艾道迎，鄭奕柔，黃展銳*，趙良忠*，林麗丹，周衡平，周凱，周勁松，尹世鮮

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽，422000) 2(深圳市通量檢測科技有限公司，廣東省高特異性生物快速檢測工程技術(shù)研究中心，廣東 深圳，518038) 3(平江縣勁仔食品有限公司，湖南 岳陽，414000)

鹵制品是我國的傳統(tǒng)食品，種類豐富、口味獨特、食用方便，深受人們喜愛，鹵汁是鹵制品最重要的載體。湘派鹵汁(下文均簡稱鹵汁)通常是在不人為添加防腐劑、護(hù)色劑等情況下，將數(shù)十種中藥材、菜籽油和動物骨架等熬煮成濃湯與調(diào)味料按比例混合熬制而成[1-2]。鹵汁成分復(fù)雜，含有脂肪、蛋白質(zhì)、NaCl、氨基酸、有機酸、糖類及香料成分[3-4]，在鹵制品的風(fēng)味形成中起決定性作用。在業(yè)界普遍以“百年傳承，老鹵為珍”的理念下，鹵汁在實際生產(chǎn)過程中一般被反復(fù)循環(huán)使用，周期從十幾天到上百天不等，每次鹵制時鹵制品中的可溶性營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)會遷移到鹵汁中[5-7]。此外，鹵汁在生產(chǎn)加工、反復(fù)使用過程中，可能因操作管理不規(guī)范、儲存不當(dāng)滋生霉菌，進(jìn)而產(chǎn)生真菌毒素，增加鹵制品的食品安全風(fēng)險[8-9]。

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在一定條件下產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[10]，對人和動物的肝腎、生殖系統(tǒng)具有毒性損害作用，可以誘發(fā)人和動物產(chǎn)生各種急性或慢性疾病具有“三致效應(yīng)”[11-12]。根據(jù)鹵汁的各種原料，如食用油、香辛料等中真菌毒素污染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)[13-15]，在種植、生產(chǎn)、儲存、加工和流通環(huán)節(jié)均可能因運輸條件不當(dāng)或儲存環(huán)境不適而造成不同程度的真菌毒素污染[16]。一直以來，老鹵汁類產(chǎn)品的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)大部分都是按照GB 31644—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 復(fù)合調(diào)味料》制定[17]，但其中沒有相關(guān)真菌毒素含量限定要求，為更好控制市場鹵制品質(zhì)量，進(jìn)一步提高鹵汁安全性，開發(fā)快速、靈敏、準(zhǔn)確的多種真菌毒素同步檢測方法十分必要。

目前，常見的真菌毒素檢測手段有:薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、高效液相色譜-熒光檢測(high performance liquid chromatography-fluorescence detection, HPLC-FLD)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)等[18]。其中，TLC法雖然樣品前處理快速方便，但靈敏度低、重現(xiàn)性較差；ELISA法一般用于定性篩查檢測，且假陽性率高，無法作為確證實驗[19]；HPLC-FLD法常用于檢測具有類似化學(xué)性質(zhì)或單一的真菌毒素[10]，但定性能力不足，難以完成對多種真菌毒素同步檢測；相較而言，LC-MS/MS技術(shù)具有選擇性強、靈敏度高、定量定性分析能力強等優(yōu)點，是多種毒素同步檢測的最佳方法[20-21]。鹵汁是一種十分復(fù)雜的油水混合物基質(zhì)，其中存在大量脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，以及可能存在的其他待測物之間相互干擾易造成基質(zhì)效應(yīng)，成為鹵汁中多種真菌毒素同步檢測的主要障礙。

本研究以鹵汁為研究對象，發(fā)現(xiàn)常規(guī)真菌毒素前處理過程相對繁瑣，易因步驟過多而造成目標(biāo)毒素?fù)p失嚴(yán)重，從而回收率降低。通過優(yōu)化樣品前處理提取和凈化方法，采用同位素內(nèi)標(biāo)法校正樣品基質(zhì)干擾，建立黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)，黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2, AFB2)，黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1, AFG1)，黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2, AFG2)，伏馬毒素B1(fumonisin B1, FB1)，T-2毒素(trichothecenes, T-2)，HT-2毒素(系T-2毒素代謝產(chǎn)物)，玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)，赭曲霉毒素(ochratoxin A, OTA)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)等10種湘派鹵汁常見真菌毒素同步檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。為休閑鹵制品行業(yè)中真菌毒素定量檢測及政府相關(guān)職能部門提供技術(shù)支持，保障居民食用健康、安全的鹵制品。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LC-30AD高效液相色譜儀，日本島津公司；API4000QTRAP質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司；SB-5200DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY18R型臺式冷凍離心機，澳大利亞Dynamica公司；HYQ-3110渦旋混勻器，蘇州捷美電子有限公司。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈(均為色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)，嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品(DON)，T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品(T-2)，HT-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品(HT-2)，赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品A(OTA)，玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品(ZEN)，青島普瑞邦生物工程有限公司；10種真菌毒素同位素標(biāo)準(zhǔn)品，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；實驗用鹵汁樣品取自湖南本地鹵制品公司、小作坊或農(nóng)貿(mào)市場，取樣后于低溫冰箱保存。

1.3 實驗條件

1.3.1 10種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別準(zhǔn)確稱取10種真菌毒素1 mg(精確至0.01 mg)于稱量瓶中，加入適量甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶定容至刻度，配制成10種各為100 μg/mL真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，在-20 ℃下密封保存，有效期1年。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別吸取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL于10 mL容量瓶中，稀釋配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，轉(zhuǎn)移至試劑瓶，避光密封儲存于-20 ℃冰箱中，有效期半年。

混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液:準(zhǔn)確吸取250 μL 10種同位素內(nèi)標(biāo)于同一容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，轉(zhuǎn)移至試劑瓶在-20 ℃下密封保存，有效期半年。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液:準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用甲醇配制成10、20、50、100、200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃保存，有效期7 d。

1.3.2 樣品前處理

以鹵汁為例，取2 mL鹵汁試樣于15 mL離心管中，均加入100 μL內(nèi)標(biāo)混合工作液，分別加入10 mLV(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=84∶15∶1提取液，渦旋振蕩3 min，超聲波提取25 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，在-20 ℃下冷凍35 min，分離上清液，取上層清液1 mL于已提前加入1 mL水的5 mL離心管中稀釋凈化，渦旋混勻，高速離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜上機待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Venusil ASB-C18 (2.1 mm×100 mm×3 μm)，進(jìn)樣量3.0 μL，柱溫40 ℃，流速0.5 mL/min；流動相：A為純甲醇，B為一級水，梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)，離子源溫度500 ℃；(正模式)氣簾氣：35 psi，氣體1：55 psi，氣體2：55 psi；離子噴霧電壓：(正模式)+5 500 V/(負(fù)模式)-4 500 V；(負(fù)模式)氣簾氣：35 psi，氣體1:65 psi，氣體2：65 psi；采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進(jìn)行檢測，其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜條件參數(shù)Table 2 Mass spectrometry condition parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 真菌毒素的分離優(yōu)化

本研究通過優(yōu)化流動相洗脫梯度，優(yōu)化質(zhì)譜離子源以及各真菌毒素的碰撞能和去簇電壓等參數(shù)，可大幅減少鹵汁復(fù)雜基質(zhì)在目標(biāo)毒素檢測過程中其他物質(zhì)的干擾，并以期獲得最佳的檢測靈敏度和分離效率。結(jié)合10種目標(biāo)真菌毒素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異，在正、負(fù)電離模式下進(jìn)行母離子掃描，設(shè)置掃描范圍為200～800 u，在相同濃度條件的檢測中確定不同模式下化合物的響應(yīng)值。優(yōu)化結(jié)果表明，DON、ZEN在負(fù)模式下響應(yīng)強度較明顯，其他化合物在正模式下靈敏度較高，MRM色譜圖如圖1和圖2所示。

a-AFB1;b-AFB2;c-AFG1;d-AFG2;e-FB1;f-HT-2;g-T-2;h-OTA圖1 八種真菌毒素混標(biāo)的正模式MRM色譜圖(100 ng/mL)Fig.1 Positive mode MRM chromatogram of eight mycotoxins mixed standards (100 ng/mL)

a-DON;b-ZEN圖2 兩種真菌毒素混標(biāo)的負(fù)模式MRM色譜圖(100 ng/mL)Fig.2 Negative mode MRM chromatogram of two mycotoxins mixed standards (100 ng/mL)

2.2 前處理方法優(yōu)化

為有效提高目標(biāo)真菌毒素在鹵汁和菜籽油基質(zhì)中的提取效率，在流動相一定的基礎(chǔ)上綜合考量10種真菌毒素的極性差異，使用不同有機相及不同比例的提取液進(jìn)行提取。以鹵汁基質(zhì)為例，分別考察常用10 mL甲醇、10 mL乙腈、10 mLV(甲醇)∶V(水)=98∶2、10 mLV(乙腈)∶V(水)=98∶2和10 mLV(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=84∶15∶1提取液進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)在本實驗中，用甲醇、乙腈、V(甲醇)∶V(水)=98∶2和V(乙腈)∶V(水)=98∶2等4種提取液處理時，基質(zhì)中大量除目標(biāo)待測物外的物質(zhì)被提取液中高比例的有機溶劑提取出，造成檢測靈敏度降低；其次，大部分真菌毒素的回收率也無法滿足要求。經(jīng)過優(yōu)化，使用V(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=84∶15∶1提取液時，對非極性較大的化合物(如赭曲霉毒素、黃曲霉毒素等)和對極性較大的化合物(如伏馬毒素等)提取效果均較好，同時各目標(biāo)真菌毒素的加標(biāo)回收率為78.6%～107.3%。綜合考慮，在鹵汁、菜籽油基質(zhì)中以V(乙腈)∶V(水)∶V(乙酸)=84∶15∶1為前處理提取液，10種真菌毒素均具有良好的提取效果。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)能直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析時是必須考察的因素[22]。本研究采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率考察目標(biāo)毒素在鹵汁和菜籽油中的信號增強或抑制的程度?；|(zhì)效應(yīng)按公式(1)計算:

(1)

式中：SSE,基質(zhì)效應(yīng)；K1,空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；K2,純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

SSE<0.8，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；0.81.2，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)[23-24]。結(jié)果顯示，鹵汁和菜籽油均有不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，不同毒素在這2種基質(zhì)中呈現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)范圍分別為26.58%～147.02%和41.36%～129.42%。目前解決基質(zhì)效應(yīng)的常見方法主要有內(nèi)標(biāo)法和基質(zhì)匹配校正曲線法等[23]，本實驗在上機時向所有樣品和標(biāo)品中均加入較低濃度穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，從而補償其基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)驗證

按1.3.1配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，除空白對照組實驗結(jié)果，以目標(biāo)分析物峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)、相應(yīng)目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍、回歸方程和相關(guān)系系數(shù)(R2)見表3。通過目標(biāo)物在3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)下對應(yīng)的峰面積計算濃度，并確定各目標(biāo)物的方法檢出限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantification，LOQ)，結(jié)果表明10種真菌毒素在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2>0.998 5。

表3 十種真菌毒素的線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 3 Linear relationships, LOD, and LOQ of the ten mycotoxins

選取鹵汁、菜籽油2類空白基質(zhì)樣品,進(jìn)行低、中、高3個濃度水平加標(biāo)實驗，按1.3.2處理樣品，每個加標(biāo)水平平行測定6次，計算6次加標(biāo)實驗的平均回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。由表4可以看出，本方法回收率和精密度結(jié)果良好，回收率為78.6%～107.3%，RSD<15%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，適用于鹵汁中10種真菌毒素的日常檢測。

表4 十種真菌毒素加標(biāo)回收率及精密度(n=6)Table 4 The spiked recoveries and precision of 10 mycotoxins (n=6)

2.5 實際樣品測定

應(yīng)用建立的方法，對選取的20份實際樣品連續(xù)進(jìn)樣檢測，結(jié)果如表5，其中鹵汁中有1份AFB1檢出，檢出率為7.14%，含量為0.46 μg/kg，3種真菌毒素AFB1、OTA和ZEN在菜籽油中分別有2、1、2份檢出，檢出率分別為33.3%、16.7%、33.3%，含量范圍分別為0.36～0.47 μg/kg、0.59 μg/kg、4.28～5.06 μg/kg，其他毒素均未檢出。菜籽油中有多種真菌毒素檢出但都尚屬較低劑量，這與其他研究結(jié)論大致一致，出現(xiàn)此現(xiàn)象原因可能是檢測的多數(shù)樣本來自小作坊式土法壓榨，其加工工藝粗糙、衛(wèi)生安全意識淡??；此外南方地區(qū)高溫潮濕，在菜籽油原料收割、加工和儲存過程中易導(dǎo)致霉菌生長繁殖，受真菌毒素污染風(fēng)險高[25-26]。在湘派鹵汁中首次檢測出AFB1，這與陳浩等[2]研究結(jié)果不一致，分析原因可能是鹵汁熬完后在反復(fù)鹵制使用過程中一般溫度控制在90 ℃上下[1]，AFB1耐高溫、性質(zhì)穩(wěn)定、不易裂解；另外導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能是熬制鹵汁的原材料(如菜籽油、香辛料等)的加入，由于許多香辛料隸屬于中藥材，和菜籽油一樣從原料種植、采收到貯藏極易受到真菌毒素的侵害發(fā)生霉變不便察覺[27]，在中藥材中現(xiàn)已有多種真菌毒素被檢出[28-29]。因此為確保休閑鹵制品的安全，保障消費者健康，對鹵汁生產(chǎn)加工和貯藏過程進(jìn)行真菌毒素的檢測和監(jiān)管顯得尤為重要。

表5 鹵汁、菜籽油實際樣品檢測結(jié)果Table 5 The actual sample test results of brine and canola oil

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化前處理提取液和直接提取稀釋凈化的快速前處理方法，并采用LC-MS/MS檢測和同位素內(nèi)標(biāo)定量分析，建立了鹵汁中10種真菌毒素同步檢測方法。經(jīng)方法學(xué)驗證及實際樣品檢測，回收率、靈敏度、檢出限等均滿足方法學(xué)要求；該方法前處理簡單、靈敏度好、回收率高且檢測成本低，適用于鹵汁中多種真菌毒素的快速檢測和精準(zhǔn)定量。