段依璠， 顧 靜， 舒亞妃， 韓曉斐,5)， 梁乾坤

(1)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000；2)天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科， 天津 300000；3)甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000；4)甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000；5)甘肅省中醫(yī)藥防治慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

放射性心血管損傷(radiation-induced heart damage，RIHD)是胸部腫瘤放療的常見并發(fā)癥，其主要病理改變是心肌纖維化[1, 2]。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)是纖維化病變的主要效應(yīng)細(xì)胞，損傷刺激時(shí)可增殖活化，并分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、膠原纖維(collagen，Col)等促纖維化因子，引起組織器官纖維化[3]。TGF-β與纖維化關(guān)系密切。已有研究證實(shí)，TGF-β1/smads信號(hào)通路在放射性心肌纖維化(radiation-induced cardiac fibrosis，RICF)中發(fā)揮重要作用[4, 5]。

放射性心血管損傷中纖維化病變機(jī)制尚不完全清楚，近年來有研究表明，它的發(fā)生可能與外泌體介導(dǎo)的輻射旁效應(yīng)有關(guān)[6]。外泌體是細(xì)胞受刺激或活化時(shí)分泌的一種微囊泡，通過自分泌、旁分泌等方式作用于靶細(xì)胞[7, 8]。外泌體包含了包括microRNA(miRNA)在內(nèi)的大量信息分子。miRNA是一類具有重要調(diào)控功能的微小RNA，屬于非編碼RNA(non-coding RNAs)，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸左右[9]，被公認(rèn)為是多細(xì)胞生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的一種方式，這種調(diào)控主要是通過與特定mRNA的-3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，引起mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯來調(diào)控基因表達(dá)[10]。miRNA已被證明可能調(diào)節(jié)30%以上的蛋白質(zhì)基因表達(dá)，參與許多重要的生命過程，并涉及多種疾病。

研究證明，外泌體攜帶的miRNA在組織器官纖維化發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[11-13]。但相關(guān)于RICF和外泌體及其攜帶的miRNA的研究非常有限，故本研究提取受照射RCF分泌的外泌體，通過RNA-seq技術(shù)檢測(cè)X射線照射對(duì)外泌體miRNA表達(dá)譜的影響，篩選差異表達(dá)的miRNA，并分析差異miRNA靶基因主要富集的信號(hào)通路，探討輻射誘導(dǎo)的外泌體miRNA通過介導(dǎo)輻射旁效應(yīng)在RICF病變進(jìn)程中的可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

大鼠心肌成纖維細(xì)胞系(RCF)購(gòu)自北納生物公司，貨號(hào)BNCC341875。

1.2 藥物與試劑

無外泌體胎牛血清購(gòu)自Biological Industries公司；胎牛血清、總RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；辣根過氧化物酶羊抗兔IgG (HRP-Goat Anti Rabbit IgG)、大鼠GAPDH單克隆抗體、大鼠Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)單克隆抗體、大鼠TGF-β1單克隆抗體購(gòu)自GeneTex公司；CD9、CD63、CD81抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.3 儀器設(shè)備

生物輻照儀(美國(guó)PrecisionX-Ray)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)、美谷SpectraMax酶標(biāo)檢測(cè)儀(上海美谷分子儀器有限公司)、羅氏LightCycler96 PCR儀(Roche公司)、超速離心機(jī)(Hitachi公司)、透射電鏡(Hitachi公司)、粒徑分析儀(NanoFCM公司)、納米流式檢測(cè)儀(NanoFCM公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

RCF置于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA 2 mL消化細(xì)胞，并加入完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞后傳代培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞照射

細(xì)胞照射在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)生物輻照檢測(cè)室進(jìn)行，Precision X-Ray生物輻照儀照射，皮源距48 cm，劑量率2 Gy/min，按照0、1、2、3、4 Gy X射線輻射劑量完成照射，篩選出X射線不抑制細(xì)胞增殖活性又能顯著促進(jìn)TGF-β1和Ⅰ型膠原 mRNA表達(dá)的最大照射劑量，作為本實(shí)驗(yàn)X射線劑量。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

用0，1，2，3，4，5 GyX射線照射細(xì)胞，然后分別于照射后6、12、24、48、72 h用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。CCK-8還用于RCF與外泌體共培養(yǎng)時(shí)間和藥物濃度篩選。

1.7 纖維化相關(guān)分子表達(dá)檢測(cè)

1.7.1 RT-PCR 取0、1、2、3、4 GyX射線照射后48 h的細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)定其濃度和純度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將引物(列于Table 1)加入PCR擴(kuò)增體系，使用羅氏Light Cycler96實(shí)時(shí)檢測(cè)分析PCR產(chǎn)物。此外，RT-PCR還用于驗(yàn)證miRNA的差異表達(dá)。

Table 1 Primers used in RT-PCR

1.7.2 Western印跡檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，變性并進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)定量，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后抗體孵育，曝光后ImageJ軟件檢測(cè)灰度值并分析。

1.8 外泌體的分離及鑒定

1.8.1 超速離心法分離外泌體 細(xì)胞密度生長(zhǎng)到70%時(shí)，更換血清為無外泌體血清，按照篩選出的照射劑量(2 Gy)進(jìn)行X射線照射后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收上清，細(xì)胞培養(yǎng)上清分別以4 ℃ 300×g，10 min、3 000×g，15 min、2 000×g，30 min、10 000×g，45 min離心，收集上清液。經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，收集過濾液，4 ℃ 100 000×g離心70 min并收集沉淀，以10 mL預(yù)冷的PBS重懸后，再次相同轉(zhuǎn)速離心收集沉淀(外泌體)，100 μL預(yù)冷PBS重懸外泌體保存于-80 ℃。

1.8.2 外泌體鑒定 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)；NTA納米粒子跟蹤分析檢測(cè)外泌體的粒徑及濃度；納米流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD9、CD63和CD81等外泌體表面標(biāo)志性蛋白質(zhì)。

1.8.3 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 提取外泌體總RNA，通過構(gòu)建去核糖體鏈特異性文庫(kù)和small RNA文庫(kù)進(jìn)行4種RNA的捕獲，并使用Agilent Bioanalyzer2100評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量，合格的文庫(kù)應(yīng)該有單一的峰，無接頭。最后，用Illumina Novaseq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.8.4 生物信息學(xué)分析 fastq格式的原始數(shù)據(jù)首先通過perl腳本進(jìn)行處理，去除接頭序列，過濾掉低質(zhì)量reads，獲得可用于后續(xù)分析的clean reads；將比對(duì)到參考基因組上的reads與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的miRNA前體及成熟體序列進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)各樣本匹配上miRNA的詳細(xì)情況，并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，將不能比對(duì)上Rfam和miRBase的sRNA比對(duì)到參考基因組上，截取其周圍序列，使用miRDeep2軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，利用Dicer酶切位點(diǎn)信息、能量值等特征進(jìn)行過濾，鑒定出新的miRNA；對(duì)各樣本中的miRNA進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，并用TPM算法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，獲得miRNA的Read Counts數(shù)。

1.8.5 miRNA差異表達(dá)分析 根據(jù)各樣品中miRNA的Read Counts數(shù)，采用edgeR程序?qū)iRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析。并按照表達(dá)量倍數(shù)差異(∣log2Fold Change∣>1)和表達(dá)差異顯著性(P<0.05)篩選出差異表達(dá)的miRNA。

1.8.6 靶基因預(yù)測(cè) 通過3個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件targetScan、miRWalk、miRNADB對(duì)差異表達(dá)的miRNA序列進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。

1.8.7 GO及KEGG富集分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體(GeneOntology，GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析：找出差異表達(dá)倍數(shù)(∣log2Fold Change∣>2)的miRNA的靶基因顯著富集的功能及通路(顯著富集的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 X射線照射大鼠心肌成纖維細(xì)胞的劑量篩選

2.1.1 細(xì)胞增殖活性 X射線照射RCF后生長(zhǎng)曲線正如Fig.1：對(duì)照組(0 Gy)顯示，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度變慢。與對(duì)照組(0 Gy)相比，1、2 GyX射線照射RCF后12 h，細(xì)胞增殖率分別增加了6.2%、5.9%(均P<0.01)；2Gy照射72 h，RCF增殖率對(duì)比0 Gy組降低5.9%(P<0.05)。較大劑量3、4和5 Gy照射后，對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。結(jié)果說明1、2 GyX射線在6～12 h可促進(jìn)RCF增殖，照射后48～72 h，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，促增殖作用逐漸減弱，對(duì)照組和各照射組增殖速度差異變大。在照射后72 h，2 Gy照射組出現(xiàn)增殖抑制作用，48 h可能是細(xì)胞增殖能力的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，3、4和5 Gy等較大照射劑量對(duì)細(xì)胞增殖能力影響較大?；趯?shí)驗(yàn)結(jié)果，本文初步篩選1、2 Gy為X射線照射RCF的劑量，照射后48 h為指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。

Fig.1 Effect of different doses of X-ray irradiation on RCF proliferation rate CCK-8 method was used to detect the proliferation of RCF cells at different time points after irradiation with different doses of X-ray. The cell growth curve was drawn with time as the horizontal axis and light absorption value (A) as the vertical axis. Based on the experimental results, 1 Gy and 2 Gy were preliminarily selected as the doses of RCF irradiated by X-ray, and 48 hours after irradiation was the index detection time point. 0 Gy group was used as the control group,*P<0.05，**P<0.01 vs.0 Gy. n=18

2.1.2 纖維化相關(guān)分子表達(dá) 為了驗(yàn)證X射線照射對(duì)RCF的促纖維化效應(yīng)，用0、1、2、3、4 Gy X射線照射RCF后48 h檢測(cè)纖維化相關(guān)分子(TGF-β1和Col-Ⅰ)的表達(dá)，結(jié)果顯示(Fig.2)：2 Gy照射后TGF-β1的mRNA表達(dá)增加了40.0%，與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，其余各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1 Gy和2 Gy組Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)分別增加了8.7% (P<0.05)和33.5%(P<0.01)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3 Gy組Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4 Gy照射后，Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比降低了11.9%(P<0.01)。以上結(jié)果證明，2 Gy X射線照射細(xì)胞有促纖維化效應(yīng)，但隨著照射劑量增加達(dá)到4 Gy 時(shí)，TGF-β1和Ⅰ型膠原表達(dá)反而減少，這可能是因?yàn)檩^高劑量X射線對(duì)細(xì)胞的損傷較嚴(yán)重導(dǎo)致細(xì)胞功能下降，纖維化分子表達(dá)反而受抑制。

Fig.2 Effects of different doses X-ray irradiation on RCF TGF-1 and Col-I mRNA RT-PCR was used to detect the pro-fibrotic effect of X-ray irradiation on RCF. The expression of fibrosis-related molecules (TGF-β1 and Col-Ⅰ) was detected 48 hours after irradiation with 0, 1, 2, 3, and 4 Gy of X-ray. The results showed that 2 Gy X-ray irradiation had a pro-fibrotic effect, but the expression of TGF-β1 and Col-Ⅰ decreased with the irradiation dose increase to 4 Gy. This may be because the higher dose of X-ray irradiation caused more serious damage to the cells, resulting in the decline of cell function, and the expression of fibrotic molecules was inhibited. *P<0.05，**P<0.01vs.0 Gy. n=3

為了確認(rèn)篩選條件的促纖維化效果，本文在2 GyX射線照射RCF后48 h檢測(cè)了TGF-β1和Ⅰ型膠原的蛋白質(zhì)表達(dá)，結(jié)果顯示(Fig.3)：與0 Gy組相比，2 GyX射線照射RCF后48 hTGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)表達(dá)分別增加了38.1%、167.7%(P<0.01)。

Fig.3 Expression changes of TGF-β1 and Col-Ⅰ proteins at 48 hours after 2 GyX irradiation of RCF Western blot was used to detect the protein expression. The results showed that the protein expression of TGF-β1 and Col-Ⅰ increased at 48 hours after 2 Gy X-ray irradiation. This indicates that 2 Gy X-ray irradiation can induce obvious pro-fibrotic changes in RCF after 48 hours. **P<0.01 vs. Control (0 Gy). n=3

通過細(xì)胞增殖活性和纖維化分子Ⅰ型膠原、TGF-β1表達(dá)的檢測(cè)表明：2 GyX射線照射RCF48 h，細(xì)胞發(fā)生了明顯的促纖維化改變，可以作為誘導(dǎo)RCF促纖維化損傷的X射線干預(yù)條件，“2 Gy X射線照射RCF后48 h”作為本文提取外泌體的實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 外泌體的提取及鑒定

倒置顯微鏡觀察到RCF是貼壁細(xì)胞，呈不規(guī)則梭形，以下是0 Gy對(duì)照組(Control組)和2 Gy照射組(Irradiation)RCF的鏡下形態(tài)(Fig.4)。

用超速離心法提取Control組和Irradiation組外泌體，結(jié)果顯示：透射電鏡下，負(fù)染的大多數(shù)外泌體顯示為50～150 nm杯狀膜泡(Fig.5A)。納米粒子跟蹤分析(NTA)外泌體的濃度以及直徑分布見Fig.5B，測(cè)得對(duì)照組的外泌體濃度為1.7×108/mL，平均粒徑為75.28 nm；照射組外泌體濃度為4.78×107/mL，平均粒徑為65.61 nm。納米流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，外泌體特征性標(biāo)志蛋白質(zhì)(CD9、CD63和CD81)陽(yáng)性。這些特征與外泌體的特點(diǎn)相符，鑒定為外泌體(Fig.5C)。

2.3 外泌體微RNA表達(dá)譜檢測(cè)及差異分析

根據(jù)各樣本中miRNA的表達(dá)量，將對(duì)照組、照射組的外泌體miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，并按照∣log2Fold Change∣(∣log2FC∣)>1和P<0.05篩選出差異表達(dá)的外泌體miRNA。采用R語(yǔ)言軟件包繪制差異表達(dá)的外泌體miRNA火山圖(Fig.6 ，Volcanic map)和聚類熱圖(Fig.7，Cluster analysis)?；鹕綀D展示顯著性差異表達(dá)外泌體miRNA的結(jié)果(∣log2FC∣>1，P<0.05)，直觀了解差異表達(dá)miRNA上調(diào)和下調(diào)情況。2組中差異表達(dá)的外泌體miRNAs有28個(gè)(∣log2FC∣>1，P<0.05)，其中照射組表達(dá)上調(diào)的外泌體miRNAs 9個(gè)，表達(dá)下調(diào)的19個(gè)。上調(diào)的外泌體miRNAs中∣log2FC∣>2的共8個(gè)，下調(diào)的外泌體miRNAs中∣log2FC∣>2的共12個(gè)，2組篩選的∣log2FC∣>2的外泌體miRNA見Table 2。

Fig.6 Volcanic map of known exosomal miRNAs differentially expressed between the two groups Volcano diagram using R software shows the significantly differentially expressed microRNAs (∣ log2 FC ∣ > 1, P < 0.05). Abscissa for∣log2 FoId Change∣, ordinate for -log10 (P-value), horizontal dotted line as the P=0.05 threshold. Red dots represent up-regulated miRNAs in this group, green dots represent down-regulated miRNAs in this group, and gray dots represent non-significantly differentially expressed miRNAs

Fig.7 Cluster analysis of miRNA of known exosomes with differential expression between the two groups R software was used to draw the cluster heat map of differentially expressed miRNAs. Each row in the figure represents the expression level of a miRNA in each sample. Each column represents the expression level of each miRNA in a sample, and its chromatic aberration represents the relative expression level of miRNA. From green to red, representing the expression level from low to high. The left is the cluster feature tree of miRNA, and the upper is the cluster feature tree of the sample

Table 2 miRNAs were differentially expressed in the control group and the irradiation group(∣log2 FC∣>2, P<0.05, n=3)

此外，本文選擇了受照射細(xì)胞外泌體中2個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA分子(miR-483-5p、miR-212-3p)和2個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA分子(miR-216a-5p、miR-217-5p)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。2 Gy X射線照射RCF后48 h，收集細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的外泌體，提取外泌體RNA，qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，這4個(gè)miRNA分子的差異表達(dá)均得到證實(shí)(Table 3)。

Table 3 Differentially expressed miRNA in exosomes were confirmed by qRT-PCR analysis (n=3)

2.4 差異微RNA靶基因預(yù)測(cè)及富集分析

通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件(targetScan、miRWalk、miRNADB)對(duì)各差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，照射組表達(dá)上調(diào)的miRNAs(∣log2FC∣>2，P<0.05)共同作用的靶基因有2 493個(gè)，表達(dá)下調(diào)miRNAs(∣log2FC∣>2，P<0.05)共同作用的靶基因有215個(gè)。對(duì)這些靶基因進(jìn)行 GO及KEGG富集分析。

GO富集分析：Fig.8顯示，排名前10的“生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)”。差異表達(dá)的miRNAs調(diào)控的靶基因主要參與蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過程，富集于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等細(xì)胞成分，發(fā)揮蛋白激酶綁定和蛋白結(jié)合等分子功能。

Fig.8 GO enrichment analysis Using DAVID database to find out the significant enrichment functions of differentially expressed miRNA (∣log2 FC∣>2) target genes. According to the criterion of significant enrichment, P-value <0.05, the top ten items were selected for mapping and sorted according to the enrichment score. (A) Up-regulated differential miRNA target genes GO analysis of the top 10 Biological process, Cellular component and Molecular function. (B) Down-regulated differential miRNA target genes GO analysis of the top 10 Biological process, Cellular component and Molecular function

KEGG富集分析：Fig.9顯示，富集最顯著的前20個(gè)通路(pathway)。表達(dá)上調(diào)的miRNA靶基因主要富集的通路有：PI3K-Akt、MAPK、mTOR、ECM、cAMP、Wnt、TGF-β和Notch等信號(hào)通路(Fig.9A)；表達(dá)下調(diào)的miRNA靶基因主要富集的通路有：MAPK、ECM、Ras、mTOR、PI3K-Akt、Rap1和AMPK 等信號(hào)通路(Fig.9B)。

Fig.9 KEGG enrichment analysis KEGG enrichment analysis was performed on up-regulated and down-regulated differential miRNAs (∣log2 FC∣>2, P<0.05) target genes using DAVID database, and the top 20 pathways with the most significant enrichment were selected according to the KEGG enrichment analysis. In the figure, the bubble size represents the number of enriched genes, and the difference in bubble color represents the enrichment degree of target genes. The criterion for significant enrichment was P <0.05. (A) KEGG enrichment analysis of up-regulated differential miRNA target genes. (B) KEGG enrichment analysis of different miRNA target genes with down-regulated expression

3 討論

輻射誘發(fā)的心血管損傷是放療的嚴(yán)重臨床并發(fā)癥[15]。其臨床特點(diǎn)表現(xiàn)為心室彈性和擴(kuò)張性降低，導(dǎo)致射血分?jǐn)?shù)下降、心力衰竭甚至心源性猝死，損害癌癥患者放療后的長(zhǎng)期健康，并限制有效殺死腫瘤細(xì)胞所需的放療劑量和強(qiáng)度[16]。放射性心血管損傷尚無有效干預(yù)措施，因其主要病理基礎(chǔ)是心肌的纖維化病理改變，如果能有效阻斷其纖維化病變進(jìn)程，則有可能改善放射性心血管損傷。研究發(fā)現(xiàn)，在纖維化發(fā)展過程中，細(xì)胞因子TGF-β1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展[17]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小劑量X射線不會(huì)引起細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，卻有直接的促纖維化效應(yīng)[18]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討“外泌體miRNA通過輻射旁效應(yīng)在放射性心臟纖維化損傷中的分子基礎(chǔ)”，應(yīng)獲得以“促進(jìn)纖維化為目的”的受照射外泌體，所以實(shí)驗(yàn)中“受照射外泌體的X射線劑量篩選依據(jù)”是“能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和纖維化因子高表達(dá)，但又不會(huì)明顯抑制細(xì)胞活性的非致死X射線劑量”。基于以上本文僅設(shè)計(jì)了“0、1、2、3、4”5個(gè)X射線照射劑量，實(shí)際上前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選中觀察到隨著X射線劑量增大(6、8、10 Gy)會(huì)顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，同時(shí)PCR檢測(cè)相關(guān)纖維化因子TGF-β1和Ⅰ型膠原表達(dá)也明顯降低，這可能與X射線劑量過大引起細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷有關(guān)，即說明：較大劑量的X射線因嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞不僅不會(huì)有促增殖纖維化的效應(yīng)，反而會(huì)顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，隨之相關(guān)纖維化因子表達(dá)降低，促纖維化效應(yīng)也受抑。本文結(jié)果也表明，2 Gy的小劑量X射線在照射RCF后6～12 h可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，3、4 Gy照射會(huì)抑制細(xì)胞增殖速率，且隨著劑量逐漸增大，纖維化因子的表達(dá)出現(xiàn)先增高再降低的變化趨勢(shì)。綜上，本文選擇“2 GyX射線照射RCF后48 h”作為提取外泌體的條件。

3.1 外泌體微RNA介導(dǎo)的輻射旁效應(yīng)與放射性心肌纖維化

目前研究發(fā)現(xiàn)，約有150～200種miRNA在心血管細(xì)胞中表達(dá)，其中許多參與了心血管疾病的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，包括輻射后的心血管損傷調(diào)節(jié)[19]。例如：miRNA-29家族靶向調(diào)節(jié)參與纖維化的多種膠原蛋白的mRNA，miR-29過表達(dá)可以減少膠原蛋白的合成，被TGF-β刺激后miR-29表達(dá)下調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化[20]；miR-15b通過抑制TGF-β信號(hào)通路調(diào)節(jié)心肌肥大和纖維化，照射后，miR-15b的表達(dá)被抑制進(jìn)而促進(jìn)了纖維化的發(fā)生發(fā)展[21]；照射引起的心肌纖維化中上調(diào)的miR-21，通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子分泌和心肌細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)-MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)心肌肥大和心肌纖維化的發(fā)展[22]。

放射性心血管損傷中纖維化病變機(jī)制尚不完全清楚，近年來有研究表明，它的發(fā)生可能與外泌體介導(dǎo)的輻射旁效應(yīng)有關(guān)[6]。輻射旁效應(yīng)即腫瘤放療引起的電離輻射除了直接損傷受照射的細(xì)胞，其周圍未受照射細(xì)胞也發(fā)生一系列的損傷性改變，輻射旁效應(yīng)可擴(kuò)大輻射暴露對(duì)人體危害的時(shí)間與空間跨度，這更好的解釋了輻射的遲發(fā)性損傷效應(yīng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，輻射旁效應(yīng)可能與電離輻射刺激細(xì)胞分泌的外泌體有關(guān)，外泌體由細(xì)胞通過胞吐作用分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，然后通過與靶細(xì)胞膜融合將miRNAs等內(nèi)容物釋放入靶細(xì)胞，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞[9]。外泌體攜帶的miRNA在組織器官纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但相關(guān)于放射性心肌纖維化損傷的外泌體miRNA報(bào)道非常有限。本研究旨在探討“外泌體通過其信號(hào)分子miRNA介導(dǎo)輻射旁效應(yīng)參與放射性心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展”，實(shí)驗(yàn)提取了受照射細(xì)胞來源的外泌體，檢測(cè)其miRNA的差異表達(dá)作為介導(dǎo)輻射旁效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬通過共培養(yǎng)的方式以“受照射成纖維細(xì)胞來源的外泌體干預(yù)未照射細(xì)胞”，觀察外泌體miRNA介導(dǎo)的輻射旁效應(yīng)對(duì)未照射細(xì)胞的影響。所以本文檢測(cè)外泌體中的miRNA，而非直接對(duì)心肌成纖維細(xì)胞中的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，目的在于關(guān)注外泌體miRNA介導(dǎo)的輻射旁效應(yīng)在放射性心臟纖維化損傷中的作用。由于，外泌體參與到電離輻射旁效應(yīng)的關(guān)鍵一步就是進(jìn)入到旁效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)，從而傳遞其攜帶的miRNAs等信號(hào)分子，為了進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體miRNAs是否會(huì)傳遞至旁效應(yīng)細(xì)胞，譚雯等人的研究采用熒光標(biāo)記追蹤外泌體進(jìn)入接收細(xì)胞的情況，并選取特定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)旁效應(yīng)細(xì)胞中目標(biāo)miRNA的水平[24]，課題組也將會(huì)在后續(xù)的研究中對(duì)關(guān)注的目標(biāo)miRNAs進(jìn)行類似方法的驗(yàn)證檢測(cè)。

3.2 X射線對(duì)成纖維細(xì)胞外泌體微RNA表達(dá)譜的影響

基于以上結(jié)果，本研究運(yùn)用RNA-seq技術(shù)全面系統(tǒng)測(cè)序分析了X射線輻射誘導(dǎo)的外泌體中miRNA表達(dá)譜的變化，結(jié)果顯示，差異表達(dá)的miRNAs中上調(diào)表達(dá)的miRNAs∣log2FC∣>2共8個(gè)，下調(diào)表達(dá)的miRNA∣log2FC∣>2的共12個(gè)。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)梳理發(fā)現(xiàn)，目前這些差異表達(dá)的miRNAs在放射性心肌纖維化損傷研究中的報(bào)道較少，但在其他心血管疾病及器官纖維化研究中有報(bào)道，課題組重點(diǎn)關(guān)注了這些研究：(1)在差異表達(dá)上調(diào)的miRNAs的相關(guān)研究中①miR-212的心血管過表達(dá)可能導(dǎo)致心肌肥大，miR-212可能通過叉頭框蛋白O3(Forkhead box protein O3，F(xiàn)OXO3)非依賴性機(jī)制在心肌肥大的發(fā)展中發(fā)揮作用[25]； ②miR-483-5p過表達(dá)顯著增加了缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[26]； ③敲低miR-134-5p可限制心肌梗塞大鼠模型中的不良心肌重塑，表現(xiàn)為減輕心肌細(xì)胞肥大和纖維化[27]；此外，miR-134在特發(fā)性肺纖維化中表達(dá)上調(diào)[28]。 ④miR-193不僅在肥厚型心肌病彌漫性心肌纖維化患者血清中上調(diào)[29]，還是肝纖維化中細(xì)胞外基質(zhì)基因TGF-β依賴性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的一部分[30]，miR-193在活化的肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生顯著變化，調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[31]；(2)差異表達(dá)下調(diào)的miRNAs在纖維化的相關(guān)研究中主要表現(xiàn)為負(fù)向調(diào)控作用： ①miR-195通過負(fù)向調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制大鼠心肌纖維化，當(dāng)miR-195表達(dá)下調(diào)時(shí)，這種作用可能被抑制[32]； ②miR-122負(fù)調(diào)控骨骼肌纖維化中的TGF-β/Smad信號(hào)通路，miR-122的過表達(dá)可以延緩纖維化進(jìn)程[33]。由于這些差異表達(dá)的外泌體miRNAs與放射性心肌纖維化關(guān)系的研究鮮有報(bào)導(dǎo)，課題組后期將進(jìn)行深入研究探索。

3.3 差異微RNA靶基因富集通路與心血管纖維化

miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，一種miRNA可能調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因，而一種基因還可能被多個(gè)miRNAs靶向調(diào)節(jié)，即miRNA與其靶點(diǎn)之間的關(guān)系比較復(fù)雜，可能并不是一對(duì)一的[34]。本研究使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行通路富集分析，富集到PI3K-Akt、MAPK、mTOR、ECM-receptor interaction、cAMP、Wnt、TGF-β和Notch等信號(hào)通路。與本文篩選出的信號(hào)通路相關(guān)的研究表明：(1)cAMP依賴性信號(hào)傳導(dǎo)與CFs活化和ECM合成有關(guān)[35]；β-腎上腺素能通過cAMP/Rap1/Rac/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路，直接激活的cAMP/EP發(fā)揮心,血管保護(hù)作用[36]。(2)有趣的是，MAPK信號(hào)通路既是上調(diào)表達(dá)miRNA也是下調(diào)表達(dá)miRNA靶基因富集到的信號(hào)通路，文獻(xiàn)表明，重要信號(hào)節(jié)點(diǎn)P38-MAPK可調(diào)節(jié)CFs功能的多個(gè)方面，包括炎癥反應(yīng)、肌成纖維細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換和心肌細(xì)胞肥大的旁分泌誘導(dǎo)[37]。有實(shí)研究證明，沉默Ctgf使MAPK信號(hào)通路失活，可以減輕擴(kuò)張型心肌病大鼠的心肌纖維化和左心室肥大[38]。(3)成纖維細(xì)胞特異性TGF-β-Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)更是心血管纖維化的基礎(chǔ)，典型的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過促進(jìn)基因表達(dá)來控制纖維化的Smad2、Smad3轉(zhuǎn)錄因子[39]。(4)研究證明，PI3K/Akt信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，參與調(diào)控心血管纖維化的發(fā)生、發(fā)展和病理形成[40]。(5)AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kina，AMPK)是一種細(xì)胞能量傳感器，是對(duì)缺血期間發(fā)生的心肌細(xì)胞應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)的重要組成部分，研究發(fā)現(xiàn)，它在調(diào)節(jié)心肌纖維化方面具有重要作用[41]。此外，miRNAs也可通過靶向調(diào)節(jié)Wnt[42]、Notch[43]、Ras[44],和Rap1[45]等信號(hào)分子也參與心血管損傷及纖維化病變。以上這些研究結(jié)合本課題篩選的信號(hào)通路表明，差異表達(dá)的外泌體miRNA可能會(huì)通過調(diào)節(jié)靶基因及相關(guān)信號(hào)通路引起放射性心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，但其作用機(jī)制及各差異表達(dá)miRNA與各通路之間正、負(fù)調(diào)控的關(guān)系仍有待課題組后期驗(yàn)證。

生信分析富集到的信號(hào)通路僅作為預(yù)測(cè)，本研究中差異表達(dá)的miRNA靶基因富集到的MAPK、PI3/AKT和mTOR等信號(hào)通路，主要是通過通路中關(guān)鍵分子磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮細(xì)胞生理功能調(diào)節(jié)的，并非主要依靠轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。而microRNA對(duì)基因的調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平[46]，對(duì)蛋白質(zhì)的磷酸化無太大意義。因此，在深入探討“外泌體miRNA通過輻射旁效應(yīng)參與放射性心血管纖維化損傷的機(jī)制”研究中，應(yīng)該著重關(guān)注本研究生信分析富集到的ECM、cAMP、TGF-β、Wnt、Notch、Ras和Rap1等信號(hào)通路。

3.4 小結(jié)與展望

X射線照射可以誘使RCF外泌體miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化。富集分析表明，差異表達(dá)的miRNA可能通過調(diào)控ECM、cAMP、TGF-β、Wnt、Notch、Ras和Rap1等信號(hào)通路中的某些通路，在放射性心血管纖維化損傷的發(fā)展過程中發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制仍有待驗(yàn)證。此外，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是組織器官纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[47]。課題組后期將結(jié)合成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)，深入分析本文差異表達(dá)的miRNA與相關(guān)信號(hào)通路在放射性心血管纖維化損傷過程中的具體機(jī)制，進(jìn)一步探討RIHD的可能干預(yù)思路。