黃鍵鋒， 王 瑩， 祝塍軻， 范孝俊， 劉 菲， 李迎澳， 張曉林， 嚴(yán)小軍， 廖 智

(浙江海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 海洋生物資源與分子工程實(shí)驗(yàn)室，浙江， 舟山 316022)

近年來(lái)，隨著環(huán)境的變化，特別是海水酸化的日益嚴(yán)重，貝類養(yǎng)殖業(yè)開(kāi)始顯現(xiàn)各種問(wèn)題，包括貝類大規(guī)模死亡[1-3]、疾病爆發(fā)[4]、生長(zhǎng)和發(fā)育遲緩[5]等。自工業(yè)革命以來(lái)，大氣中二氧化碳濃度已從280 ppm上升到380 ppm，導(dǎo)致海水的平均pH 值已下降了約0.1單位，繼而導(dǎo)致海水中碳酸氫根離子濃度的升高以及碳酸根離子濃度的顯著下降[6]。已知碳酸根離子是生物礦化過(guò)程中的關(guān)鍵分子，特別是對(duì)于以碳酸鈣作為其生物礦化無(wú)機(jī)相的物種，例如貝類、珊瑚、藤壺、以及部分藻類等。碳酸根離子濃度的下降將導(dǎo)致其生物礦化速率受到明顯抑制，從而直接影響其生存[7,8]。此外，海洋酸化還會(huì)導(dǎo)致貝類貝殼出現(xiàn)溶解速率加快，從而影響貝殼的發(fā)育與形成[9]。

貽貝(Mytilus)是一類全球廣泛性分布且具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雙殼貝類，因其強(qiáng)繁殖能力、強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性以及濾食性特征，在自然界能量流動(dòng)、水質(zhì)保護(hù)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有重要意義[10,11]。值得注意的是，盡管在實(shí)驗(yàn)室條件下，貽貝也表現(xiàn)出對(duì)海水酸化的敏感性[12,13]，但在不同海域的調(diào)查分析中，貽貝通常表現(xiàn)出對(duì)于海洋酸化具有較強(qiáng)抗性[14,15]，具體表現(xiàn)為：貽貝貝殼生物礦化速率并未明顯受到海水二氧化碳濃度升高的影響；在食物充足的情況下，海水二氧化碳濃度升高也未降低貽貝的生存率[16]。上述特征導(dǎo)致貽貝成為部分高二氧化碳濃度海域的優(yōu)勢(shì)物種[14,16]。由此可見(jiàn)，貽貝貝殼的生物礦化過(guò)程對(duì)海洋酸化具有較強(qiáng)的耐受性，但這種耐受性的具體機(jī)制目前尚不清楚。

近年來(lái)，隨著貽貝貝殼蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，從中已鑒定到與貽貝貝殼生物礦化過(guò)程直接相關(guān)的部分蛋白質(zhì)，例如碳酸酐酶等[17,18]。此外，在厚殼貽貝中已發(fā)現(xiàn)存在鳥(niǎo)氨酸-尿素循環(huán)途徑(ornithine-urea cycle，OUC)以及脲酶基因[19]。目前已知，碳酸酐酶在貝類貝殼生物礦化過(guò)程中與碳酸根的產(chǎn)生以及貝殼的形成具有重要關(guān)聯(lián)[20,21]；而在部分低等生物(例如珊瑚、細(xì)菌等)中，脲酶分解尿素所產(chǎn)生的碳酸根也已被證實(shí)與其生物礦化直接相關(guān)[22,23]。這一過(guò)程的關(guān)鍵步驟在于脲酶催化尿素的降解，產(chǎn)生碳酸和氨，氨的存在導(dǎo)致pH 值上升，進(jìn)而促進(jìn)碳酸分解，并為碳酸根離子與鈣離子結(jié)合形成碳酸鈣[24]。值得關(guān)注的是，已證實(shí)在細(xì)菌中，脲酶和碳酸酐酶通過(guò)協(xié)同作用共同促進(jìn)了生物礦化過(guò)程[25]。綜合以上結(jié)論，我們認(rèn)為，碳酸酐酶和脲酶可能都在貽貝貝殼生物礦化過(guò)程中發(fā)揮了重要的碳酸根離子調(diào)控作用，且該作用可能與其對(duì)海洋酸化的耐受性具有關(guān)聯(lián)。本文以厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)碳酸酐酶和脲酶為研究對(duì)象，對(duì)其在海水酸化以及殼損傷條件下，2種酶在貽貝生物礦化相關(guān)組織中的表達(dá)譜以及酶活力開(kāi)展分析，以期為了解碳酸酐酶和脲酶與貽貝生物礦化之間的分子關(guān)聯(lián)提供新的科學(xué)認(rèn)知。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶的序列分析

厚殼貽貝基因組數(shù)據(jù)目前已公布，其EBI(European Bioinformatics Institute)數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為ERZ1292486[26]；從其基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中可分別獲得厚殼貽貝碳酸酐酶(CAC5401222.1)和脲酶(CAC5389250.1)基因序列；通過(guò)生物信息學(xué)手段，對(duì)厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶開(kāi)展序列分析。其中，開(kāi)放閱讀框采用Lasergene軟件(版本7.0)進(jìn)行分析；二級(jí)結(jié)構(gòu)采用NOVOPRO在線工具的PSIPRED模塊(https://www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html)進(jìn)行預(yù)測(cè)；結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases)在線進(jìn)行。

1.2 熒光定量PCR分析

成年厚殼貽貝采集自浙江舟山嵊泗海域，以潔凈海水暫養(yǎng)于恒溫水族箱中(溫度22 ℃，鹽度25 ‰)。首先，將厚殼貽貝分為2組，其中一組保持殼的完整狀態(tài)，命名為CS(complete shell)組；另一組為殼損傷組，命名為DS(damaged shell)組，參照文獻(xiàn)[27],采用1 mm直徑鉆頭在貝殼上進(jìn)行鉆孔方式構(gòu)建殼損傷模型貽貝。其中，CS組貽貝分別飼養(yǎng)于正常海水(pH值8.1，命名為CS-NW組，即complete shell in normal water)以及酸化海水(pH值7.3，命名為CS-AW組，即complete shell in acidic water)中。DS組分別飼養(yǎng)于正常海水，酸化海水，以及添加尿素的酸化海水中，分別命名為DS-NW(damaged shell in normal water)組，DS-AW(damaged shell in acidic water)組，以及DS-AW+Ur(damaged shell in acidic water with urea)組。酸化海水參照文獻(xiàn)方法[28]，采用稀鹽酸(1 mol/L)進(jìn)行調(diào)配，每2 h調(diào)節(jié)1次pH值，使其穩(wěn)定在pH7.3。尿素添加濃度為1 mmol/L。以上5組貽貝在飼養(yǎng)過(guò)程中均采用螺旋藻粉作為飼料定時(shí)投喂。飼養(yǎng)時(shí)間均為5 d。

對(duì)上述5組貽貝分別收集其外套膜及血淋巴。其中，血淋巴采用內(nèi)含抗凝劑(Alsever’s Solution, Sigma)的注射器從其后閉殼肌中抽取，抽取后經(jīng)1 000 g,4℃條件下離心10 min，以獲得血細(xì)胞。對(duì)外套膜和血細(xì)胞分別采用柱式RNA抽提試劑盒(上海生工)進(jìn)行組織總RNA提取，并按照說(shuō)明書(shū)操作；之后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit, TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。針對(duì)厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)特異性引物；以厚殼貽貝EF-1α為內(nèi)參基因；相關(guān)引物序列見(jiàn)Table 1；熒光定量PCR擴(kuò)增的條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，循環(huán)數(shù)為35，采用3次重復(fù)試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[29]，以最小二乘法(2-ΔΔCt法)處理數(shù)據(jù)并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

Table 1 Primers sequence for qPCR analysis

1.3 酶活力分析

收集厚殼貽貝外套膜及血細(xì)胞后，經(jīng)液氮速凍并研磨成粉末，進(jìn)一步進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎。之后，離心(8 000 g, 4 ℃, 15 min)，上清液分別采用脲酶酶活力測(cè)試試劑盒(BC4115，索萊寶)，參照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行脲酶活力測(cè)定；組織碳酸酐酶酶活力測(cè)試參照文獻(xiàn)[30]方法進(jìn)行。

1.4 貝殼內(nèi)表面的顯微觀察

對(duì)厚殼貽貝貝殼在正常海水、酸化海水及殼損傷后的貝殼進(jìn)行內(nèi)表面顯微觀察。貝殼樣品事先以5%氫氧化鈉溶液進(jìn)行浸泡和超聲，以去除表面附著的污染物和雜質(zhì)；再用去離子水清洗；經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行顯微觀察。其中，光學(xué)顯微鏡采用奧特光學(xué)(SZ810，重慶奧特)體式顯微鏡進(jìn)行觀察；進(jìn)一步將貝殼樣品經(jīng)噴金處理后，置于掃描電子顯微鏡(SU8010，日立)進(jìn)行觀察，掃描電壓為20 kV。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±方差(mean±SD)展示。采用3次平行試驗(yàn)。利用 SPSS 25.0軟件包中one-wayANOVA單因素方差檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05代表顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶具有不同的序列特征

厚殼貽貝碳酸酐酶基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為975 bp，編碼一條324個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白質(zhì)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，碳酸酐酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有21.60%的α-螺旋，23.15%的完全伸展區(qū)，以及5.86%的β-轉(zhuǎn)角(Fig.1)；碳酸酐酶序列中含有典型的信號(hào)肽序列(1～21號(hào)殘基)，表明厚殼貽貝碳酸酐酶可能是一種分泌蛋白質(zhì)。此外，碳酸酐酶序列中含有1個(gè)典型的碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域(carbonic anhydrase domain)，位于第26～278號(hào)殘基(Fig.2)。厚殼貽貝脲酶基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為2 478 bp，編碼一條由825個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白質(zhì)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，脲酶序列中含有33.09% 的α-螺旋以及19.88% 的完全伸展區(qū)(Fig.1)；其序列中具有真核生物脲酶所具有的典型5種結(jié)構(gòu)域，包括Urease_alpha、beta和gamma結(jié)構(gòu)域，以及2個(gè)酰胺水解酶結(jié)構(gòu)域(amidohydro_1和3)(Fig.2)。

Fig.1 The predicted secondary structure of carbonic anhydrase and urease The secondary structure was predicted by PSIPRED of NOVOPRO (https://www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html). Red spiral line represents α-helix, and blue arrow represents the extension region

Fig.2 Domain prediction of carbonic anhydrase (CA) and urease (URE) of M.coruscus The domain was predicted by TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases). Carbonic anhydrase (CA) contains two domains including signal peptide and Carb_anhydrase domain; Urease (URE) contains five domains: urease_gamma, urease_beta, urease_alpha, amidohydro_1 and amidohydro_3

2.2 海水酸化及殼損傷均明顯影響厚殼貽貝脲酶和碳酸酐酶的表達(dá)量

采用熒光定量PCR技術(shù)，以CS-NW組為對(duì)照，對(duì)不同條件處理后的貽貝開(kāi)展外套膜和血細(xì)胞組織中脲酶和碳酸酐酶的基因相對(duì)表達(dá)量分析，結(jié)果見(jiàn)Fig.3和Fig.4。由圖可見(jiàn)，在正常海水中，殼損傷后的厚殼貽貝(DS-NW組)外套膜組織的脲酶基因的相對(duì)表達(dá)量在1～2 d中，未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，但是，在第3 d，其相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，隨后在第4和第5 d恢復(fù)正常水平(Fig 3A)；而在酸化海水中，CS-AW組貽貝外套膜中的脲酶基因在第1 d出現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.05)，但是在第3 d出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，隨后至第4和第5 d又出現(xiàn)明顯上調(diào)，呈現(xiàn)出波動(dòng)特征(Fig.3A)；在DS-AW組中，脲酶基因的相對(duì)表達(dá)量在第1至第5 d均呈明顯下調(diào)狀態(tài)(P<0.05)(Fig.3A)；添加尿素后的DS-AW+Ur組中，脲酶的表達(dá)量則在第3 d出現(xiàn)明顯上調(diào)(Fig.3A)。碳酸酐酶則表現(xiàn)出與脲酶明顯不同的表達(dá)量變化。結(jié)果如Fig.3B所示，相比于對(duì)照組，殼損傷貽貝在正常海水中(DS-NW組)，其外套膜碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)狀態(tài)，即在第1到第3 d呈現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.05)，而在第5 d出現(xiàn)明顯下調(diào)；在CS-AW組中，碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量同樣出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的變化特征；在DS-AW組中，與對(duì)照組相比，外套膜中碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量在第3至第5 d出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，表明酸化對(duì)碳酸酐酶的表達(dá)具有抑制作用；而在添加尿素后的DS-AW+Ur組中，外套膜碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)狀態(tài)(Fig.3B)。

Fig.3 The log2 fold change of expression level of urease and carbonic anhydrase gene in mantle (A) The log2 fold change of relative expression level of urease in mantle of Mytilus coruscus; (B) The log2 fold change of relative expression level of carbonic anhydrase in mantle of Mytilus coruscus. M. coruscus’ mantle was collected respectively at post induction of 1, 2, 3, 4 and 5 days under different treating conditions: DS-NW, CS-AW, DS-AW, DS-AW+Ur. The relative expression levels of two genes were calculated by 2-△△Ct method and presented as mean ± SD (n=3). The statistical analysis of differences was performed by SPSS (v25. 0) with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test.* and ** represent the significance with P<0.05 and P<0.01, respectively, compared with that of control. DS-NW represents damaged shell in normal sea water; CS-AW represents complete shells in acidic sea water; DS-AW represents damaged shells in acidic sea water; DS-AW+Ur represents damaged shells in acidic sea water with urea

在血細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，殼損傷以及海水酸化條件均明顯抑制了脲酶基因的相對(duì)表達(dá)量，導(dǎo)致脲酶基因的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下調(diào)；但是在酸化海水中，CS-AW組血細(xì)胞的脲酶基因在第4 d出現(xiàn)明顯上調(diào)(Fig.4A)。此外，如Fig.4B所示，與對(duì)照組相比，血細(xì)胞中碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量在DS-NW組中在第1至第5 d中均呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)；在CS-AW組中，碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比在第1 d出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，但是在第2至第4 d明顯上調(diào)(P<0.05)；在DS-AW組中，碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比呈現(xiàn)逐漸上調(diào)趨勢(shì)，在第5 d達(dá)到峰值；而在DS-AW+Ur組中，尿素的添加促進(jìn)了血細(xì)胞中碳酸酐酶的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05)。

Fig.4 The log2 fold change of expression level of urease and carbonic anhydrase gene in hemocyte (A) The log2 fold change of relative expression level of urease in hemocyte of Mytilus coruscus; (B) The log2 fold change of relative expression level of carbonic anhydrase in hemocyte of Mytilus coruscus. M. coruscus’ mantle was collected respectively at post induction of 1, 2, 3, 4 and 5 days under different treating conditions: DS-NW, CS-AW, DS-AW, DS-AW+Ur. The relative expression levels of two genes were calculated by 2-△△Ct method and presented as mean ± SD (n=3). The statistical analysis of differences was performed by SPSS (v25. 0) with one-way ANOVA followed by Tukey’ s multiple range test.* and **represent the significance with P<0. 05 and P<0. 01, respectively, compared with that of control. DS-NW represents damaged shell in normal sea water; CS-AW represents complete shells in acidic sea water; DS-AW represents damaged shells in acidic sea water; DS-AW+Ur represents damaged shells in acidic sea water with urea

2.3 海水酸化及殼損傷明顯影響厚殼貽貝脲酶和碳酸酐酶的酶活力

進(jìn)一步采用相同的處理?xiàng)l件，分析了脲酶和碳酸酐酶在外套膜和血細(xì)胞中的活力變化，結(jié)果如Table 2和Table 3所示。在正常海水中，與對(duì)照組(CS-NW)相比，殼損傷后的厚殼貽貝外套膜組織中，其脲酶活性并無(wú)明顯變化(P>0.05)；但在酸化海水中，CS-AW組貽貝外套膜組織中的脲酶活力相比對(duì)照組出現(xiàn)明顯上升(P<0.05)，在第5 d達(dá)到峰值；而在DS-AW組中，外套膜組織中的脲酶活力相比對(duì)照組僅在第1 d出現(xiàn)輕微上升(P<0.05)；在添加尿素的DS-AW+Ur組中，外套膜組織中的脲酶活力相比對(duì)照組在第3 d出現(xiàn)下降，但在第5 d出現(xiàn)了明顯上升(P<0.05)(Table 2)。對(duì)碳酸酐酶而言，其酶活力值相比對(duì)照組，在DS-NW組中主要呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，特別是在第2和第5 d，外套膜中碳酸酐酶活力相比對(duì)照組明顯下降(P<0.05)；但是在酸化海水中，CS-AW組外套膜中的碳酸酐酶活力呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，其峰值出現(xiàn)在第1 d(P<0.05)；在DS-AW組中，外套膜中碳酸酐酶活力相比對(duì)照組(CS-NW)多呈下降趨勢(shì)，且在第2 d下降幅度為最大(P<0.05)；而在添加尿素后的DS-AW+Ur組中，外套膜中碳酸酐酶活力相比對(duì)照組在第2 d出現(xiàn)明顯上升(Table 2)。

Table 2 Urease (UA) and carbonic anhydrase (CA) activity in mantle

Table 3 Urease (UA) and carbonic anhydrase (CA) activity in hemocyte

在血細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，脲酶活力在DS-NW組中主要在第4 d出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；在CS-AW組中，脲酶活力在第4 d呈明顯下降趨勢(shì)(P<0.05)；在DS-AW組中，脲酶活力則同樣在第4和第5 d出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；而在添加尿素的DS-AW+Ur組中，脲酶活力在第2 d出現(xiàn)明顯上升(P<0.05)，隨后在第4和第5 d中出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)(Table 3)。此外，血細(xì)胞中碳酸酐酶的活力在各實(shí)驗(yàn)組中呈現(xiàn)與外套膜中不一樣的變化特征。其中，在DS-NW組中，血細(xì)胞碳酸酐酶的酶活力相比對(duì)照組在第1 d和第3 d(P<0.05)有輕微上升；在CS-AW組中，血細(xì)胞碳酸酐酶的酶活力相比對(duì)照組在第1 d有輕微上升(P<0.05)，但隨后在第3和第4 d出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；在DS-AW組中，碳酸酐酶活力變化呈現(xiàn)與CS-AW組類似的趨勢(shì)，即先上升后下降模式；而在DS-AW+Ur組中，尿素的添加促使血細(xì)胞中碳酸酐酶的酶活力在第4和第5 d呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)(P<0.05)(Table 3)。

2.4 海水酸化及殼損傷對(duì)厚殼貽貝貝殼表面微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響

首先，采用光學(xué)顯微鏡對(duì)3組殼損傷5 d后的厚貽貝貝殼損傷部位進(jìn)行觀察，設(shè)置了3組平行樣品，結(jié)果見(jiàn)Fig.5。由圖可見(jiàn)，經(jīng)打孔方式構(gòu)建的殼損傷模型的貽貝，正常海水中飼養(yǎng)5 d(DS-NW組)，其貝殼內(nèi)表面在其打孔部位可觀察到一圈白色質(zhì)地的表面結(jié)構(gòu)；而在酸化海水中(DS-AW組)，該白色表面層不明顯；但在添加尿素后，即DS-AW+Ur組中，其貝殼內(nèi)表面打孔部位附近重新出現(xiàn)了白色表面層(Fig.5)。

Fig.5 The photos of light microscopy observation of the inner surface around damaged shell After shell damage, mussels were fed in normal sea water (DS-NW), acidic sea water (DS-AW) and acidic sea water with urea (DS-AW+Ur), respectively. 5 days later, the shell inner surface was observed with light microscopy. The white layer newly formed in DS-AW+Ur group was denoted by a black arrow. The test was repeated three times, and the scale bar is 1 000 μm for each photo

進(jìn)一步采用掃描電鏡對(duì)白色表面層進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)Fig.6。由圖可見(jiàn)，在正常海水中飼養(yǎng)且殼正常的貽貝(即CS-NW組)，其貝殼內(nèi)表面呈現(xiàn)出方格狀紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6A)；而在酸化海水中的貽貝(CS-AW組)貝殼內(nèi)表面，未見(jiàn)方格狀紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6B)；打孔后且飼養(yǎng)于正常海水中的貽貝(DS-NW組)，其貝殼內(nèi)表面在打孔部位附近出現(xiàn)波浪狀的紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6C)；而打孔后且飼養(yǎng)于酸化海水中的貽貝，其貝殼內(nèi)表面打孔部位附近，其波浪狀紋理結(jié)構(gòu)不明顯(Fig.6D)；而在海水中添加尿素后的DS-AW+Ur組貽貝中，其打孔部位的貝殼內(nèi)表面出現(xiàn)類似于DS-NW組中的波浪狀紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6E)。

Fig.6 SEM observations of the shell inner surface from mussel with complete or damaged shell in normal or acidic sea water CS-NW: surface of complete shell in normal seawater; CS-AW: surface of complete shell in acidic sea water; DS-NW: surface of damaged shell in normal water; DS-AW: surface of damaged shell in acid water; DS-AW+Ur: surface of damaged shell in acidic water with 1mmol/Lurea

3 討論

貝類的生物礦化不僅賦予了貝類具有重要保護(hù)意義的貝殼組織，其礦化過(guò)程涉及的分子機(jī)制也成為當(dāng)前針對(duì)貝殼的仿生學(xué)和材料學(xué)研究的重要領(lǐng)域。目前，海洋酸化已對(duì)貝類的生存帶來(lái)重大影響，其影響機(jī)制包括降低海水中碳酸根離子的濃度[3]，加速貝殼中碳酸鈣晶體的溶解速度[9, 31]，以及改變貝殼中碳酸鈣晶體晶型[32]等。海水中的碳酸根離子是貝殼形成的無(wú)機(jī)碳來(lái)源，主要包括外源性碳酸根(例如海水中溶解的碳酸根)，以及內(nèi)在的碳酸根(通過(guò)代謝產(chǎn)生的碳酸根離子)[33]。對(duì)貝類而言，其生物礦化是一個(gè)極為復(fù)雜的合成過(guò)程。目前，已發(fā)現(xiàn)海洋酸化會(huì)對(duì)貝類的多種代謝途徑產(chǎn)生明顯的影響[34]。其中，碳酸酐酶負(fù)責(zé)貝類生物礦化過(guò)程中碳酸根離子的調(diào)節(jié)，因而被認(rèn)為是生物礦化過(guò)程中最重要的蛋白質(zhì)之一[35]。此外，脲酶也是一種生物礦化相關(guān)蛋白質(zhì)，但主要在微生物以及部分藻類中被發(fā)現(xiàn)具有生物礦化輔助作用[36]，而在軟體動(dòng)物中尚不清楚脲酶對(duì)生物礦化的貢獻(xiàn)。本文的研究結(jié)果顯示，首先注意到脲酶和碳酸酐酶在貽貝外套膜和血細(xì)胞中，和在殼損傷與海水酸化等不同處理?xiàng)l件下，其基因表達(dá)量和酶活力變化呈現(xiàn)較為復(fù)雜的變化特征，體現(xiàn)出脲酶和碳酸酐酶在貽貝生物礦化過(guò)程中，具有較為復(fù)雜的組織特異性和生理過(guò)程的特異性。

在正常海水中，殼損傷處理對(duì)外套膜中的脲酶和碳酸酐酶的基因表達(dá)量均表現(xiàn)出明顯的激活作用，特別是脲酶基因表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)。表明脲酶和碳酸酐酶可能在外套膜中均參與了殼損傷的修復(fù)過(guò)程。酶活力的測(cè)試結(jié)果雖然也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)，但相比對(duì)照組，差異不明顯?？赡艿脑蛟谟趶幕虻匠墒斓鞍踪|(zhì)發(fā)揮功能，需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯以及翻譯后修飾等一系列復(fù)雜過(guò)程，因而基因表達(dá)量的測(cè)試結(jié)果和酶活測(cè)試結(jié)果存在不完全對(duì)應(yīng)的現(xiàn)象。此外，在前期研究中，已發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝各組織中均存在較高濃度的尿素分子，且穩(wěn)定性同位素標(biāo)記檢測(cè)證實(shí)了尿素的碳元素可轉(zhuǎn)移至貝殼，但存在一定的飽和性，表明尿素分子在一定程度上參與了貝殼的形成[19]。本文研究結(jié)果進(jìn)一步表明，外套膜中的脲酶基因表達(dá)量在殼損傷后明顯上升，推測(cè)其可通過(guò)催化尿素的分解產(chǎn)生碳酸根離子，從而參與了殼損傷的修復(fù)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。而在血細(xì)胞中，正常海水中的殼損傷同樣誘導(dǎo)了碳酸酐酶的表達(dá)量明顯上調(diào)，但脲酶基因表達(dá)受到抑制；酶活力測(cè)試數(shù)據(jù)也得到了類似結(jié)果。從整體水平呈現(xiàn)出碳酸酐酶活力呈上升趨勢(shì)，而脲酶活僅在第2 d出現(xiàn)上升，之后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。這表明，貽貝血細(xì)胞可能主要通過(guò)碳酸酐酶參與了正常海水條件下的貝殼損傷的修復(fù)。目前，已知貝殼的修復(fù)與貝殼的生長(zhǎng)具有不同的生物礦化機(jī)制[37]。盡管此前外套膜被認(rèn)為是貝類貝殼生長(zhǎng)和修復(fù)的主要組織，但貝類血細(xì)胞在貝殼修復(fù)過(guò)程中的作用也已被證實(shí)[38]。本文數(shù)據(jù)表明，貽貝貝殼損傷的修復(fù)中，外套膜中的脲酶以及血細(xì)胞中的碳酸酐酶可能分別發(fā)揮了不同的作用。

而在貝殼完整的情況下，海水酸化可誘導(dǎo)外套膜組織中的脲酶和碳酸酐酶的基因表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，且脲酶和碳酸酐酶活力也呈現(xiàn)類似的上升趨勢(shì)?？紤]到脲酶對(duì)尿素的分解作用所產(chǎn)生氨可導(dǎo)致局部的堿性環(huán)境[24]，以及碳酸酐酶對(duì)二氧化碳的調(diào)控作用[35]，脲酶和碳酸酐酶的基因表達(dá)量在酸化條件下有明顯上調(diào)，意味著2種酶可能均在貽貝對(duì)抗海水酸化的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。值得關(guān)注的是，碳酸酐酶不僅是貝殼生物礦化過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，目前也是衡量海水酸化對(duì)生物礦化抑制作用的主要靶標(biāo)分子[20]，但其表達(dá)量在不同物種中呈現(xiàn)不同的特征。例如，在珊瑚的生物礦化研究中，發(fā)現(xiàn)海水酸化能強(qiáng)烈抑制碳酸酐酶基因的表達(dá)和酶活性[39]。而在已適應(yīng)海洋酸化的物種，例如牡蠣中，其碳酸酐酶的表達(dá)量則不受影響[34]。而本文研究中，貽貝碳酸酐酶和脲酶的基因表達(dá)量在酸化條件下，均表現(xiàn)出上調(diào)，表明貽貝可能通過(guò)脲酶和碳酸酐酶來(lái)產(chǎn)生對(duì)海洋酸化的適應(yīng)，這可能是貽貝對(duì)抗海洋酸化的一種耐受性機(jī)制。另外，酸化疊加殼損傷處理，導(dǎo)致貽貝外套膜的脲酶和碳酸酐酶以及血細(xì)胞中的脲酶基因表達(dá)量均呈下調(diào)狀態(tài)，其酶活性也呈現(xiàn)類似特征，表明海水酸化可能抑制了貽貝外套膜對(duì)殼損傷的修復(fù)。但同樣條件下，血細(xì)胞中碳酸酐酶表達(dá)量卻呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，其酶活力也在第1 d明顯上升。一方面，表明血細(xì)胞中碳酸酐酶可能參與了酸化海水條件下的二氧化碳調(diào)節(jié)，另一方面，也表明血細(xì)胞中的碳酸酐酶可能參與了酸化條件下對(duì)于殼損傷的修復(fù)。但上述推測(cè)尚需進(jìn)一步的研究。

本文進(jìn)一步的研究表明，酸化海水中添加尿素可誘導(dǎo)殼損傷后貽貝外套膜中的脲酶和碳酸酐酶的基因表達(dá)量的明顯上調(diào)，但呈現(xiàn)不同的波動(dòng)特征。而在血細(xì)胞中，同樣條件下，碳酸酐酶的基因表達(dá)量受尿素誘導(dǎo)也明顯上調(diào)，但脲酶的表達(dá)量與添加尿素前相比未受影響。上述結(jié)果表明，尿素在外套膜和血細(xì)胞中對(duì)于在酸化條件下的殼損傷修復(fù)具有不同的激活機(jī)制。對(duì)外套膜而言，尿素添加可能通過(guò)激活脲酶和碳酸酐酶參與酸化海水中殼損傷的修復(fù)，而在血細(xì)胞中，尿素可能僅通過(guò)激活碳酸酐酶來(lái)參與貝殼在酸化海水中的修復(fù)。

貝殼顯微觀察結(jié)果也初步證實(shí)，酸化對(duì)貝殼損傷的抑制以及尿素在酸化海水中對(duì)貝殼損傷過(guò)程的激活作用。光學(xué)顯微鏡的結(jié)果顯示，貝殼打孔后在正常海水和酸化海水中，在打孔部位附近的紋理質(zhì)地有明顯區(qū)別。在正常海水中，打孔部位附近的白色質(zhì)地層，可視為貽貝在殼損傷后，在其損傷部位出現(xiàn)的修復(fù)層。該修復(fù)層主要涉及貝殼內(nèi)表面的有機(jī)質(zhì)膜。該有機(jī)質(zhì)膜已被證實(shí)與貝殼的形成有關(guān)[40]。而在掃描電鏡觀察中，正常貝殼在正常海水和酸化海水中表現(xiàn)出不同的表面結(jié)構(gòu)，在酸化海水中，其貝殼內(nèi)表面出現(xiàn)不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)，推測(cè)是無(wú)定型碳酸鈣晶體(amorphous calcium carbonate，ACC)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，海水酸化會(huì)導(dǎo)致貝殼的碳酸鈣晶體從有序向無(wú)序狀態(tài)改變，從而導(dǎo)致ACC增加[32]。此外，打孔部位的白色修復(fù)層在掃描電鏡觀察中表現(xiàn)為較為規(guī)則的波浪狀結(jié)構(gòu)，而在酸化海水中，相同部位未出現(xiàn)規(guī)則波浪狀結(jié)構(gòu)。但是尿素的添加會(huì)誘導(dǎo)該結(jié)構(gòu)重新出現(xiàn)，表明尿素對(duì)于在酸化海水條件下的貝殼修復(fù)具有某種激活作用。

通過(guò)以上研究，本文初步得出以下結(jié)論：脲酶與碳酸酐酶均在貽貝貝殼的損傷修復(fù)以及對(duì)海洋酸化的適應(yīng)性方面具有重要作用，但兩者在不同組織以及不同處理?xiàng)l件下，其基因表達(dá)量和酶活性有著不同的響應(yīng)過(guò)程。盡管其具體過(guò)程和分子機(jī)制尚不明確，但根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，在巨大芽孢桿菌的生物礦化過(guò)程中，脲酶和碳酸酐酶已被證實(shí)存在協(xié)同作用[25]。但該研究基于的證據(jù)是體外實(shí)驗(yàn)，其協(xié)同作用的機(jī)制推測(cè)為脲酶催化尿素形成堿性環(huán)境，該堿性環(huán)境進(jìn)一步促使碳酸酐酶分解碳酸產(chǎn)生的碳酸氫根轉(zhuǎn)化為碳酸根離子。本文的結(jié)果表明，脲酶和碳酸酐酶僅在外套膜中表現(xiàn)出不同實(shí)驗(yàn)條件下具有響應(yīng)同步性，但在血細(xì)胞中并無(wú)這一趨勢(shì)，推測(cè)有較為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。此外，貽貝的生物礦化過(guò)程對(duì)海洋酸化的耐受性必然有其內(nèi)在機(jī)制，而脲酶和碳酸酐酶很可能是貽貝對(duì)酸化耐受的關(guān)鍵分子；此外，尿素對(duì)于貽貝貝殼的殼損傷修復(fù)具有促進(jìn)作用，而該作用很可能與脲酶有關(guān)，其機(jī)制類似于細(xì)菌中脲酶參與生物礦化的機(jī)制。

致謝感謝浙江大學(xué)電鏡中心宋丹丹老師在掃描電鏡觀察中的幫助。