張澤康，張 晴，竇敏航，王昌海，趙玥瑛，席 鋮，張馨雨，孫 萌，董 爽，杜守穎，白 潔，陸 洋

經(jīng)典名方陽(yáng)和湯指紋圖譜及功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

張澤康，張 晴，竇敏航，王昌海，趙玥瑛，席 鋮，張馨雨，孫 萌，董 爽，杜守穎，白 潔*，陸 洋*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

基于指紋圖譜及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，建立陽(yáng)和湯指紋圖譜檢測(cè)方法，并對(duì)其功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為陽(yáng)和湯質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。采用HPLC建立陽(yáng)和湯指紋圖譜，對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬和指認(rèn)，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建陽(yáng)和湯“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，進(jìn)一步佐證陽(yáng)和湯功效成分選擇的合理性。陽(yáng)和湯的HPLC指紋圖譜共標(biāo)定15個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出2號(hào)峰5-羥甲基糠醛、5號(hào)峰芥子堿硫氰酸鹽、8號(hào)峰甘草苷、9號(hào)峰毛蕊花糖苷、11號(hào)峰肉桂酸、12號(hào)峰桂皮醛、13號(hào)峰甘草酸、15號(hào)峰鹽酸麻黃堿8個(gè)共有色譜峰，相似度均＞0.83，主要藥效物質(zhì)群可以從藥材-飲片-基準(zhǔn)樣品逐級(jí)較為完整的傳遞，且歸屬關(guān)系清晰明確；采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)篩選出的8個(gè)活性成分進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，富集的通路中包括癌癥信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等。根據(jù)成分、靶點(diǎn)以及通路之間的連接度，初步預(yù)測(cè)甘草酸、甘草苷、桂皮醛、肉桂酸、毛蕊花糖苷、芥子堿硫氰酸鹽、鹽酸麻黃堿7個(gè)活性成分可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路達(dá)到溫陽(yáng)補(bǔ)血、散寒通滯的作用。通過(guò)HPLC指紋圖譜結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)陽(yáng)和湯治療疾病的潛在功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，建立的方法操作便捷，穩(wěn)定性好，可用于陽(yáng)和湯的質(zhì)量控制，也為深入研究陽(yáng)和湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和作用機(jī)制提供參考。

經(jīng)典名方；陽(yáng)和湯；指紋圖譜；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)；芥子堿硫氰酸鹽；5-羥甲基糠醛；甘草苷；毛蕊花糖苷；肉桂酸；桂皮醛；甘草酸；鹽酸麻黃堿

經(jīng)典名方是我國(guó)歷代醫(yī)家智慧的結(jié)晶，為推動(dòng)經(jīng)典名方現(xiàn)代化，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2020年發(fā)布了《中藥注冊(cè)分類及申報(bào)資料要求》[1]通告，其中將中藥注冊(cè)分類中的第3類古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑細(xì)分為“3.1按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑”及“3.2其他來(lái)源于古代經(jīng)典名方的中藥復(fù)方制劑（以下簡(jiǎn)稱‘3.2類’）”，3.2類包括未按古代經(jīng)典名方目錄管理的古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑和基于古代經(jīng)典名方加減化裁的中藥復(fù)方制劑，加強(qiáng)了對(duì)古典醫(yī)籍精華的梳理和挖掘。為保證經(jīng)典名方復(fù)方制劑質(zhì)量療效一致性，需構(gòu)建藥材、飲片、基準(zhǔn)樣品、制劑全過(guò)程的質(zhì)量控制體系；為建立系統(tǒng)全面的質(zhì)量檢測(cè)方法，指紋圖譜被列為質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)；為保障質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的科學(xué)性，需確認(rèn)影響其品質(zhì)的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)[2]。陽(yáng)和湯出自清代王洪緒所著《外科證治全生集》，由熟地黃、鹿角膠、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草7味藥組成，具有溫陽(yáng)補(bǔ)血、散寒通滯的功效，主治陰疽。在現(xiàn)代臨床中，陽(yáng)和湯及其加減方常用于治療乳腺癌等惡性腫瘤。

近年來(lái)，對(duì)于陽(yáng)和湯的研究主要集中在對(duì)乳腺癌、糖尿病足病、心血管系統(tǒng)疾病、骨關(guān)節(jié)疾病等患者臨床療效的研究以及治療機(jī)制的探討，而關(guān)于其質(zhì)量控制方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少，僅有竇建衛(wèi)等[3-6]從成分定量分析、薄層色譜定性鑒別等方法對(duì)陽(yáng)和湯全方中的部分單味藥進(jìn)行了質(zhì)量研究，方法較為常規(guī)，且存在不足，如單味藥基原、處方劑量等均缺乏考證，質(zhì)量控制研究?jī)H從單味藥出發(fā)，缺乏對(duì)復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)綜合作用的觀念等?；诖?，本課題借鑒《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見(jiàn)稿）》[7]相關(guān)內(nèi)容，從整體性出發(fā)建立了陽(yáng)和湯藥材、飲片及基準(zhǔn)樣品的HPLC指紋圖譜，并整合多學(xué)科技術(shù)方法，基于可測(cè)性、可追溯性、有效性綜合預(yù)測(cè)，分析陽(yáng)和湯治療陽(yáng)虛寒痰凝聚的功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)，為后期陽(yáng)和湯復(fù)方制劑全方位的質(zhì)量控制及其作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Fisher U3000高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，CM7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BSA 224S萬(wàn)分之一電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；JM-B100002十萬(wàn)分之一電子天平，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；H22-X3型九陽(yáng)電陶爐，杭州九陽(yáng)生活電器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FD-2A真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DZF-6051型真空干燥器，北京利康達(dá)圣科技有限公司。

1.2 試藥

對(duì)照品5-羥甲基糠醛（批號(hào)H12M9Z61023，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%）、桂皮醛（批號(hào)110710-202022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%）、肉桂酸（批號(hào)110786-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）、芥子堿硫氰酸鹽（批號(hào)111702- 202006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、鹽酸麻黃堿（批號(hào)171241-201809，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）、甘草苷（批號(hào)111610-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-202021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、磷酸，色譜純，美國(guó)Fisher公司；甲醇、三乙胺，分析純，北京化工廠；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；其他試劑均為分析純。

陽(yáng)和湯由熟地黃、鹿角膠、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭和甘草7味藥組成，其藥材均購(gòu)自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)。生地黃、肉桂、芥子、麻黃、干姜和甘草藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定，分別為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根、樟科樟屬植物肉桂Presl的干燥樹(shù)皮、十字花科白芥屬植物白芥L.的干燥成熟種子、麻黃科麻黃屬植物草麻黃Stapf的干燥草質(zhì)莖、姜科姜屬植物姜Rosc.的干燥根莖、豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖。

本實(shí)驗(yàn)前期已按照《中國(guó)藥典》2020年版各單味藥材項(xiàng)下的檢測(cè)方法對(duì)藥材進(jìn)行檢測(cè)，含量均符合要求。按照《中國(guó)藥典》2020年版各單味藥材項(xiàng)下的飲片炮制要求炮制成肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭及甘草飲片（熟地黃、鹿角膠飲片由健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供）。經(jīng)檢測(cè)飲片均符合《中國(guó)藥典》2020年版項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定。利用隨機(jī)數(shù)表法將熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草6味飲片的不同批次隨機(jī)組合，陽(yáng)和湯批次組合具體信息見(jiàn)表1（其中15批次陽(yáng)和湯組合信息中鹿角膠的批號(hào)均為20210901）。

表1 陽(yáng)和湯組合信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺溶液），梯度洗脫：0～5 min，2%～3%乙腈；5～15 min，3%～5%乙腈；15～65 min，5%～30%乙腈；65～90 min，30%～70%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210、260 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇配制成含5-羥甲基糠醛17.90 μg/mL、毛蕊花糖苷17.72 μg/mL、桂皮醛22.64 μg/mL、肉桂酸13.47 μg/mL、芥子堿硫氰酸鹽19.88 μg/mL、鹽酸麻黃堿19.78 μg/mL、甘草苷15.60 μg/mL、甘草酸14.60 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

根據(jù)本課題組前期確定的處方比例[8]稱取7味飲片量：熟地黃37.3 g、鹿角膠11.2 g、肉桂3.7 g、炒白芥子7.5 g、麻黃1.9 g、姜炭1.9 g、甘草3.7 g。置陶瓷鍋中，加水450 mL，以武火（600 W）煮沸后，調(diào)節(jié)火力至200 W煎煮30 min，趁熱用300目無(wú)紡布濾過(guò)，藥渣再加水336 mL，同法煎煮30 min，合并2次濾液（將鹿角膠烊化至濾液中），放涼后加水調(diào)整體積至600 mL，精密移取煎液5 mL于20 mL西林瓶中，置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h，凍干溫度?80 ℃，真空度（5±1）Pa。取出壓蓋密塞，即得陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉。

取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉適量，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，室溫放置10 min，于10 000 r/min離心5 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 參照峰選擇 在本實(shí)驗(yàn)所建立的指紋圖譜中，芥子堿硫氰酸鹽化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，峰面積居中且穩(wěn)定、分離度佳、峰形對(duì)稱、保留時(shí)間適中，因此，選擇芥子堿硫氰酸鹽為參照峰（s），以計(jì)算其余峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.75%，相對(duì)峰面積RSD均＜2.10%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜小于0.23%，相對(duì)峰面積RSD均＜3.05%，表明該方法的重復(fù)性良好，可用于陽(yáng)和湯指紋圖譜的檢測(cè)。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.12%，相對(duì)峰面積RSD均＜2.34%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取15批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液與對(duì)照品溶液按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。通過(guò)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件，以S1為參照峰，采用中位數(shù)法，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，得到15批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜疊加圖、共有模式圖和混合對(duì)照品圖，共確認(rèn)15個(gè)共有峰，指認(rèn)8個(gè)色譜峰。結(jié)果見(jiàn)圖1、2。

與對(duì)照指紋圖譜相比，11批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的相似度均＞0.90，表明陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的相似度良好，主要物質(zhì)群差異性小，制備工藝較為科學(xué)合理，形成的基準(zhǔn)樣品對(duì)照?qǐng)D譜能夠作為衡量陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)參照物，結(jié)果見(jiàn)表2。其中S1、S5、S6、S15相似度較低，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)[8]，熟地黃飲片中5-羥甲基糠醛的含量對(duì)相似度結(jié)果影響較大，因此，后期研究中需嚴(yán)格控制熟地黃飲片的質(zhì)量，從而保證陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的整體質(zhì)量。

2.6 陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜共有峰的歸屬

按供試品制備方法分別制備單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液和陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品供試品溶液。取陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品、單味飲片、缺單味飲片供試品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。分別將陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品、單味飲片、缺單味飲片供試品溶液的色譜圖進(jìn)行疊加比較，對(duì)陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜的色譜峰進(jìn)行歸屬分析，結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。

圖1 15批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的指紋圖譜疊加圖

2-5-羥甲基糠醛 5-芥子堿硫氰酸鹽 8-甘草苷 9-毛蕊花糖苷 11-肉桂酸 12-桂皮醛 13-甘草酸 15-鹽酸麻黃堿

表2 15批陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品HPLC指紋圖譜相似度

根據(jù)圖3和表3對(duì)陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜中各共有峰進(jìn)行歸屬分析，陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜共確認(rèn)15個(gè)色譜峰，均可以在原料飲片中找到明確歸屬。具體歸屬情況為1、2、9號(hào)峰歸屬于熟地黃飲片；11、12號(hào)峰歸屬于肉桂飲片；3～7號(hào)峰歸屬于炒白芥子飲片；15號(hào)峰歸屬于麻黃飲片；8、10、13、14號(hào)峰歸屬于甘草飲片。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)8個(gè)色譜峰，分別為2號(hào)峰5-羥甲基糠醛、5號(hào)峰芥子堿硫氰酸鹽、8號(hào)峰甘草苷、9號(hào)峰毛蕊花糖苷、11號(hào)峰肉桂酸、12號(hào)峰桂皮醛、13號(hào)峰甘草酸和15號(hào)峰鹽酸麻黃堿，主要藥效成分的指認(rèn)率為53.3%。綜上可知，陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的物質(zhì)群可清晰的追溯到飲片，且色譜峰歸屬明確，指認(rèn)率較高。

從色譜峰個(gè)數(shù)與峰強(qiáng)度看，炒白芥子對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)最大，甘草、熟地黃、肉桂和麻黃對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)度依次遞減，姜炭對(duì)指紋圖譜的貢獻(xiàn)最低。姜炭主要含揮發(fā)油類，其指標(biāo)性成分6-姜辣素在飲片炮制過(guò)程中損失嚴(yán)重，導(dǎo)致含量大幅度下降，在陽(yáng)和湯煎煮過(guò)程中由飲片轉(zhuǎn)移至凍干粉的量極少，在此色譜條件下未檢測(cè)出色譜峰。因此，姜炭飲片在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下難以獲得指紋圖譜信息。

2.7 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的陽(yáng)和湯功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

2.7.1 基于可測(cè)性及可追溯性的活性成分篩選 根據(jù)文獻(xiàn)研究，熟地黃為陽(yáng)和湯君藥，其主要活性成分為環(huán)烯醚萜類和苯乙醇類化合物，包括梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、地黃多糖等，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂、提高免疫、抗心肌缺血及保護(hù)中樞神經(jīng)等藥理作用[9]；鹿角膠的主要活性成分為動(dòng)物蛋白、氨基酸和微量元素（鈣、鎂、鋅、鐵、銅、錳等）等，具有補(bǔ)血活血、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[10]；肉桂的主要活性成分為揮發(fā)油類，具有抗菌抗炎、抗病毒等藥理作用[11]；炒白芥子的主要活性成分為白芥子苷及其衍生物和脂肪酸類等，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[12]；麻黃的主要活性成分為生物堿類，具有發(fā)汗、鎮(zhèn)咳平喘、抗菌等藥理作用[13]；姜炭的主要活性成分為姜辣素類，具有止嘔等藥理作用[14]；甘草的主要活性成分為三萜類和黃酮類，具有抗腫瘤、抗菌抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[15]。

圖3 陽(yáng)和湯專屬性色譜圖

表3 陽(yáng)和湯共有峰歸屬

《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)于組方藥的控制主要為熟地黃的地黃苷D，鹿角膠的-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、-脯氨酸，肉桂的桂皮醛，炒白芥子的芥子堿硫氰酸鹽，麻黃的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，姜炭的6-姜辣素，甘草的甘草苷、甘草酸?；谖墨I(xiàn)研究及指紋圖譜的可測(cè)性和可追溯性，確定指紋圖譜中指認(rèn)出的5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、鹽酸麻黃堿、甘草苷、甘草酸8個(gè)活性成分為候選化合物。通過(guò)Pubchem Compound化合物數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）獲取8個(gè)候選化合物的Canonical SMILES編號(hào)，為后續(xù)陽(yáng)和湯“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建做準(zhǔn)備。

2.7.2 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將8個(gè)候選化合物的Canonical SMILES編號(hào)導(dǎo)入swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，獲得8個(gè)候選化合物共涉及469個(gè)作用靶點(diǎn)。將篩選出的469個(gè)作用靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，選擇最高置信度蛋白交互參數(shù)評(píng)分值＞0.9的蛋白互作數(shù)據(jù)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。

將PPI網(wǎng)絡(luò)圖以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，并利用此軟件篩選出度值≥24，介數(shù)中心性和接近中心性均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，經(jīng)篩選得到88個(gè)核心靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.7.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析 將篩選得到的88個(gè)核心靶點(diǎn)利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/gp/index.html）對(duì)其進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。選擇物種為“Homo sapiens”，富集分析均以＜0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO功能富集分析可以用于描述靶點(diǎn)在生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3大層面上的功能，共得到60個(gè)GO條目，如圖5所示，其中BP占20個(gè)，CC占20個(gè)，MF占20個(gè)。BP顯著富集在細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)等過(guò)程；CC顯著富集在膜筏、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、突觸后、膜側(cè)、胞體等區(qū)域；MF顯著富集在激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等功能。在KEGG通路富集分析中，前20條與陽(yáng)和湯相關(guān)度較高的通路如圖6所示，主要涉及癌癥信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、糖尿病性心肌病信號(hào)通路等，表明88個(gè)核心靶點(diǎn)可能是主要通過(guò)調(diào)節(jié)這些通路來(lái)起到治療或干預(yù)疾病的作用。

圖4 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表4 核心靶點(diǎn)性質(zhì)

續(xù)表4

靶點(diǎn)名稱度值介數(shù)中心性接近中心性 ADRB2腎上腺素能受體β（adrenergic receptor β）351 664.133 6330.001 034 PTGS2環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2）904 509.877 0620.001 176 F2凝血酶（thrombin）442 012.113 8390.001 068 MMP9基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9）903 864.770 9270.001 160 ACHE乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase）291 653.416 6710.001 024 PLG胞漿素原（plasminogen）41727.411 1400.001 035 TNF腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）16116 589.169 8230.001 333 DPP4二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV）291 620.029 3710.001 009 NOS3內(nèi)皮型一氧化氮合酶（nitric-oxide synthase, endothelial）712 279.959 3350.001 144 GSR谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase）271 093.391 5050.001 038 SLC6A3多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（dopamine transporter）392 028.972 1150.000 995 HPGDS造血型前列腺素D合成酶（hematopoietic prostaglandin D synthase）684 227.105 1270.001 140 DRD2多巴胺D2受體（dopamine D2 receptor）381 902.568 9330.001 036 GRIN1谷氨酸［NMDA］受體蛋白（glutamate [NMDA] receptor protein）341 710.135 0300.001 019 CNR1大麻素受體1（cannabinoid receptor 1）424 116.451 9400.001 049 CHRM1毒蕈堿乙酰膽堿受體M1（muscarinic acetylcholine receptor M1）261 574.821 3370.000 969 MAOA單胺氧化酶A（monoamine oxidase A）361 134.263 9300.000 962 MAOB單胺氧化酶B（monoamine oxidase B）381 580.851 1770.000 978 GARTGAR轉(zhuǎn)甲酰酶（同源）［GAR transformylase (by homology)］311 244.991 9230.000 950 IL2白介素2（interleukin-2）691 567.120 0350.001 121 TYMS胸苷酸合酶（同源）［thymidylate synthase (by homology)］38930.104 6590.000 976 DHFR二氫葉酸還原酶（同源）［dihydrofolate reductase (by homology)］342 019.182 5120.001 004 LGALS4半乳糖凝集素4（galectin-4）281 557.122 8020.001 025 GSTP1谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase P1）421 555.662 2020.001 046 OPRM1μ阿片受體（μ opioid receptor）271 075.336 7980.000 995 PRKCB蛋白激酶C β（protein kinase C β）451 345.542 8470.001 050 PRKCA蛋白激酶C α（protein kinase C α）581 973.421 3310.001 109 CFTR囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）273 077.063 5340.001 012 NR3C1糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor）643 390.862 2380.001 129 DNMT1DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉(zhuǎn)移酶1［DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1］521 451.665 9610.001 066 AHR芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor）341 302.863 0470.001 059 PGR孕激素受體（progesterone receptor）54992.412 1350.001 105 CYP19A1細(xì)胞色素P450 19A1（cytochrome P450 19A1）31756.166 2350.001 024 RELA核因子NF-κB p65亞基（nuclear factor NF-κB p65 subunit）722 203.598 2700.001 139 RXRA維甲酸X受體α（retinoid X receptor α）331 019.046 7860.001 020 PTK2黏著斑激酶1（focal adhesion kinase 1）54962.624 6800.001 068 CTSB組織蛋白（B和K）［cathepsin (B and K)］381 132.288 9600.001 021 BRD4含溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4）331 076.992 0860.001 003 PRKACAcAMP依賴性蛋白激酶α催化亞基（cAMP-dependent protein kinase α-catalytic subunit）491 996.515 8630.001 062 HDAC2組蛋白脫乙?；?（histone deacetylase 2）48955.463 8070.001 044 HSPA1A熱休克70 kDa蛋白1（heat shock 70 kDa protein 1）411 108.427 3220.001 074 KDM1A賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific histone demethylase 1）381 360.475 4260.000 993 PPP2CA絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A，催化亞基，α亞型（serine/threonine protein phosphatase431 016.475 1950.001 034 2A, catalytic subunit, α isoform） KDM6B賴氨酸專一性脫甲基酶6B（lysine-specific demethylase 6B）281 451.180 6140.000 949 NOS2誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（同源）［nitric oxide synthase, inducible (by homology)］36987.414 7940.001 048

圖5 陽(yáng)和湯核心靶點(diǎn)GO功能富集分析

Fig. 5 Analysis of GO function enrichment of Yanghe Decoction core targets

2.7.4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將篩選得到的陽(yáng)和湯中的8個(gè)活性成分、88個(gè)核心靶點(diǎn)和20條核心通路，運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見(jiàn)圖7。從圖中可以看出，陽(yáng)和湯是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用達(dá)到治療疾病的目的。在8個(gè)活性成分中，除5-羥甲基糠醛外，甘草酸、甘草苷、桂皮醛、肉桂酸、毛蕊花糖苷、芥子堿硫氰酸鹽和鹽酸麻黃堿7個(gè)成分有較高的連接度；在88個(gè)核心靶點(diǎn)中，絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、蛋白激酶cAMP激活催化亞基α（protein kinase cAMP- activated catalytic subunit α，PRKACA）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PRKCA）、蛋白激酶C-β（protein kinase C-β，PRKCB）、B細(xì)胞淋巴瘤2樣1（B-cell Lymphoma 2 Like 1，BCL2L1）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的連接度也高于其他靶點(diǎn)；在20條核心通路中，癌癥信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路的連接度相對(duì)較高。

圖6 KEGG富集通路分析結(jié)果

圖7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7.5 整合分析 陽(yáng)和湯主治陰疽，現(xiàn)代臨床治療病癥較為廣泛，在惡性腫瘤[16]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[17]、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病[18]、免疫系統(tǒng)疾病[19]、泌尿系統(tǒng)疾病[20]、骨科[21]及婦科疾病[22]等方面均有顯著療效。在KEGG通路富集分析中顯示，陽(yáng)和湯主要涉及癌癥信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等。惡性腫瘤作為消耗性疾病，患者多以陽(yáng)虛為主，故中醫(yī)治療惡性腫瘤以“溫陽(yáng)通滯”為主[23-24]。

陽(yáng)和湯作為溫陽(yáng)散寒通滯的經(jīng)典方，臨床上治療惡性腫瘤應(yīng)用廣泛，尤其在諸多“陽(yáng)虛型”癌癥患者中療效顯著。研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)和湯通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平[25-26]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路[27]及負(fù)調(diào)控STAT3通路等[28]來(lái)抑制腫瘤增殖并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。此外表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）通路與細(xì)胞周期和代謝緊密相關(guān)[29]，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[30]，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與癌癥的轉(zhuǎn)移[31]等，而陽(yáng)和湯復(fù)方均與上述通路有密切的關(guān)系。高永翔等[32]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、4T1、SK-BR-3細(xì)胞、胃癌MGC-803細(xì)胞均有抑制作用，并能影響細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)也有明顯的抑瘤作用。

缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）信號(hào)通路可加速癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而陽(yáng)和湯可顯著降低HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)[33]，且能抑制乳腺癌細(xì)胞的跨內(nèi)皮能力和血管生成能力，從而起到治療作用。動(dòng)脈粥樣硬化是引起大多數(shù)心血管疾病的主因，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前越來(lái)越多的研究表明，鞘脂信號(hào)通路是脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的相關(guān)作用通路[34]。神經(jīng)酰胺作為神經(jīng)鞘脂代謝通路的中心分子[35]，在動(dòng)脈粥樣硬化的早期形成階段，神經(jīng)酰胺對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用，能夠維持血管張力和血壓穩(wěn)態(tài)。

此外，抑制神經(jīng)鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）活性可降低神經(jīng)鞘磷脂水平，并能有效抑制炎癥刺激下核因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）的激活，而NF-кB是多種致動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)炎癥基因的關(guān)鍵調(diào)控因子[36]。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，高脂飲食背景下的載脂蛋白E基因缺陷小鼠敲除SMS基因后，在降低炎癥反應(yīng)的同時(shí)，也能有效減少動(dòng)脈粥樣硬化病變[37]。自身免疫性甲狀腺炎又稱橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT），HT病變過(guò)程也是炎性細(xì)胞因子異常表達(dá)的過(guò)程，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[38]，陽(yáng)和湯加減方中所含主要活性成分能增加HT患者血清甲狀腺激素濃度，可有效維持甲狀腺激素水平穩(wěn)定，且可顯著降低血清炎性因子表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)。馬丙娥等[39]實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明陽(yáng)和湯可抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroiditis，EAT）大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中STAT3通路激活并改善EAT大鼠的甲狀腺功能，有效降低EAT大鼠血清中甲狀腺抗體水平，緩解甲狀腺炎癥狀。

上述文獻(xiàn)研究表明，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果與現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)較為接近，說(shuō)明該研究方法具有一定的科學(xué)性和可靠性，為近一步闡述陽(yáng)和湯的作用機(jī)制提供了依據(jù)。同時(shí)也與中藥整體性的觀念相吻合，陽(yáng)和湯中多個(gè)活性成分可作用于多個(gè)核心靶點(diǎn)，從而干預(yù)多個(gè)作用通路，起到干預(yù)或治療疾病的作用?；谥讣y圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，甘草酸、甘草苷、桂皮醛、肉桂酸、毛蕊花糖苷、芥子堿硫氰酸鹽和鹽酸麻黃堿7個(gè)成分具有傳遞性和溯源性，且與陽(yáng)和湯的功能屬性密切相關(guān)，可預(yù)測(cè)其為影響陽(yáng)和湯品質(zhì)的潛在功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用凍干粉形式保存基準(zhǔn)樣品，在優(yōu)化供試品溶液條件時(shí)，分別以水、不同比例甲醇（25%、50%、75%）作為復(fù)溶溶劑考察凍干粉的復(fù)溶效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%甲醇作為復(fù)溶溶劑時(shí)，可使凍干粉完全溶解，各成分的相對(duì)峰面積最為接近，因此選擇50%甲醇作為陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品凍干粉的復(fù)溶溶劑；在優(yōu)化色譜條件時(shí)，考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)，不同流動(dòng)相體系［乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）、乙腈-0.05%磷酸水溶液（0.05%三乙胺）］，不同柱溫（25、30、35 ℃）對(duì)色譜峰的影響。通過(guò)以上研究，確立陽(yáng)和湯指紋圖譜的分析方法：選取檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm（5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草苷、甘草酸）、210 nm（鹽酸麻黃堿），流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺），柱溫35 ℃。

經(jīng)典名方藥味眾多，成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)以指紋圖譜為指標(biāo)，全面考察陽(yáng)和湯原料飲片-基準(zhǔn)樣品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的傳遞性。結(jié)果顯示，陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品共確認(rèn)15個(gè)峰，指認(rèn)8個(gè)色譜峰，均能在原料飲片中找到明確歸屬。但部分《中國(guó)藥典》2020年版單味藥項(xiàng)下規(guī)定的指標(biāo)性成分未能檢出，其中地黃苷D和鹽酸偽麻黃堿在上述色譜條件下互相干擾，單獨(dú)建立色譜條件進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，分析其3D圖譜，2種成分仍彼此干擾，無(wú)法有效分離；鹿角膠主要成分為氨基酸類物質(zhì)，水溶性大，含量低，且不具備HPLC-UV檢測(cè)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，致使在上述色譜條件下不能檢出；6-姜辣素對(duì)照品在上述色譜條件下可被檢識(shí)，但其飲片在陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品指紋圖譜中貢獻(xiàn)度較低，可能是干姜在炒炭過(guò)程中揮發(fā)性成分極不穩(wěn)定，逐漸揮發(fā)散失。對(duì)于上述存在的問(wèn)題，本課題組后期將進(jìn)一步深入研究，結(jié)合其他質(zhì)量控制方法如超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（針對(duì)熟地黃、鹿角膠、麻黃中未檢出的成分）、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（針對(duì)姜炭中揮發(fā)性成分）等進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。

中藥復(fù)方具有“多成分、多靶點(diǎn)和多途徑”協(xié)同作用的特點(diǎn)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，這與中藥復(fù)方多成分、多途徑和多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理殊途同歸[40]。本實(shí)驗(yàn)將指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，通過(guò)對(duì)經(jīng)典名方陽(yáng)和湯進(jìn)行指紋圖譜研究，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建陽(yáng)和湯的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，不僅對(duì)陽(yáng)和湯質(zhì)量控制指標(biāo)成分的合理性進(jìn)行了驗(yàn)證，而且揭示了陽(yáng)和湯功效關(guān)聯(lián)性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為陽(yáng)和湯發(fā)揮功效及藥理作用機(jī)制的闡釋提供了思路。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍存在一些局限性，后續(xù)仍需要通過(guò)一些藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證以促進(jìn)陽(yáng)和湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局. 關(guān)于發(fā)布《中藥注冊(cè)分類及申報(bào)資料要求》的通告(2020年第68號(hào)) [EB/OL]. [2020-09-27]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/qtggtg/2020092 8164311143.html.

[2] 王璐, 張禮欣, 賈奧蒙, 等. 基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)經(jīng)典名方竹茹湯中葛根的質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)分析[J]. 中草藥, 2021, 52(20): 6197-6207.

[3] 竇建衛(wèi), 尚榮國(guó), 彭湃, 等. 提高陽(yáng)和湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2018, 35(1): 27-29.

[4] 竇建衛(wèi), 朱宇紅, 王紅英, 等. 陽(yáng)和湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [J]. 陜西中醫(yī), 2017, 38(11): 1598-1599.

[5] 朱宇紅, 劉甲平, 尚榮國(guó), 等. 陽(yáng)和湯質(zhì)量控制研究 [J]. 陜西中醫(yī), 2017, 38(9): 1286-1287.

[6] 任晉茹, 李康樂(lè), 尚榮國(guó), 等. 高效液相色譜法測(cè)定陽(yáng)和湯中毛蕊花糖苷和甘草苷兩種成分 [J]. 西部中醫(yī)藥, 2019, 32(12): 20-22.

[7] 國(guó)家藥監(jiān)局綜合司. 古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求(征求意見(jiàn)稿) [EB/OL]. [2019-03-22]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/zhqyj/ zhqyjyp/20190327150101694.html.

[8] 張澤康, 王昌海, 趙玥瑛, 等. 經(jīng)典名方陽(yáng)和湯基準(zhǔn)樣品的HPLC指紋圖譜分析 [J/OL]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志: 1-12. [2022-09-13]. https://kns.cnki.net/kcms/detail/ 11.3495.R.20220816.1222.015.html.

[9] 陳金鵬, 張克霞, 劉毅, 等. 地黃化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(6): 1772-1784.

[10] 李娜, 胡亞楠, 王曉雪, 等. 鹿角膠化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展 [J]. 中藥材, 2021, 44(7): 1777-1783.

[11] 高銘哲, 李婷, 田晨琪, 等. 肉桂化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2021, 17(11): 201-205.

[12] 孫銀芳. 中藥白芥子最新研究進(jìn)展 [J]. 新中醫(yī), 2015, 47(10): 209-211.

[13] 卓小玉, 陳晶, 田明, 等. 麻黃的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2021, 38(2): 80-83.

[14] 杜晶, 黃傳輝. 姜炭的研究進(jìn)展 [J]. 云南化工, 2021, 48(2): 8-11.

[15] 李娜, 張晨, 鐘贛生, 等. 不同品種甘草化學(xué)成分、藥理作用的研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）預(yù)測(cè)分析[J]. 中草藥, 2021, 52(24): 7680-7692.

[16] 韓懿存, 武穎爍, 尚藝婉, 等. 陽(yáng)和湯治療惡性腫瘤的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2022, 32(7): 109-117.

[17] 步兵. 加味陽(yáng)和湯治療化療性周圍神經(jīng)病變的臨床研究 [D]. 濟(jì)南: 山東中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

[18] 郭建清. 分析陽(yáng)和湯治療早期糖尿病足的臨床價(jià)值 [J]. 糖尿病新世界, 2021, 24(3): 186-188.

[19] 葉美杏, 陳君立, 黃艷華. 中藥熏蒸聯(lián)合陽(yáng)和湯治療中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎的臨床觀察 [J]. 深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2020, 30(20): 63-65.

[20] 劉永浩. 陽(yáng)和湯治療更年期尿道綜合征療效及對(duì)患者排尿情況和性激素水平的影響 [J]. 陜西中醫(yī), 2021, 42(5): 604-607.

[21] 劉偉恒, 黃其滿, 吳劍強(qiáng). 陽(yáng)和湯聯(lián)合塞來(lái)昔布治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的療效及機(jī)制分析 [J]. 世界復(fù)合醫(yī)學(xué), 2022, 8(4): 105-108.

[22] 陳紫薇, 任夢(mèng)雪, 郭利, 等. 淺談陽(yáng)和湯加減治療陽(yáng)虛寒凝型不孕癥 [J]. 中國(guó)臨床醫(yī)生雜志, 2022, 50(9): 1128-1130.

[23] 許博文, 李杰, 曹璐暢, 等. 基于“陽(yáng)化氣, 陰成形”理論探討扶陽(yáng)消陰法在腫瘤臨證中的應(yīng)用 [J]. 中醫(yī)雜志, 2020, 61(9): 772-775.

[24] 王紅玲, 康斐, 黃興. 基于“陽(yáng)化氣, 陰成形”理論探討溫陽(yáng)法在惡性腫瘤中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2019, 25(7): 999-1002.

[25] 趙天一. 基于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路探討陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 [D]. 蘭州: 甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

[26] 孫雪, 徐茜茜, 王星宇, 等. 陽(yáng)和化巖湯對(duì)mTOR低表達(dá)型乳腺癌內(nèi)分泌耐藥細(xì)胞ER-PI3K/Akt/mTOR通路的作用機(jī)制 [J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2020, 26(14): 1068-1073.

[27] 楊碩, 李康樂(lè), 朱中博, 等. 陽(yáng)和湯含藥血清通過(guò)p38/STAT3信號(hào)通路對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2020, 26(5): 6-10.

[28] Mao D, Feng L, Gong H. The antitumor and immunomodulatory effect of Yanghe Decoction in breast cancer is related to the modulation of the JAK/STAT signaling pathway [J]., 2018, 2018: 8460526.

[29] Lui V W Y, Grandis J R. EGFR-mediated cell cycle regulation [J]., 2002, 22(1A): 1-11.

[30] You L, Wu W D, Wang X,. The role of hypoxia-inducible factor 1 in tumor immune evasion [J]., 2021, 41(3): 1622-1643.

[31] del Barco Barrantes I, Nebreda A R. Roles of p38 MAPKs in invasion and metastasis [J]., 2012, 40(1): 79-84.

[32] 高永翔, 沈欣, 宗桂珍, 等. 陽(yáng)和湯對(duì)裸鼠人癌移植瘤的抗腫瘤作用研究 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2006, 12(7): 57-59.

[33] 肖玉潔, 王婷, 陳州華, 等. 陽(yáng)和湯含藥血清對(duì)缺氧乳腺癌干細(xì)胞MDA-MB-231增殖的抑制作用及其機(jī)制[J]. 中南藥學(xué), 2019, 17(8): 1219-1223.

[34] 廖思聰, 邱志東, 金俊飛. 神經(jīng)鞘脂在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志, 2022, 30(8): 661-668.

[35] Yu Z M, Peng Q, Huang Y N. Potential therapeutic targets for atherosclerosis in sphingolipid metabolism [J].(), 2019, 133(6): 763-776.

[36] Hailemariam T K, Huan C M, Liu J,. Sphingomyelin synthase 2 deficiency attenuates NFkappaB activation [J]., 2008, 28(8): 1519-1526.

[37] Fan Y F, Shi F J, Liu J,. Selective reduction in the sphingomyelin content of atherogenic lipoproteins inhibits their retention in murine aortas and the subsequent development of atherosclerosis [J]., 2010, 30(11): 2114-2120.

[38] 楊凡, 莫濤, 周李芳, 等. 陽(yáng)和湯加減治療橋本甲狀腺炎臨床療效及對(duì)血清炎性指標(biāo)的影響 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2021, 30(24): 2700-2703.

[39] 馬丙娥, 王建華, 趙正平, 等. 陽(yáng)和湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎大鼠的治療作用 [J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2021, 27(1): 16-19.

[40] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》解讀[J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

Fingerprints of classical prescription Yanghe Decoction and predictive analysis of its efficacy related substance

ZHANG Ze-kang, ZHANG Qing, DOU Min-hang, WANG Chang-hai, ZHAO Yue-ying, XI Cheng,ZHANG Xin-yu, SUN Meng, DONG Shuang, DU Shou-ying, BAI Jie, LU Yang

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

Based on fingerprint and network pharmacology, a fingerprint detection method of Yanghe Decoction (陽(yáng)和湯) was established, and its efficacy related substances were predicted and analyzed to provide a reference basis for Yanghe Decoction quality control.The Yanghe Decoction fingerprint was established by HPLC, the common peaks were assigned and identified, and the “component-target-pathway” network diagram of Yanghe Decoction was constructed by network pharmacology to further prove the rationality of the selection of functional components of Yanghe Decoction.A total of 15 common peaks were calibrated by HPLC fingerprint of Yanghe Decoction. Eight common peaks of 5-hydroxymethylfurfural (peak 2), sinapine thiocyanate (peak 5), glycyrrhizin (peak 8), verbascoside (peak 9), cinnamic acid (peak 11), cinnamaldehyde (peak 12), glycyrrhizic acid (peak 13) and ephedrine hydrochloride (peak 15) were identified by the reference substance, and the similarity was more than 0.83. The main groups of pharmacodynamic substances can be transferred from raw materials, decoction pieces to benchmark samples step by step, with a clear affiliation relationship; The “component-target-pathway” network of eight selected active components was constructed and analyzed by network pharmacology, the enriched pathways included cancer signal pathway, lipid and atherosclerosis signal pathway, sphingolipid signal pathway, thyroid hormone signal pathway and so on. According to the connectivity between compounds, targets and pathways, it was preliminarily predicted that glycyrrhizic acid, glycyrrhizin, cinnamaldehyde, cinnamic acid, verbascoside, sinapine thiocyanate and ephedrine hydrochloride may achieve the effects of warmingand tonifying blood, dispelling cold and dredging stagnation by regulating these signal pathways.HPLC fingerprint combined with network pharmacology analysis is used to predict the potential efficacy related substances of Yanghe Decoction in the treatment of diseases. The established method is convenient and stable, and can be used for the quality control of Yanghe Decoction. It also provides a reference for the further study of the quality standard and action mechanism of Yanghe Decoction.

classic prescription; Yanghe Decoction; fingerprint; network pharmacology; efficacy related substances;sinapine thiocyanate; 5-hydroxymethylfurfural; glycyrrhizin; verbascoside; cinnamic acid; cinnamaldehyde; glycyrrhizic acid; ephedrine hydrochloride

R283.6

A

0253 - 2670(2023)04 - 1106 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.010

2022-08-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82173989）

張澤康（1999—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬?、新技術(shù)。Tel: 18189512019 E-mail: 2557158263@qq.com

白 潔，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (010)84738657 E-mail: baijie22811@163.com

陸 洋，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (010)83912123 E-mail: landocean28@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]