，各給藥組均可提高小鼠肝組織ADH活力，其中荊防顆粒15 g/kg組具有顯著性差異（＜0.05），表明荊防顆粒解酒作用的發(fā)揮確與提高ADH活力有關(guān)；同時(shí)各給藥組均能顯著提高CAT活力（＜0.01、0.001），提示荊防顆粒還可通過提高機(jī)體抗氧化能力發(fā)揮解酒作用。

表5 荊防顆粒對醉酒小鼠胃、肝組織NAD+/NADH值的影響()

表6 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH和CAT活性的影響()

3.6 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響

ALDH是酒精氧化途徑的第2步，也是代謝引起酒精中毒關(guān)鍵分子——乙醛的唯一酶。當(dāng)血液及組織液中的酒精濃度＞10 mmol/L時(shí)，微粒體乙醇氧化系統(tǒng)也參與酒精代謝[11]，其中CYP2E1是該系統(tǒng)中研究最多的酒精代謝酶。因此在明確荊防顆粒對ADH、CAT活性的調(diào)節(jié)作用后，進(jìn)一步觀察荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織中ADH1、ALDH2、CYP2E1蛋白表達(dá)的影響，如圖2和表7所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中ADH1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），說明單次過量飲酒可能抑制肝臟正常酒精代謝；與模型組比較，15 g/kg荊防顆粒顯著升高醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能通過上調(diào)ADH、ALDH的表達(dá)以促進(jìn)酒精代謝。此外，模型組小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01），提示過量飲酒會誘導(dǎo)CYP2E1參與肝臟酒精代謝，而該代謝過程伴隨活性氧（reactive oxidative species，ROS）的產(chǎn)生；荊防顆粒和NAC能顯著逆轉(zhuǎn)該表現(xiàn)（＜0.01、0.001），說明荊防顆粒對過量飲酒導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可能具有一定緩解作用。

3.7 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織自噬通路LC3及p62蛋白表達(dá)的影響

如圖3和表8所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織內(nèi)LC3Ⅱ/LC3I升高，提示急性醉酒模型小鼠肝細(xì)胞的自噬可能被激活，啟動一定代償保護(hù)效應(yīng)；與模型組比較，荊防顆粒組LC3Ⅱ/LC3I顯著升高（＜0.01），表明荊防顆粒解酒作用的發(fā)揮可能與激活自噬清除異物有關(guān)。與對照組比較，醉酒小鼠肝組織中p62蛋白表達(dá)上調(diào)（＜0.05），提示模型小鼠肝組織的自噬-溶酶體降解存在障礙；與模型組比較，荊防顆粒能顯著促進(jìn)自噬小體的降解，明顯下調(diào)p62蛋白表達(dá)（＜0.05）。提示在急性醉酒狀態(tài)下，荊防顆?？杉せ钭允刹⒋龠M(jìn)自噬小體降解加速酒精代謝，從而發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

圖2 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2和CYP2E1蛋白表達(dá)的影響

表7 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2和CYP2E1蛋白表達(dá)的影響()

圖3 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表8 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響()

4 討論

無論發(fā)達(dá)還是非發(fā)達(dá)國家，飲酒是常見的大眾行為之一[12]，尤其是當(dāng)下生活壓力日益增長，飲酒更成為大多數(shù)人排解壓力的方法之一。但飲酒過量，同樣會對身體健康造成危害。近年來，急性酒精中毒在臨床上也越來越常見。急性酒精中毒，俗稱醉酒[13]，中醫(yī)病名“酒毒”。醉酒是指飲酒過量所引起的急性臟腑功能受損，并出現(xiàn)惡心嘔吐、脅腹脹滿、易怒易激、行走不穩(wěn)或譫妄昏迷等癥狀，屬中醫(yī)常見急癥，嚴(yán)重者可發(fā)生呼吸循環(huán)衰竭，最終導(dǎo)致死亡[14]。目前臨床上治療急性酒精中毒的藥物主要有利尿藥、蛋白肽類藥、提高酒精代謝酶活性類藥及護(hù)肝養(yǎng)胃類中藥4種[15]，然而并無明確適合大眾日常生活中有效便捷的解酒藥物。已有研究發(fā)現(xiàn)荊防敗毒散加減及荊防敗毒散現(xiàn)代制劑荊防顆粒有良好的解酒防醉作用[6-7]，本研究在前期研究基礎(chǔ)上開展其解酒作用與機(jī)制研究，進(jìn)一步豐富其解酒作用研究內(nèi)容，為其臨床應(yīng)用拓展與二次開發(fā)提供一定藥理學(xué)依據(jù)。

小鼠過量飲酒初期呈現(xiàn)呼吸、心率加快等興奮表現(xiàn)，繼而出現(xiàn)體態(tài)不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)，最后進(jìn)入昏睡狀態(tài)[16]。實(shí)驗(yàn)中常以翻正反射消失作為判斷小鼠是否出現(xiàn)急性酒精中毒（醉酒）表現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)，即小鼠保持背向下姿勢＞30 s不恢復(fù)可稱為醉酒。此外大量飲酒亦會造成動物胃黏膜急性損傷[17]。因目前尚未見性激素對酒精代謝影響的報(bào)道，且飲酒行為男女均有，故研究中選用雌雄各半的小鼠開展荊防顆粒的解酒實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明荊防顆粒能顯著降低小鼠的醉酒率，延長小鼠醉酒潛伏期，表現(xiàn)出解酒作用，同時(shí)給藥組無小鼠死亡表現(xiàn)，提示藥物具有保護(hù)作用；進(jìn)一步轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)表明荊防顆?？裳娱L小鼠的在棒時(shí)間，且通過肉眼觀察評分發(fā)現(xiàn)荊防顆粒組小鼠胃黏膜出血點(diǎn)明顯少于模型組小鼠，結(jié)合前期研究結(jié)果荊防顆粒能顯著降低醉酒小鼠血清乙醇含量[7]，可認(rèn)為荊防顆粒具有解酒防醉作用，并對大量飲酒所致的胃黏膜損傷有一定保護(hù)作用。

肝臟是酒精代謝主要器官，通過幾種代謝酶和非酶機(jī)制將90%以上攝入的酒精代謝成乙醛，隨后乙醛進(jìn)一步被線粒體中的ALDH2和細(xì)胞質(zhì)中的ALDH1氧化為醋酸，最后醋酸經(jīng)三羧酸循環(huán)，徹底氧化為水和二氧化碳排出體外，少部分生成蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)被機(jī)體利用[18]。肝臟中酒精主要經(jīng)ADH、CAT、CYP2E1 3種酶代謝生成為乙醛。ADH是一種位于胞質(zhì)中的鋅依賴性酶，其中I類ADH在肝、胃、腎和結(jié)腸等組織中表達(dá)水平較高，其使用NAD+作為輔助因子，參與肝臟中大部分酒精的氧化。ADH對乙醇的代謝受ADH酶、副產(chǎn)物乙醛水平以及細(xì)胞質(zhì)中NADH與NAD+比率的調(diào)節(jié)[11]。CAT雖然在酒精代謝過程中貢獻(xiàn)較小，但能以H2O2依賴的方式將乙醇氧化為乙醛，研究表明乙醇長期喂養(yǎng)后可使大鼠肝臟CAT活性增加[19]。本研究結(jié)果顯示，荊防顆粒顯著促進(jìn)醉酒模型小鼠肝、胃組織中NAD+向NADH的轉(zhuǎn)化，并提高肝組織ADH的活性以及ADH1蛋白表達(dá)量；同時(shí)顯著提高模型小鼠肝組織CAT活性。由此可認(rèn)為，荊防顆粒能通過提高ADH、CAT對酒精的代謝能力，來加快肝臟對酒精的代謝速率，從而發(fā)揮良好的解酒防醉作用。此外，酒精可被微粒體乙醇氧化體系氧化，該系統(tǒng)主要涉及CYP2E1[20]，另外2種細(xì)胞色素CYP1A2和CYP3A4對微粒體乙醇氧化體系也有貢獻(xiàn)，但影響程度較弱[21]。CYP2E1主要在血液酒精濃度較高或長期飲酒的酒精代謝中發(fā)揮重要作用，其參與酒精代謝的同時(shí)還會促進(jìn)羥乙基自由基（HER）、羥自由基（OH?）和超氧化物（O2?）等一系列ROS的產(chǎn)生，被認(rèn)為是酒精誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要因素之一[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織CYP2E1表達(dá)顯著升高，結(jié)合模型小鼠肝組織ADH1表達(dá)下降表現(xiàn)，提示過量飲酒后CYP2E1被誘導(dǎo)表達(dá)增加，主要負(fù)責(zé)肝臟中酒精代謝，然而作為肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要貢獻(xiàn)者，以CYP2E1為主導(dǎo)的酒精代謝對肝臟是不利的。荊防顆粒對模型小鼠肝臟CYP2E1表達(dá)有明顯下調(diào)表現(xiàn)，提示其可抑制CYP2E1代謝途徑，由此緩解過量飲酒引起的氧化應(yīng)激所致?lián)p傷。ALDH2在代謝飲酒產(chǎn)生的乙醛及減輕氧化應(yīng)激下脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物4-羥基壬烯酸的毒性中均發(fā)揮著重要作用[23]，本研究結(jié)果表明荊防顆粒能顯著提高模型小鼠肝組織ALDH2表達(dá)量，提示該顆粒在促進(jìn)乙醇氧化的同時(shí)還可加速機(jī)體內(nèi)乙醛代謝，呈現(xiàn)解酒保肝作用。荊防顆粒對肝臟中包括ADH、CAT、CYP2E1、ALDH在內(nèi)的酒精代謝酶調(diào)節(jié)作用如圖4所示。

圖4 荊防顆粒對肝臟酒精代謝酶影響的機(jī)制圖

氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的ROS被認(rèn)為是自噬的激活物，能夠參與誘導(dǎo)自噬的啟動，另一方面自噬可作為緩沖系統(tǒng)來控制ROS的水平[24]。前期研究表明荊防顆粒可激活急性醉酒模型小鼠肝組織PI3K/Akt信號通路發(fā)揮解酒作用[7]，而已有研究證實(shí)肝損傷模型中激活的PI3K/Akt信號通路可上調(diào)自噬[25]，且本實(shí)驗(yàn)中的急性醉酒模型小鼠肝臟CYP2E1蛋白表達(dá)異常升高，而該酶參與酒精代謝的同時(shí)會伴隨過量ROS的產(chǎn)生，引起氧化失衡，誘導(dǎo)自噬來緩沖控制ROS的損傷?；诖诉M(jìn)一步觀察荊防顆粒對模型小鼠肝組織自噬的影響，結(jié)果顯示荊防顆?？娠@著升高LC3Ⅱ/LC3I值表現(xiàn)出激活自噬，并顯著下調(diào)p62蛋白表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)自噬小體降解的作用，從而發(fā)揮保護(hù)肝臟作用，研究結(jié)果亦與以往結(jié)果[7]吻合。

綜上，荊防顆粒能顯著降低醉酒小鼠醉酒率，并保護(hù)過量飲酒造成的胃黏膜損傷，其解酒作用的發(fā)揮與提高肝、胃組織ADH對酒精的轉(zhuǎn)化效率，升高肝組織中ADH、ALDH、CAT的表達(dá)或活力，促進(jìn)乙醛代謝，對抗過量飲酒誘發(fā)的氧化應(yīng)激，及激活肝組織自噬與促進(jìn)自噬小體降解有關(guān)。研究結(jié)果初步明確了荊防顆粒解酒防醉的作用機(jī)制，同時(shí)提示對急性酒精性肝損傷可能具有保護(hù)作用。然而，本研究存在一些不足之處，如未涉及更多酒精誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)，后續(xù)可進(jìn)一步補(bǔ)充荊防顆?？寡趸慕饩谱饔脵C(jī)制研究，以豐富荊防敗毒散及其制劑荊防顆粒的現(xiàn)代藥理研究內(nèi)容。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-drinking effect and mechanism of Jingfang Granules on acute drunkenness model mice

GAO Ming1, 2, ZHANG Xia1, 2, LUO Dai-min1, 2, YANG Ruo-cong1, 2, RAO Zhi-li1, 2, ZENG Nan1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China 2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To investigate the anti-drinking effect and mechanism of Jingfang Granules (荊防顆粒) by establishing a mouse model of drunkenness.Male and female half SPF grade Kunming mice were randomly divided into model group and Jingfang Granules group. After ig saline in model group and ig Jingfang Granules in Jingfang Granules group for 30 min, mice were ig liquor (17 mL/kg) to establish an acute intoxication model. The intoxication latency and sleep time of each group were evaluated by the disappearance/recovery time of righting reflex, and intoxication rate was calculated. The stick-turning experiment was conducted to observe the in-stick time of the mice after taking liquor for 10 min and to observe the damage to the gastric mucosa of the mice. Based on an acute intoxication mouse model, the effect of Jingfang Granules on alcohol metabolism enzymes such as alcohol dehydrogenase (ADH), catalase (CAT), cytochrome P450 second family E subtype polypeptide 1 (CYP2E1) and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) in liver tissue of mice were evaluated; Effect of Jingfang Granules on the expression of proteins related to the autophagy pathway were observed by Western blotting.Compared with model group, Jingfang Granules reduced the rate of intoxication and prolonged the time of mice on the stick, and alleviated the gastric mucosal damage, which showed the effect of an alcohol reliever; Jingfang Granules significantly increased ADH and CAT activity in liver tissues of model mice (< 0.05, 0.01, 0.001), reversed the increase in CYP2E1 expression caused by excessive alcohol consumption (< 0.001), and increased the expression of ADH1 and ALDH2 in liver tissue of model mice (< 0.05, 0.01), significantly up-regulated the expression ratio of microtubule-associated protein1 light chain 3Ⅱ (LC3II)/LC3I in liver tissue (< 0.01) and reduced the expression of p62 protein (< 0.05).Jingfang Granules could reduce the rate of intoxication in mice, and improve the manifestation of central inhibition and gastric mucosal damage caused by excessive alcohol consumption, which presents an antidotal effect. Its mechanism may be related to increasing the activity or expression of alcohol-metabolizing enzymes such as ADH, CAT and ALDH, which accelerate alcohol metabolism and activate autophagy to alleviate the CYP2E1-induced damage.

detoxification; Jingfang Granules; alcohol metabolism; autophagy; acute drunkenness model mice

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1164 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.016

2022-09-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074094）；西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究基金項(xiàng)目（2020XSGG002）

高 銘，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚砼c毒理。E-mail: 1500972433@qq.com

曾 南，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理和毒理學(xué)研究。E-mail: zengnan966@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]