伏瑤琴，金智生，2，金彩云，陳彥旭，姜曉雪，張博玲

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730000

糖尿病腎病是由慢性高血糖所致的腎損害，病變可累及全腎，包括腎小球、腎小管、腎間質(zhì)及腎血管等，糖尿病性腎小球硬化是糖尿病腎病典型的病理特征。根據(jù)腎功能、腎臟病理改變和臨床表現(xiàn)將糖尿病腎病分為5期，糖尿病腎?、笃诩丛缙谔悄虿∧I病時(shí)期已出現(xiàn)腎小球損傷表現(xiàn)，包括腎小球結(jié)節(jié)型和彌漫型病變及小動(dòng)脈玻璃樣變；至V期即終末腎衰竭期，腎小球已表現(xiàn)為不可逆性廣泛硬化。研究發(fā)現(xiàn)，相比健康人群，糖尿病及糖尿病腎病患者均存在不同程度腸道微生態(tài)失調(diào)，表現(xiàn)為腸道細(xì)菌豐富度和多樣性下降，以及腸道代謝產(chǎn)物變化，且這種改變可能通過血流動(dòng)力學(xué)、糖脂代謝、內(nèi)毒素積累及炎癥反應(yīng)等影響糖尿病腎病進(jìn)程[1-2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎絡(luò)瘀阻是糖尿病性腎小球硬化的關(guān)鍵病機(jī)，貫穿糖尿病腎病始終，瘀血是糖尿病性腎小球硬化之根本，故活血化瘀是改善糖尿病性腎小球硬化的重要治法。筆者通過對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)分析，探討活血化瘀法改善糖尿病性腎小球硬化的作用機(jī)制，以期為本病的治療提供新思路。

1 腸道菌群及其代謝物對(duì)糖尿病腎病的影響

腸道菌群是由腸道微生物群構(gòu)成的一個(gè)共生系統(tǒng)，生理狀態(tài)下，菌群之間互相依賴且相互拮抗，共同維持人體腸道微生態(tài)平衡，其組成或功能改變均可能誘發(fā)炎癥性腸病、糖尿病、心血管疾病等。健康人群的腸道菌群存在大量厭氧菌，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌（雙歧桿菌）、梭桿菌門、疣微菌門，而厚壁菌門（乳酸菌、腸球菌、梭狀芽孢桿菌）和擬桿菌門是腸道菌群的主要組成部分，其中擬桿菌、柔嫩梭菌、乳酸菌及雙歧桿菌有益于人體健康[3]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病終末期患者的腸道菌群構(gòu)成發(fā)生明顯改變，厚壁菌門、放線菌門和變形菌門數(shù)量顯著增加，而雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量明顯減少[4]。另外，腸道菌群的構(gòu)成決定其代謝產(chǎn)物的水平和比例。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腸道菌群中氧化三甲胺（TMAO）、硫酸吲哚酚（IS）和對(duì)甲酚硫酸鹽等有害代謝物相對(duì)增加，而短鏈脂肪酸（SCFAs）等有益代謝物相應(yīng)減少，而這些代謝產(chǎn)物通過炎癥、氧化應(yīng)激、血流動(dòng)力學(xué)等途徑在推動(dòng)糖尿病腎病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[3，5]。

1.1 短鏈脂肪酸

腎小球內(nèi)高壓、高灌注、高濾過，以及非血流動(dòng)力學(xué)因素，如炎癥、氧化應(yīng)激等是誘導(dǎo)腎小球硬化的重要因素。糖尿病腎病患者腸道中會(huì)增加產(chǎn)生SCFAs的有益細(xì)菌，使SCFA相應(yīng)增多。SCFAs由厚壁菌門和擬桿菌門通過糖酵解不可消化糖而來，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸，通過調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能改善胰島素抵抗，調(diào)控糖代謝，還可通過上調(diào)瘦素、胰高血糖素樣肽-1和肽YY分泌，以及促進(jìn)脂質(zhì)氧化改善脂質(zhì)代謝[6]。研究發(fā)現(xiàn)，SCFA能利用短鏈脂肪酸受體GPR43介質(zhì)抑制氧化應(yīng)激和核因子-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，有效改善2型糖尿?。═2DM）引起的腎組織形態(tài)變化和腎功能障礙，其中丁酸鹽作用尤為突出，能顯著改善高血糖和胰島素抵抗，抑制系膜基質(zhì)積聚和腎纖維化，并防止蛋白尿產(chǎn)生，從而延緩腎小球硬化進(jìn)展[7]。Felizardo等[8]對(duì)腎病小鼠腹腔注射丁酸鹽，發(fā)現(xiàn)不僅可上調(diào)體內(nèi)乙酸鹽及丙酸鹽水平，還可通過保留腎小球基底膜足細(xì)胞改善蛋白尿，減輕腎小球硬化和組織炎癥。

1.2 硫酸吲哚酚

研究發(fā)現(xiàn)，終末期腎病患者血清IS 水平顯著升高[9]。IS屬腸道細(xì)菌的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，不僅通過激活芳香烴受體調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)環(huán)境外源性物質(zhì)的反應(yīng)，促進(jìn)血管炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，還可刺激近端腎小管細(xì)胞上皮間充質(zhì)表型變化，活化腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RASS），從而誘導(dǎo)間質(zhì)纖維化和腎小球硬化[10-11]。給予終末期腎病大鼠過量IS，能刺激腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）生物活性增加，增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1和1型膠原蛋白表達(dá)，加速腎小球硬化和間質(zhì)纖維化進(jìn)展[12]。

1.3 硫化氫與氧化三甲胺

機(jī)體中大腸桿菌、腸沙門菌、梭菌等厭氧菌可經(jīng)過半胱氨酸脫硫酶將半胱氨酸轉(zhuǎn)化成硫化氫，高糖可抑制內(nèi)源性硫化氫生成，進(jìn)而刺激腎細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生[13]。黃雯等[14]發(fā)現(xiàn)，與糖尿病腎病組相比，硫化氫干預(yù)組大鼠腎小球基質(zhì)中纖維粘連蛋白表達(dá)顯著下降，認(rèn)為缺乏內(nèi)源性硫化氫可減弱血管舒張功能，引起腎小球高灌注和超濾過，促進(jìn)系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積。孫田等[15]發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腸道代謝紊亂可上調(diào)腸道代謝產(chǎn)物TMAO水平，而TMAO又可降低腎小球?yàn)V過率，損害糖耐量，加重腎損害，形成惡性循環(huán)。

2 從“腎絡(luò)瘀阻”理論認(rèn)識(shí)糖尿病性腎小球硬化

腎小球硬化是糖尿病腎病重要的病理改變，中醫(yī)對(duì)糖尿病性腎小球硬化的認(rèn)識(shí)目前多基于糖尿病腎病，即消渴腎病，其發(fā)生與因虛致瘀、瘀滯腎絡(luò)密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，腎之脈絡(luò)類似現(xiàn)代解剖學(xué)腎動(dòng)脈分出的腎小球微血管，并據(jù)此提出“腎絡(luò)瘀阻”是導(dǎo)致糖尿病腎病及其腎小球硬化的關(guān)鍵病機(jī)[16]。也有觀點(diǎn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)糖尿病腎病早期病機(jī)關(guān)鍵在于絡(luò)脈虛損，后期主要為絡(luò)脈瘀阻[17]。曾桂桃等[18]提出，“腎虛絡(luò)瘀”在糖尿病腎病不同分期各有側(cè)重，早期以氣陰兩虛、燥熱絡(luò)瘀為主，中期多脾腎虧虛、痰濕絡(luò)瘀，后期以腎陰陽俱虛、濁毒瘀絡(luò)為要。劉玉寧等[19]結(jié)合糖尿病腎病不同階段臨床表現(xiàn)，認(rèn)為虛證是腎絡(luò)瘀阻始動(dòng)因素，而濕濁是加重糖尿病性腎小球硬化的重要病理環(huán)節(jié)。可見，上述觀點(diǎn)雖有不同，但其共識(shí)在于“瘀”貫穿糖尿病性腎小球硬化病程始終。

2.1 因虛致瘀

稟賦不足、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等是導(dǎo)致糖尿病腎病“虛證”的重要因素，初起以陰虛火旺為主，漸累及氣，氣陰兩傷，日久則正氣虧損，五臟虛損，終致陰陽兩虛?！鹅`樞·五變》“五臟皆柔弱者，善病消癉”，即指出先天五臟虛弱是導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)病因。又過食辛辣、肥甘則可導(dǎo)致中焦壅滯，運(yùn)化失司，日久化生內(nèi)熱，擾動(dòng)腎關(guān)，致封藏失司，精微丟失，誘發(fā)糖尿病腎??；郁怒易傷肝化火，上灼胃津，下耗腎液，擾亂腎關(guān)而發(fā)為本病。諸因素皆可因虛致實(shí)，致腎絡(luò)瘀阻，誘發(fā)和加重糖尿病性腎小球硬化。陰虛火旺可煎灼津液，使血液黏稠，痰濁內(nèi)生，瘀阻腎絡(luò)；氣虛則血澀，郁滯腎絡(luò)；陽虛難以溫煦經(jīng)脈，致腎絡(luò)拘急，血凝不行而腎絡(luò)瘀阻。

2.2 腎絡(luò)瘀阻

《太平圣惠方》“飲水隨飲隨小便……經(jīng)絡(luò)血澀，榮衛(wèi)不行，熱氣留滯遂成斯疾也”，提出久病入絡(luò)，脈絡(luò)瘀阻，尤其瘀血是導(dǎo)致消渴腎病的重要病理因素及其產(chǎn)物。曹式麗教授認(rèn)為，基底膜增厚、ECM沉積等早期糖尿病腎病病理改變與腎中氣絡(luò)郁滯密切相關(guān)，而彌漫性和結(jié)節(jié)性腎小球硬化與腎絡(luò)瘀阻理論相合[20]?！澳I者，胃之關(guān)也”（《素問·水熱穴論篇》），腎絡(luò)瘀阻，氣化失司，水液代謝障礙，則發(fā)為水腫；瘀阻腎關(guān)，固攝失職，精微從腎關(guān)而泄，則見蛋白尿。糖尿病性腎小球硬化亦可降低腎小球?yàn)V過率而出現(xiàn)水腫和蛋白尿，因此糖尿病性腎小球硬化符合腎絡(luò)瘀阻表現(xiàn)，提示瘀血是糖尿病性腎小球硬化的重要病理因素。

2.3 濕濁加重

濕濁亦是因虛致實(shí)的病理產(chǎn)物，所謂“元?dú)饧忍摗軣o氣，必停留而瘀”（《醫(yī)林改錯(cuò)》）。糖尿病腎病治不得法，病情遷延難愈，使正氣虧虛，五臟衰敗，脾氣虛弱不能升清，腎失開合不能泌濁，則濕濁內(nèi)生。若阻于經(jīng)絡(luò)，則加重血瘀；停于脾胃，生化乏源，則氣血虧虛更甚；聚于三焦，氣化失常，則溺毒內(nèi)停而發(fā)為關(guān)格。劉玉寧等[19]將中醫(yī)濕濁與機(jī)體代謝產(chǎn)物蓄積、水電解質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂等加重糖尿病性腎小球硬化的現(xiàn)代病理因素相合，強(qiáng)調(diào)濕濁是加重腎小球硬化的重要因素。

3 從“瘀”認(rèn)識(shí)腸道微生態(tài)紊亂與糖尿病性腎小球硬化

3.1 “瘀”與腸道微生態(tài)

絡(luò)以疏為用，以通為順。氣充血行，則脈絡(luò)通暢，瘀血作為影響腎小球硬化的重要病理因素和產(chǎn)物，活血化瘀具有重要意義。研究顯示，瘀與血流動(dòng)力學(xué)改變具有高度相關(guān)性[21]。瘀阻于腎，表現(xiàn)為高糖刺激下，血管內(nèi)皮被糖基化產(chǎn)物損傷，通過釋放血管活性介質(zhì)，刺激腎臟傳入小動(dòng)脈擴(kuò)張，激活RASS，誘導(dǎo)TGF-β表達(dá)升高，降低纖溶酶原活性，使腎臟中纖維蛋白過度沉積，致足細(xì)胞受損而尿蛋白排泄率增加，且生成大量促炎因子，加快ECM沉積和腎小球硬化[22]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生態(tài)紊亂不僅與腎有關(guān)，還可激發(fā)和介導(dǎo)局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活，提示腸道菌群與血流動(dòng)力學(xué)改變之間存在密切聯(lián)系，其中腸道微生物群可促進(jìn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管功能障礙和高血壓，并通過一系列級(jí)聯(lián)加重腎損傷和腎小球硬化進(jìn)展，而腸道代謝物SCFAs 可結(jié)合其位于腎臟的GPR41 和Olfr78 受體介導(dǎo)腎素分泌，調(diào)節(jié)血管相關(guān)功能[23-24]。張鈮雪等[25]研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀法對(duì)腸道菌群多樣性、豐度及腸屏障功能均會(huì)產(chǎn)生一定的有益影響，其中丹參、川芎等單味中藥，以及赤芍承氣湯等復(fù)方，對(duì)腸道黏膜屏障具有正向扶植作用，因此認(rèn)為“瘀”與腸道微生態(tài)之間存在一定聯(lián)系。

3.1.1 “活血化瘀”回調(diào)腸道菌群及其代謝物

活血化瘀方藥在改善腸道菌群構(gòu)成、調(diào)節(jié)腸道代謝產(chǎn)物方面卓有成效。補(bǔ)陽還五湯是治療氣虛血瘀型糖尿病腎病常用方劑，能減輕糖尿病腎組織病理損傷，抑制纖維化相關(guān)因子表達(dá)，降低腎組織凋亡蛋白及炎癥因子蛋白表達(dá)，最終達(dá)到緩解腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程目的。而腸道菌群是影響補(bǔ)陽還五湯活性成分的主要代謝因素[26-27]。通過16S rRNA基因測(cè)序和代謝組學(xué)法檢測(cè)氣虛血瘀證大鼠的腸道菌群及血漿代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯可調(diào)節(jié)腸道菌群豐度趨于正常，進(jìn)而影響血漿代謝輪廓，最終達(dá)到改善血瘀證目的[28]。李茂生[29]探討活血降糖飲維持T2DM大鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)和降低胰島素抵抗相關(guān)機(jī)制發(fā)現(xiàn)，其可上調(diào)腸道菌群Alpha多樣性中Shannon指數(shù)，顯著提高Beta多樣性，具體表現(xiàn)為乳酸桿菌科、毛螺菌科及卟啉單胞菌科等SCFAs和抗炎因子的產(chǎn)生菌數(shù)量增多，致病菌（如變形桿菌門、嗜堿菌屬、丹毒絲菌科）豐度下降，使丁酸鹽等有益產(chǎn)物增加，進(jìn)一步緩解炎癥反應(yīng)，改善糖脂代謝和胰島素抵抗。

3.1.2 “活血化瘀”保護(hù)腸道黏膜屏障，抑制炎癥反應(yīng)

腸道菌群紊亂可增加腸道通透性，損壞腸道上皮屏障功能，促進(jìn)內(nèi)毒素等有害代謝物從腸道釋放入血，抑制宿主免疫系統(tǒng)，加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響糖尿病性腎小球硬化發(fā)展?；钛龇剿幵诮档湍c道通透性、保護(hù)腸道黏膜屏障、激活免疫系統(tǒng)，以及抑制炎癥因子表達(dá)方面具有重要地位。

研究發(fā)現(xiàn)，具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)功效的鱉甲煎丸不僅可通過降低非酒精性脂肪性肝病大鼠腸道內(nèi)擬桿菌豐度及增加有益菌乳酸桿菌數(shù)目改善腸道菌群紊亂，還可上調(diào)緊密連接蛋白mRNA水平，以降低腸道通透性，修復(fù)腸道屏障功能[30]?；羧鹎涞萚31]基于16S rRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，化濁解毒活血通絡(luò)方不僅上調(diào)厚壁菌門等有益菌群豐度，下調(diào)腸桿菌科、艾克曼菌屬等機(jī)會(huì)致病菌豐度，還能抑制腸桿菌科表達(dá)以降低腸道通透性，上調(diào)乳桿菌科表達(dá)促進(jìn)SCFAs產(chǎn)生以維持腸道黏膜屏障，并通過抑制腸道促炎因子Treg和Th17表達(dá)，繼而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)。代書景等[32]通過鹽酸林可霉素灌胃建立腸道微生態(tài)失調(diào)小鼠模型，同時(shí)利用紅花多糖進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，紅花多糖可顯著提高小鼠腸黏膜固有層漿細(xì)胞分泌的sIgA，中和腸黏膜上皮病原體，以維持腸道正常微生物群平衡，并可降低血漿內(nèi)毒素含量，抑制腸道炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸道黏膜屏障。這些研究充分說明，活血化瘀法可有效改善腸道微生態(tài)紊亂。

3.2 活血化瘀法通過改善腸道微生態(tài)延緩糖尿病性腎小球硬化

鑒于腎絡(luò)瘀阻、腸道菌群失調(diào)及糖尿病性腎小球硬化三者之間具有一定聯(lián)系，因而運(yùn)用活血化瘀法可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善糖尿病性腎小球硬化。

丹參祛瘀生新而不傷正，活血化瘀效果極佳，是治療糖尿病腎病常用藥。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，丹參可減少ECM沉積，降低血液黏稠度，延緩腎小球硬化發(fā)生發(fā)展并抑制腎間質(zhì)纖維化，用藥頻率在治療糖尿病腎病方藥為5.46%，僅次于黃芪[33]。研究顯示，丹參能維持糖尿病腎病大鼠腸道微生物群平衡，主要表現(xiàn)為顯著回調(diào)乳酸桿菌屬、梭菌屬、理研菌科、瘤胃菌科豐度，進(jìn)而使IS水平顯著降低，從而預(yù)防和緩解糖尿病腎病大鼠腎損傷[34-35]。丹參莖葉總酚酸可改善T2DM腎病小鼠腸道菌群紊亂，并通過部分調(diào)節(jié)SCFAs產(chǎn)生菌含量，使腸道內(nèi)SCFAs含量回調(diào)，其中理研菌科_RC9是決定T2DM腎病小鼠體內(nèi)腸道菌群與SCFA相互作用的重要菌屬，也是丹參總酚酸作用于T2DM腎病小鼠的關(guān)鍵靶點(diǎn)[36]。Zhao等[37]認(rèn)為，丹參有效成分鎂紫草酸乙酯（MLB）對(duì)糖尿病腎病腎損傷的治療作用可部分歸因于其調(diào)節(jié)腸道微生物群和膽汁酸（BA）代謝，MLB可顯著增加擬桿菌門豐度，略微降低厚壁菌門數(shù)目，下調(diào)分泌腸源性脂多糖炎癥物質(zhì)的大腸桿菌和志賀菌屬豐度，同時(shí)在無血糖控制情況下降低BA代謝至接近基線水平，使腸道黏膜通透性下降，腸道炎癥反應(yīng)降低，從而保護(hù)腸道屏障完整性，減少內(nèi)毒素和細(xì)菌代謝物進(jìn)入體循環(huán)，減緩腎功能損害的進(jìn)展。

活血化瘀類中藥復(fù)方對(duì)腸道菌群及糖尿病性腎小球硬化也具有一定影響，主要通過改變腸道菌群及其代謝物的構(gòu)成和水平影響炎癥因子表達(dá)，繼而緩解糖尿病性腎小球硬化進(jìn)程。桂志紅等[38]發(fā)現(xiàn)，加味益腎活血方（黃芪、菟絲子、黨參、白術(shù)、山藥、茯苓、益母草、丹參、赤芍、薏苡仁、牛膝、大黃）不僅促進(jìn)清除尿素氮、肌酐等毒素，保護(hù)腎功能，還能明顯上調(diào)有益菌雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌相對(duì)豐度，緩解腸道微生態(tài)紊亂，抑制腸道微炎癥反應(yīng)。具有活血化瘀之效的復(fù)方大黃灌腸液不僅能減輕微炎癥狀態(tài)，還可顯著回調(diào)糖尿病腎病終末期腎衰竭患者腸道菌群操作分類單元（OTUs）數(shù)量，以改善腸道微生物群環(huán)境，尤其腸道益生菌數(shù)目，且有助于降低血清內(nèi)毒素水平和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6及IL-8 等在內(nèi)的促炎因子水平，起到緩解腎損害作用[39]。張瑞瑞[40]研究芪石腎舒膠囊（黃芪、生地黃、苦參、石韋、益母草、水蛭等）干預(yù)對(duì)糖尿病腎病大鼠腸道菌群及炎癥因子影響發(fā)現(xiàn)，芪石腎舒膠囊可改善腸道菌群構(gòu)成，增加有益菌乳酸菌屬，下調(diào)炎癥因子IL-6、TGF-β1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)，有效減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白，下調(diào)血肌酐、尿素氮水平，延緩腎小球系膜細(xì)胞增生和基底膜增厚進(jìn)程。上述研究表明，活血化瘀法可通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)有效改善糖尿病性腎小球硬化。

4 小結(jié)

綜上，鑒于腸道菌群及其代謝物在糖尿病性腎小球硬化進(jìn)展中的作用，可將腎絡(luò)瘀阻作為糖尿病性腎小球硬化的關(guān)鍵病機(jī)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，飲食、稟賦等因素導(dǎo)致陰虛火旺，氣陰兩傷，日久臟腑陰陽俱損，引起消渴腎??；亦因虛致實(shí)，致血黏質(zhì)稠，瘀阻腎絡(luò)，或濕濁內(nèi)阻，加重腎絡(luò)瘀阻。活血化瘀法可改變腸道菌群構(gòu)成，上調(diào)有益菌豐度及其代謝物SCFAs水平，改善腸道微循環(huán)，保護(hù)腸道黏膜屏障，抑制內(nèi)毒素及炎性物質(zhì)釋放，從而延緩腎小球系膜細(xì)胞增殖、基底膜增厚，抑制腎小球硬化進(jìn)展。因此，活血化瘀法改善糖尿病性腎小球硬化的作用與調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成及其代謝物有緊密聯(lián)系，這可能是活血化瘀法改善腎小球硬化、治療糖尿病腎病的重要機(jī)制。但目前相關(guān)研究仍較少，需進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。