孫佳萌，劉 震，黃永勝，孫海丹，郭正光，康維明*，孫 偉*

(1.中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院 藥理系，北京100005;2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基本外科，北京100730)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori，Hp)是一種螺旋形、革蘭染色陰性，微需氧、鞭毛狀的細菌，能夠形成生物膜，并可以從螺旋狀轉(zhuǎn)化為球狀[1]。Hp 感染是胃癌發(fā)生的重要危險因素之一，感染Hp的患者發(fā)生胃癌的風險比未感染者高3倍左右，胃癌患者Hp陽性率為75%-95%[2-3]。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將 Hp歸類為 “I類”致癌因子[4]。但在一些情況下，在胃癌患者中未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于Hp感染的證據(jù)，這就提示在胃癌中存在Hp陰性胃癌[5]。

王炯等[6]通過對現(xiàn)有有關(guān)Hp陰性胃癌的研究成果進行總結(jié)分析后發(fā)現(xiàn)，與Hp陽性胃癌相比，Hp陰性胃癌患者的腫瘤惡行程度更高，預(yù)后更差。同樣地，TSAI等[5]通過回顧性分析Hp陽性與Hp陰性的胃癌案例，發(fā)現(xiàn)Hp陰性胃癌患者的預(yù)后較差，且Hp陰性狀態(tài)是胃癌預(yù)后不良的獨立危險因素。但也有研究指出Hp的感染能夠通過影響某些RNA的表達而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，進而影響患者的預(yù)后情況[7]。目前關(guān)于不同Hp感染狀態(tài)胃癌的研究還很少，還缺乏對二者差別的相關(guān)組學分析。

腫瘤異質(zhì)性是惡性腫瘤的主要特征之一,可使腫瘤的生長速度、侵襲與轉(zhuǎn)移、藥物敏感性、預(yù)后等各方面產(chǎn)生差異。腫瘤異質(zhì)性包括瘤內(nèi)異質(zhì)性和瘤間異質(zhì)性，其組織病理學特征不同，分子特征也各異，其已知胃癌具有高度的腫瘤間異質(zhì)性[8-9]，但胃癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性研究相關(guān)報道還很少。

近年來，組學及相關(guān)技術(shù)迅速發(fā)展，在臨床生物學的研究中逐漸得到了廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)組學以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究細胞或組織中蛋白質(zhì)的組成變化及規(guī)律，是理解基因功能的重要方法之一[10]?；谫|(zhì)譜的高通量和高精度蛋白質(zhì)組學技術(shù)的飛速發(fā)展使得蛋白質(zhì)組學在腫瘤研究中得到廣泛研究，目前已應(yīng)用于胃癌[11-12]等癌癥疾病的研究。

目前，對于胃癌的腫瘤異質(zhì)性和Hp感染相關(guān)胃癌的蛋白質(zhì)組學報道很少。本研究將通過最新的蛋白質(zhì)組學方法，分析胃癌腫瘤異質(zhì)性以及Hp陽性與Hp陰性胃癌蛋白質(zhì)組差異，將有助于了解與Hp相關(guān)胃癌的蛋白質(zhì)組特征，為今后尋找更高敏感性和特異性的新的治療方法、提高患者的生存率提供了新的途徑和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：十二烷基硫酸鈉(SDS，USB公司)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，拜爾迪公司),二硫蘇糖醇(DTT，INALCO SpA公司)，碘乙酰胺(IAM，拜爾迪公司)，丙酮(分析純，國藥集團化學試劑公司)，胰蛋白酶(Trypsin，華利世科技公司)，水(質(zhì)譜級)

研究對象：選取2019年就診于北京協(xié)和醫(yī)院的胃癌受試者，通過C13呼氣實驗和病理切片HE染色確認胃癌患者Hp的感染狀態(tài)，選取Hp陽性患者和Hp陰性患者各1例，經(jīng)外科手術(shù)切除腫瘤組織，收集患者的腫瘤組織不同部位標本各3個，相應(yīng)地在距離腫瘤位置大約5 cm處取癌旁組織不同部位各3個，將采集的組織樣本存放于-80℃冰箱冷凍保存。參與本研究的患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1蛋白質(zhì)提取和酶解 取組織樣本剪碎后加入裂解液(2% SDS,20 mM Tris,pH 8.0)，經(jīng)超聲助溶后離心去除未溶解的組織碎片。取200 μg蛋白質(zhì)依次進行還原烷基化，加入工作濃度為10 mM DTT，95℃孵育5 min，降至室溫后加入工作濃度為55 mM IAM，室溫避光放置45 min，對暴露出來的巰基進行封閉。采用6倍體積的預(yù)冷丙酮對還原烷基化后的蛋白質(zhì)進行沉淀，經(jīng)14 000 g離心10 min后，棄去上清，在沉淀中加入20 mM Tris對純化的蛋白質(zhì)進行復(fù)溶。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到經(jīng)過平衡后的30 kDa超濾膜內(nèi)套管中，酶解用FASP方法(Filter-aided sample preparation)，胰蛋白酶酶解后肽段產(chǎn)物經(jīng)SPE小柱純化，取等量肽段分別加入1 μl的質(zhì)譜時間校正肽段iRT進行后續(xù)液質(zhì)串聯(lián)檢測分析。

1.2.2高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測 利用液-質(zhì)聯(lián)用儀器對于臨床組織樣本蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物進行差異蛋白質(zhì)分析，每個反應(yīng)上樣量為2 μg 肽段。高效液相色譜分析采用Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific公司)，液相程序60 min，流速為 800 nl/min。A相成分是含0.1% FA的水溶液，B相成分是含0.1% FA 的乙腈溶液。液相有效分離梯度設(shè)置如下：1 min B相濃度從2%升至6% B；16 min B相濃度從6%升至10% B；23 min B相濃度從10%升至20% B；8 min B相濃度從20%升至28% B；5 min B相濃度從28%升至95% B。蛋白質(zhì)組學分析采用Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)，采集模式為陽離子模式，噴霧電壓設(shè)置為 2.3 kV，離子傳輸管溫度為 320℃。采用非依賴性數(shù)據(jù)采集方式(Data Independent Acquisition,DIA)，設(shè)置13個質(zhì)量掃描區(qū)段，一級質(zhì)譜質(zhì)荷比的掃描范圍350-1300，分辨率為120000，自動增益控制AGC參數(shù)為3e6,最大離子注入時間30 ms，二級質(zhì)譜分辨率為30000，自動增益控制AGC參數(shù)為1e5，最大離子注入時間為45 ms。質(zhì)量隔離窗口為4Da，碰撞能量參數(shù)設(shè)置為23%，離子動態(tài)排除時間為30 ms。

1.2.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學處理 原始數(shù)據(jù)(raw格式文件)采用Spectronaut軟件(Biognosys公司)構(gòu)建譜圖數(shù)據(jù)庫，并對樣本進行定量分析，檢索數(shù)據(jù)庫選用自2019年Uniprot 上下載的 human 數(shù)據(jù)庫。差異蛋白質(zhì)的篩選標準為：差異倍數(shù)(Fold Change)為2倍，同時滿足p value≤ 0.05。對于篩選出的差異蛋白質(zhì)采用Ingenuity Pathway Analysis(IPA，Biotech公司)軟件進行生物學功能分析。對質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行質(zhì)譜檢索后由Spectronaut軟件進行統(tǒng)計學分析。用兩獨立樣本ttest檢驗。以 p value ≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

收集Hp陽性和陰性胃癌患者的腫瘤及癌旁組織各1例，分別取腫瘤組織和相應(yīng)癌旁組織的3個不同部位進行處理，經(jīng)過質(zhì)譜DIA定量分析，在兩組樣本中共鑒定到3 8684個肽段，5 536個蛋白質(zhì)，鑒定出2個或以上肽段的蛋白質(zhì)共有3 976個，用于后續(xù)差異定量分析。

2.1 胃癌腫瘤空間異質(zhì)性分析

將Hp陽性與陰性腫瘤組織不同部位鑒定到的蛋白兩兩進行差異分析，以此來評估胃癌腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性。根據(jù)Hp+與Hp-不同部位腫瘤組織蛋白數(shù)據(jù)分布顯示(圖1)，T1/T2、T1/T3、T2/T3各組中差異倍數(shù)過大(log2FoldChange<-2或log2FoldChange>2)的蛋白在Hp陽性分別占全部蛋白的2.7%(139/5 225)、2.4%(127/5 227)、2.4%(127/5 228)，在Hp陰性中分別占全部蛋白的4.4%(228/5 194)、5.0%(260/5 195)、5.7%(295/5 220)，即胃癌腫瘤內(nèi)存在一定的異質(zhì)性。

將上述蛋白進行功能比較分析(圖1)，IPA分析結(jié)果顯示，這些蛋白在能量代謝、細胞增殖與侵襲、細胞生存與死亡、免疫應(yīng)答反應(yīng)、病毒感染等相關(guān)通路的激活與抑制具有顯著性差異。

在Hp陽性中，與能量代謝相關(guān)通路，如磷脂代謝、鞘磷脂代謝、固醇類的合成等具有顯著差異；與細胞增殖侵襲相關(guān)通路，如腫瘤細胞的增殖和生長具有明顯差異；與細胞存活與死亡相關(guān)通路，如細胞壞死、凋亡、自噬等功能都具有顯著性差異，同時細胞活力與存活也具有顯著性差異；與免疫應(yīng)答相關(guān)通路，如活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生及數(shù)量、細胞修復(fù)、細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等都差異顯著，Hp感染的患者機體內(nèi)免疫反應(yīng)發(fā)生了變化；與蛋白質(zhì)有關(guān)通路，如蛋白質(zhì)的翻譯具有顯著差異性，也就是說Hp感染的胃癌腫瘤可能會通過影響蛋白的翻譯進而影響蛋白的表達；與病毒感染相關(guān)通路，如HIV等RNA病毒感染具有顯著性差異。相比于Hp陽性，在Hp陰性中，與細胞增殖侵襲相關(guān)通路，如腫瘤細胞的移動遷移以及侵襲等具有差異性顯著；與免疫應(yīng)答反應(yīng)等相關(guān)通路，如與白細胞的結(jié)合、細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有顯著性差異；與蛋白質(zhì)有關(guān)通路，如蛋白質(zhì)的產(chǎn)生以及轉(zhuǎn)運差異性顯著，未感染Hp的胃癌腫瘤可能會通過影響蛋白的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運進而影響蛋白的表達。因此，胃癌腫瘤組織內(nèi)異質(zhì)性的存在可能影響了蛋白的表達，而且在Hp陰性和Hp陽性中影響的通路和功能不盡相同。

圖1 a.Hp陰性與Hp陽性腫瘤組織內(nèi)差異倍數(shù)過大蛋白數(shù)據(jù)分布散點圖。縱坐標Value表示log2FoldChange。b.Hp陰性與Hp陽性腫瘤組織差異倍數(shù)過大蛋白的功能比較分析。顏色深淺表示p value大小，顏色越深表示差異越顯著(p value<0.05具有顯著性差異)。

2.2 胃癌與癌旁蛋白質(zhì)組學差異分析

將鑒定到的3 976個蛋白質(zhì)進行差異定量分析，Hp陰性和陽性的腫瘤組織與其各自的癌旁組織相比，按照上述篩選標準，在Hp陽性患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)1 843個蛋白的表達量與癌旁組織相比，發(fā)生改變，其中有1 049個蛋白上調(diào)，794個蛋白下調(diào)；在Hp陰性患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)1 630個蛋白的表達量發(fā)生變化，其中有703個上調(diào)差異蛋白，927個下調(diào)差異蛋白(表1和圖2)。因此，無論是否感染Hp，胃癌的腫瘤組織蛋白質(zhì)組特征與癌旁組織蛋白質(zhì)組特征具有顯著差異。

表1 質(zhì)譜分析篩選的差異表達蛋白數(shù)目

圖2 a.Hp陽性腫瘤與癌旁差異表達蛋白火山圖。b.Hp陰性腫瘤與癌旁差異表達蛋白火山圖。c.Hp陽性與陰性的腫瘤與相應(yīng)癌旁組織差異表達蛋白功能分析。顏色深淺表示z score大小，紅色表示具有正相關(guān)性，藍色表示具有負相關(guān)性，顏色越深表示相關(guān)性越強。

之后對上述差異表達蛋白進行功能分析(圖2)。IPA分析結(jié)果表明，無論Hp的感染狀態(tài)如何，胃癌的腫瘤組織與癌旁組織相比，與免疫應(yīng)答反應(yīng)、細胞遷移、細胞生存與死亡、細胞增殖侵襲有關(guān)功能發(fā)生變化。IPA結(jié)果顯示，與免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)功能，如細胞脫顆粒、細胞吞噬作用、細胞免疫反應(yīng)等都具有顯著激活趨勢，機體免疫應(yīng)答反應(yīng)增強；與細胞遷移相關(guān)功能，如腫瘤細胞的移動遷移、白細胞的移動遷移等細胞移動和遷移通路也被明顯激活，體內(nèi)細胞活動加強；與細胞存活死亡相關(guān)功能，如腫瘤細胞壞死以及凋亡相關(guān)通路具有顯著抑制的趨勢，細胞活力和細胞存活率整體增加，在Hp陽性中細胞自噬功能被激活而在Hp陰性中細胞自噬被抑制；與細胞增殖侵襲相關(guān)功能，如腫瘤細胞增殖和侵襲通路具有顯著激活的趨勢。

2.3 Hp陰性與Hp陽性胃癌蛋白質(zhì)組學差異分析

通過差異定量分析(表1和圖3)，在腫瘤組織中，Hp陽性與Hp陰性相比，共有764個蛋白的表達量發(fā)生變化，其中有407個差異蛋白上調(diào)，有357個差異蛋白下調(diào)。因此，Hp陽性與Hp陰性兩種胃癌腫瘤組織蛋白質(zhì)組特征具有顯著差異。

對Hp陽性與Hp陰性差異表達蛋白進行功能分析(圖3)，IPA結(jié)果顯示，兩者的腫瘤組織的差異表達蛋白與細菌生長、免疫反應(yīng)、細胞遷移、細胞存活與死亡、細胞增殖侵襲等功能有關(guān)。

圖3 a. Hp陽性與Hp陰性胃癌腫瘤組織差異表達蛋白火山圖。b. Hp陽性與Hp陰性胃癌腫瘤組織差異表達蛋白功能分析。顏色深淺表示z score大小，紅色表示具有正相關(guān)性，藍色表示具有負相關(guān)性，顏色越深表示相關(guān)性越強。c. Hp陽性與Hp陰性胃癌腫瘤差異表達蛋白相關(guān)通路比較分析。橫坐標表示-log(p value)。

功能分析(圖3)結(jié)果表明，在腫瘤組織中，Hp陽性胃癌患者體內(nèi)與細菌生長有關(guān)功能發(fā)生變化，如細菌生長通路被顯著激活，而與細菌殺死有關(guān)通路被顯著抑制。Hp陽性較Hp陰性胃癌，機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)受到顯著抑制作用，尤其是與細胞脫顆粒反應(yīng)、白細胞遷移、細胞免疫反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)等功能受到重要影響。細胞遷移功能如腫瘤細胞系的移動遷移在Hp陽性中明顯增強，但其他細胞的移動遷移如白細胞和吞噬細胞等具有免疫功能的細胞在Hp陽性中被顯著抑制，從而導(dǎo)致Hp陽性患者機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)降低，與上述結(jié)論互為一致。同時在Hp陽性患者體內(nèi)，細胞壞死、腫瘤細胞系死亡通路被抑制，細胞凋亡增加，腫瘤細胞系活力以及細胞存活率大大升高，腫瘤細胞的增殖和侵襲能力也較Hp陰性大大增強。

通路分析(圖3)結(jié)果表明，Hp陽性與Hp陰性的腫瘤組織相比，LXR/RXR激活通路差異最為顯著，其次為急性期反應(yīng)信號通路，與腫瘤相關(guān)經(jīng)典信號通路如PI3K/AKT信號通路、VEGF信號通路、ERK/MAPK信號通路、PTEN信號通路、蛋白激酶A(PKA)信號通路、腫瘤微環(huán)境通路、PD-1,PD-L1癌癥免疫治療通路等都具有差異，與機體能量代謝相關(guān)通路如脂肪酸β氧化、氧化磷酸化等都發(fā)生變化，免疫與炎性信號通路如IL-8信號、B細胞受體信號等也具有差異性。

3 討論

通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者無論是否感染Hp，其腫瘤組織與癌旁組織相比，蛋白質(zhì)組學特征差異顯著，腫瘤組織與癌旁正常組織具有實質(zhì)性區(qū)別，腫瘤組織中的蛋白表達量發(fā)生明顯變化；這些差異表達蛋白使得患者體內(nèi)一些信號通路以及功能發(fā)生改變，其中主要與細胞增殖、遷移、侵襲、存活、死亡以及免疫應(yīng)答等相關(guān)信號通路和功能相關(guān)。之后比較了Hp不同感染狀態(tài)下腫瘤組織的差異性，分析結(jié)果表明Hp陽性胃癌較Hp陰性胃癌，其腫瘤組織中的蛋白表達發(fā)生顯著改變，也就是說這是兩個不同的腫瘤實體，PI3K/AKT、VEGF、PTEN等信號通路在兩者中也具有差異，體內(nèi)細菌生長、細胞增殖、遷移、侵襲、存活、死亡、免疫應(yīng)答等功能發(fā)生變化。

3.1 胃癌腫瘤異質(zhì)性

胃癌是一種復(fù)雜的、異質(zhì)性的疾病，先前已有研究指出不同個體間腫瘤異質(zhì)性顯著，但胃癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性鮮有報道，在本研究中我們評估了胃癌腫瘤組織樣本的瘤內(nèi)異質(zhì)性問題。由于Hp陰性胃癌病例較為罕見，樣本收集較為困難，所以本研究的病例數(shù)受到限制。為了增加實驗結(jié)果的可靠性，收集樣本時取Hp陽性胃癌與Hp陰性胃癌患者腫瘤及癌旁組織的3個不同部位，作為三個生物學重復(fù)，然后對其三個生物學重復(fù)的結(jié)果取平均值進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。腫瘤異質(zhì)性不僅可以影響診斷，同時也對治療、療效和疾病監(jiān)測、耐藥性和預(yù)后等產(chǎn)生影響，其與臨床診治密切相關(guān)，是實現(xiàn)精準診療和攻克腫瘤的重大挑戰(zhàn)。

通常腫瘤異質(zhì)性會影響某些基因的表達，胃癌的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性在HER2基因背景下研究較多。Ryosuke Tajiri MD等人[13]利用免疫組化和熒光原位雜交聯(lián)合分析，在51例HER2擴增的癌細胞中發(fā)現(xiàn)有41%的HER2擴增腫瘤存在HER2擴增的瘤內(nèi)異質(zhì)性。Wanjing Feng等[14]通過使用突變等位基因腫瘤異質(zhì)性(MATH)評估了胃癌患者的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，結(jié)果顯示高瘤內(nèi)異質(zhì)性較低瘤內(nèi)異質(zhì)性具有較差的預(yù)后及生存率。Phillip Stahl等[15]在研究胃癌中HER2、EGFR、CCND1和MYC基因擴增的異質(zhì)性時發(fā)現(xiàn)腫瘤間異質(zhì)性會影響這些基因的擴增狀態(tài)，但是在單個轉(zhuǎn)移瘤中沒有發(fā)現(xiàn)明確的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。以上研究均顯示胃癌腫瘤存在異質(zhì)性并且會影響一些基因的表達，但是對于胃癌瘤內(nèi)異質(zhì)性各研究結(jié)果并不一致。根據(jù)我們目前的了解，暫無有關(guān)腫瘤異質(zhì)性影響蛋白表達的報道。在本研究中，將Hp陰性與Hp陽性的腫瘤組織兩兩進行差異分析，結(jié)果顯示，無論是Hp陰性還是Hp陽性，其腫瘤組織內(nèi)蛋白的表達變化情況都有差別，存在腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，并且影響蛋白的表達情況。并且功能分析顯示，蛋白產(chǎn)生、翻譯及轉(zhuǎn)運等功能受到影響，更進一步證實胃癌腫瘤異質(zhì)性會影響蛋白的表達。

3.2 胃癌腫瘤與癌旁組織蛋白質(zhì)組學特征差異顯著

先前胃癌的組學研究主要集中于基因組的改變，近年來蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)展迅速，胃癌的蛋白質(zhì)組研究可以提供更全面的基因表達水平及相應(yīng)蛋白水平的變化情況。就胃癌的蛋白質(zhì)組學方面而言，目前對它的理解還只是初步的。近年來兩項對胃癌的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學研究值得我們關(guān)注。Sai Ge等[16]收集了84例彌漫性胃癌患者的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織進行了蛋白質(zhì)組分析，通過對蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)腫瘤組織與癌旁組織的基因產(chǎn)物具有明顯差別，通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)可以將胃癌的腫瘤組織與癌旁進行明顯區(qū)分，并將胃癌組織分為三個亞型，分別與細胞周期失調(diào)、EMT過程、免疫應(yīng)答過程相關(guān)。還有一項來自韓國的關(guān)于彌漫型胃癌的大規(guī)模隊列的蛋白基因組研究[17]，Mun等人收集了80例患有彌漫型胃癌的年輕人群的配對的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織以及血液樣本，進行了全蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組、N-糖基化蛋白質(zhì)組分析。通過整合各蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)以及基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃癌的腫瘤組織與癌旁組織相比，在基因、RNA、蛋白質(zhì)水平都發(fā)生了顯著變化，同樣利用蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)可以將胃癌進行分子分型，這些亞型分別與增殖、免疫反應(yīng)、代謝和侵襲相關(guān)。以上兩項研究結(jié)果均證實胃癌腫瘤組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)組學特征具有顯著差異，可以根據(jù)蛋白質(zhì)組特征區(qū)分胃癌腫瘤組織和癌旁組織。

同樣在本研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對胃癌腫瘤組織和癌旁組織進行了分析，蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)結(jié)果可以將胃癌腫瘤組織與癌旁組織很好的區(qū)分開來，蛋白質(zhì)組特征差異顯著。并且對腫瘤組織和癌旁組織的差異表達蛋白進行功能分析，機體免疫應(yīng)答反應(yīng)、細胞增殖侵襲遷移以及細胞存活與死亡等功能都受到影響。之前的兩項大規(guī)模胃癌蛋白質(zhì)組研究為本研究結(jié)果提供了可靠證據(jù)，本研究結(jié)果也可作為胃癌的蛋白質(zhì)組的補充研究，為今后胃癌的發(fā)生發(fā)展以及診斷治療提供了更好的理解。

3.3 Hp陽性胃癌與Hp陰性胃癌腫瘤蛋白質(zhì)組學特征差異顯著

為了進一步深入研究胃癌的蛋白質(zhì)組學特征，本研究中分析了感染Hp與未感染Hp的胃癌腫瘤組織的蛋白質(zhì)組學特征。目前關(guān)于Hp陽性胃癌與Hp陰性胃癌的蛋白質(zhì)組學特征的研究鮮有報道。在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Hp陽性與Hp陰性胃癌的腫瘤組織蛋白質(zhì)組學特征差異顯著，Hp感染狀態(tài)會對腫瘤組織的蛋白表達產(chǎn)生一定影響，這可能是兩種不同的腫瘤實體。通過對Hp陽性和Hp陰性胃癌的差異表達蛋白進行功能分析和通路分析發(fā)現(xiàn)，感染Hp的患者體內(nèi)與細菌生長有關(guān)通路被顯著激活，免疫應(yīng)答反應(yīng)受到抑制，具有免疫功能的細胞如白細胞、巨噬細胞等的增殖、遷移功能均被抑制；通路分析結(jié)果顯示，PD-1，PD-L1介導(dǎo)的信號通路、腫瘤微環(huán)境、脂肪酸β氧化、氧化磷酸化等信號通路在Hp陰性和Hp陽性胃癌中具有差異。由此推測，機體在感染Hp后可能會影響患者的生存和預(yù)后情況。

Hp是胃內(nèi)的特殊致病菌，是發(fā)生胃癌的重要因素之一，Hp的存在會影響胃內(nèi)其他菌群的定值和分布。Wang Lili等[18]通過qPCR方法測定了慢性胃炎患者和胃癌患者的胃粘膜中的細菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)胃癌患者的胃粘膜中細菌數(shù)量明顯多于慢性胃炎患者，并且還發(fā)現(xiàn)Hp的感染狀態(tài)對細菌負荷有顯著影響，Hp陽性患者的細菌載量明顯高于Hp陰性患者，而且細菌數(shù)量與Hp的數(shù)量呈正相關(guān)，提示Hp感染是胃微生物群細菌數(shù)量的決定因素之一。因此，機體由于感染Hp可能會大大增加體內(nèi)其他細菌的生長以及定值，與本研究結(jié)果顯示的細菌生長通路激活以及細菌死亡通路抑制的結(jié)果是一致的。

Hp感染后會對機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。免疫應(yīng)答是機體免疫系統(tǒng)識別并清除病原體的過程，通過有效的免疫應(yīng)答過程，機體才能維持正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在胃癌組織中常常存在白細胞、腫瘤相關(guān)的巨噬細胞浸潤以及會分泌大量的細胞炎性因子，導(dǎo)致出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。但是從本研究結(jié)果中可以看到，患者在感染Hp后，機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)和炎癥反應(yīng)反而出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象。多項研究[19-21]指出，機體在感染Hp后，Hp表面的脂多糖(LPS)成分會使宿主的主要免疫機制如吞噬細胞活性等下調(diào)，導(dǎo)致免疫細胞對Hp的吞噬清除作用減弱，從而減弱甚至抑制宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時LPS還會影響某些細胞炎癥因子的表達如上調(diào)IL-18下調(diào)IL-1β等[20]，減弱宿主的炎癥反應(yīng)；Hp的定值可以通過調(diào)節(jié)B細胞和T細胞信號通路從而逃避宿主免疫系統(tǒng)[22]，IL-8信號通路、B細胞受體信號通路等在Hp陰性和Hp陽性中的差異性更好的印證了這一點，由此可以形成一個利于Hp生長的環(huán)境，促進Hp的生長增殖和定值?？赡苷怯捎贖p表面LPS成分的存在使得宿主的免疫功能受到抑制，更加有利于Hp本身的生長和定值，從而促進了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。PD-1，PD-L1介導(dǎo)的信號通路、腫瘤微環(huán)境通路在Hp陽性與陰性胃癌中具有顯著差異，其在抑制機體抗腫瘤免疫反應(yīng)以及腫瘤免疫逃逸過程中都發(fā)揮著重要作用[23]。

Hp陰性與Hp陽性胃癌組織細胞的能量代謝方式具有顯著差異。多項研究指出[24-26]，胃癌疾病組與對照組相比，體內(nèi)能量代謝發(fā)生失調(diào)，但在這些研究中并沒有對Hp感染狀態(tài)進行區(qū)分。René G.Feichtinger等人[27]采用免疫組化方法研究了氧化磷酸化系統(tǒng)在胃癌和胃炎中的作用，分析了Hp感染對幾個關(guān)鍵線粒體蛋白的影響，與對照組織相比，腸型胃癌組織的氧化磷酸化作用復(fù)合物發(fā)生顯著變化，并且這種變化與Hp感染無關(guān)，并推測在胃癌中發(fā)現(xiàn)的能量代謝的改變可能獨立于細菌感染發(fā)生。目前關(guān)于Hp不同感染狀態(tài)的胃癌研究還尚少。本研究結(jié)果顯示能量代謝通路如脂肪酸β氧化、氧化磷酸化等與Hp的感染狀態(tài)可能存在一定聯(lián)系，在一定程度上為當前Hp不同感染狀態(tài)的胃癌腫瘤的能量代謝研究提供了補充。但由于本研究受到樣本數(shù)的限制，關(guān)于Hp感染狀態(tài)對能量代謝的影響還需擴大隊列進一步研究。

綜上所述，本文應(yīng)用蛋白質(zhì)組學方法對胃癌的蛋白質(zhì)組特征研究進行了研究，包括腫瘤異質(zhì)性、腫瘤組織與癌旁組織差異及Hp陽性和陰性胃癌。通過本文研究發(fā)現(xiàn)，胃癌腫瘤存在異質(zhì)性，并影響蛋白表達；胃癌的腫瘤組織和癌旁組織蛋白質(zhì)組學特征差異顯著，免疫應(yīng)答反應(yīng)、細胞遷移、細胞生存與死亡、細胞增殖侵襲等功能具有差異；Hp陽性胃癌與Hp陰性胃癌具有不同的蛋白質(zhì)組學特征，腫瘤相關(guān)信號通路以及免疫應(yīng)答、細胞遷移、細胞生存與死亡、細胞增殖侵襲等功能在Hp陽性胃癌與Hp陰性胃癌中表達也存在差異。本文研究加深了對胃癌發(fā)病機制的理解，為進一步進行胃癌發(fā)病機制研究提供了新的線索，也為胃癌的治療干預(yù)和疾病預(yù)防提供了重要思路。