原靜靜，孫曉琛，栗錦鵬，陳彥宏，張博洋，王惠珍

1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州730000

代謝物是細胞調(diào)節(jié)過程的最終產(chǎn)物，其水平可被視為生物系統(tǒng)對遺傳或環(huán)境變化的最終反應。生物系統(tǒng)合成的一組代謝物構(gòu)成其“代謝組”，主要是指細胞中所有低分子量代謝物（M<1 000）的集合，這些分子屬一般代謝反應的參與者，是細胞維持生長和正常功能所必需[1]。代謝組學是以高通量、高靈敏度、高分辨率等現(xiàn)代儀器分析為手段，結(jié)合生物統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理及模式識別等化學計量學方法，目標是分析生物體（細胞、組織或器官）受刺激或擾動（如藥物、基因改變或環(huán)境變化）后代謝組的變化，并探索其代謝網(wǎng)絡的技術(shù)。繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學后發(fā)展起來的代謝組學，可提供特定環(huán)境條件下植物表型的明確信息，上游基因、蛋白質(zhì)層面的變化能在下游諸多代謝產(chǎn)物中得到放大，并使這些變化更易被觀察到，因此能更好地解釋生物系統(tǒng)與其環(huán)境之間的相互作用及所有相關(guān)擾動[2]，且實驗成本較蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學低2～3倍[1]。

自然界普遍存在非生物脅迫因素，已成為制約植物生長發(fā)育、影響植物產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素。代謝組學的興起為研究植物非生物脅迫下的代謝途徑變化和耐受機理提供可靠手段，已在小麥[3]、番茄[4]、玉米[5]、水稻[6]及大豆[7]等作物中得到廣泛應用，并在一些藥用植物相關(guān)研究中逐步展開。筆者結(jié)合相關(guān)文獻，梳理代謝組學在藥用植物非生物脅迫研究中進展，為更深入探尋藥用植物非生物脅迫耐受性相關(guān)的代謝網(wǎng)絡提供參考。

1 分析技術(shù)

代謝組學能更好地了解代謝網(wǎng)絡及植物和其他生物有機體的后續(xù)生化組成，代表了生物系統(tǒng)中所有代謝物的無偏見識別和定量，因此分析技術(shù)的選擇性和靈敏度要求很高[8]。核磁共振技術(shù)（NMR）由于靈敏度和信號分辨率低，通常僅限于代謝指紋圖譜。鑒于植物代謝組中預期的物質(zhì)（如植物激素、氨基酸、低聚糖等）物理化學性質(zhì)，液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）是植物代謝組學中最常用的技術(shù)[9-12]。毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）是分離植物高極性、帶電荷的低分子量代謝物（如輔酶、胺、嘌呤堿及核苷酸等）的方法[10-11]，但在植物代謝組學中很少應用。相較LC-MS，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）提供了更好的重現(xiàn)性和更多結(jié)構(gòu)信息[10]，但在分析非揮發(fā)性代謝物之前需進行衍生化步驟[9，11]。因此，GC-MS 被用于測定低豐度、半揮發(fā)性植物激素或衍生化（通常是甲氧基胺化后再進行甲硅烷基化）后的初級代謝物[9-10]。但無論何種分離技術(shù)，基于高分辨率質(zhì)譜（HRMS）的技術(shù)都是植物代謝物分析的首選方法[13]。另外，HRMS探測器（如飛行時間、傅里葉變換-離子回旋共振和Orbitrap質(zhì)譜儀）的高分辨率/高質(zhì)量精度、精確的質(zhì)量和同位素剖面測量允許推斷未知化合物的明確分子式[14-15]。

2 在藥用植物非生物脅迫中的應用

非生物脅迫主要包括鹽脅迫、水分脅迫、溫度脅迫及輻射脅迫等[16]。這些非生物脅迫均會導致藥用植物體內(nèi)生理生化特性改變并造成嚴重影響，如由不同鹽水平引起的滲透脅迫和特定離子效應會導致水分不足、細胞毒性和生長遲緩[17]；干旱情況下土壤中水分利用率降低也會影響植物的生理和代謝活動[18-19]。當植物面臨環(huán)境脅迫時，會產(chǎn)生多種初級和次級代謝物以保護自身免受傷害。初級代謝物普遍存在于植物體內(nèi)并參與生長、發(fā)育或繁殖等重要過程，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、可溶性糖等[20]。次生代謝物如萜類、黃酮、生物堿等并不直接參與上述作用，但在植物生命活動中起著重要作用，如機體防御、信號轉(zhuǎn)導及抵御逆境等[21-22]。不管植物受何種脅迫，代謝組學有希望找到逆境下的潛在生物標志物。

2.1 水分脅迫

由于全球氣候變暖而導致極端氣候事件增多，干旱和洪澇頻繁發(fā)生，對全球范圍內(nèi)的植物生長造成威脅。在水分脅迫研究中，Dai 等[23]利用NMR 和LCDAD-MS研究丹參Salvia miltiorrhizaBunge在干旱脅迫下的代謝組變化，分析出初級代謝產(chǎn)物29個，次級代謝產(chǎn)物44個，并首次檢測到5種多酚類化合物、京尼平、傘形花內(nèi)酯等；進一步分析發(fā)現(xiàn)，干旱促使丹參酮和脯氨酸的合成加強，碳和氨基酸代謝發(fā)生變化，但因日照而引起的干旱促進了莽草酸介導多酚類合成的代謝，而因空氣干燥引起的干旱則抑制此途徑。有報道，利用LC-MS 研究黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.在干旱脅迫下代謝組變化，與對照相比，輕度、中度和重度干旱脅迫分別鑒定出274、284和317個顯著差異代謝物，差異代謝物被注釋到京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫得到82條差異代謝通路，其中鞘脂類代謝為極顯著富集的差異代謝通路（P<0.01），精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝、丙氨酸代謝、半乳糖代謝、煙酸及煙酰胺代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、花生四烯酸代謝、亞麻酸代謝和甘油脂類代謝為顯著富集的差異代謝通路（P<0.05），對富集前后的差異代謝物進行分類發(fā)現(xiàn)，主要集中在脂肪酰基、羧酸類及其衍生物、有機氧化物三類[24]。劉洋[25]利用GC-MS 研究膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge 和蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus（Bunge）P.K.Hsiao在干旱脅迫下的代謝組變化，共鑒定約196種代謝物，包含糖、酸、醇及其他化合物等，分析得出蔗糖、果糖和蘋果酸僅在蒙古黃芪葉片中作為顯著差異代謝物出現(xiàn)，蘋果酸和甘露糖僅在膜莢黃芪葉片中顯著增加，僅蒙古黃芪出現(xiàn)明顯增強的蔗糖和肌醇（參與滲透調(diào)節(jié)和能量代謝）積累；又利用UPLC-qTOF-MS分析28種酚類代謝物和2種關(guān)鍵化合物發(fā)現(xiàn)，在干旱進程中，異黃酮僅在2個黃芪品種的根中表現(xiàn)出顯著增加，酚酸類物質(zhì)僅在蒙古黃芪葉片中有顯著增加，而膜莢黃芪黃酮醇類物質(zhì)含量增加。Wei等[26]利用LC-MS研究紅花Carthamus tinctoriusL.在干旱脅迫下的代謝組變化，在品種PI401477和PI560169中分別鑒定出359和209種差異代謝物，發(fā)現(xiàn)3種代謝物（半乳糖醇、新黃嘌呤和熊果苷）與這2個品種的耐旱性相關(guān)，并受不同調(diào)控。Ueno 等[27]利用GC-MS 研究薇金櫻子Mikania laevigata和薇茅Mikania glomerata在水分不足情況下的變化，薇金櫻子揮發(fā)物中大約一半的化合物增加，水分過量時與對照結(jié)果相似。增加的化合物包括：反式-2-己烯醛、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-古巴烯和β-蓽澄茄油烯。香豆素和大根香葉烯D在缺水條件下也增加，但與對照組無顯著差異。對于薇茅，反式-2-己烯醛，α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯在水分虧缺下增加。Ashrafi等[28]利用NMR研究百里香Thymus vulgaris和Thymus Kotschyanus在干旱脅迫下的代謝組變化發(fā)現(xiàn)，蔗糖、葡萄糖、丙氨酸、膽堿及絲氨酸均起到滲透保護作用，表明干旱脅迫顯著影響糖、氨基酸和能量代謝，其中，三羧酸（TCA）循環(huán)中間產(chǎn)物是提供能量和碳骨架的最重要的循環(huán)，比糖和氨基酸代謝更易受干旱影響，因此，在誘導耐旱性方面可能具有更突出的作用。

2.2 鹽脅迫

土壤鹽堿化已成為限制植物生長的最具破壞性難題之一，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅。蔡芷辰等[29]利用UFLC-Triple TOF-MS/MS 分析忍冬Lonicera japonicaThunb.在鹽脅迫下的代謝組變化，經(jīng)主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），金銀花鹽脅迫組與對照組樣品得到明顯區(qū)分，篩選并鑒定出31個差異成分，對其中酚酸類、黃酮類及環(huán)烯醚萜類等15個目標差異成分（藥效成分）進行分析，呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律；又利用UFLC-QTRAP-MS/MS對15個目標差異成分進行測定，初步表明適度的鹽脅迫可促進金銀花中藥效成分的合成與積累。劉子修[30]利用UPLC-qTOF-MS 分析夏枯草Prunella vulgarisL.在鹽脅迫下的代謝組變化，與對照組相比，50、100、150 mmol/L鹽脅迫組分別篩選出146、175和159個差異表達代謝物，上調(diào)和下調(diào)表達的代謝物分別為48/97、76/99 和55/10，其中最顯著的上下調(diào)代謝物分別是3,4-二甲氧基肉桂酸、肌酸、三甲胺N-氧化物/Tyr-Leu、脫氧核糖、2'-脫氧腺苷5'-單磷酸、去甲脒酮、DL-苯丙氨酸、賴氨酸-苯丙氨酸/順-9-棕櫚烯酸、肉豆蔻酸、別嘌呤醇核苷、吡哆胺、氧化三甲胺、N-α-乙酰-L-精氨酸/3,4-亞甲基二氧亞甲基苯丙胺、L-巖藻糖-1-磷酸和酮亮氨酸；進一步代謝物鑒定和代謝通路綜合分析表明，在鹽脅迫下，差異代謝物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸谷氨酸代謝、苯丙氨酸代謝及嘌呤代謝等生物通路。Wang 等[31]利用LC-TOF-MS 分析蓖麻Ricinus communisL.在鹽脅迫下的代謝組變化，PCA 結(jié)果表明，鹽脅迫下子葉和根中的代謝產(chǎn)物差異很大，子葉有38種差異代謝物，主要包括脂肪酸、核酸和有機酸，而根中只有19種差異代謝物，主要包括脂肪酸和有機酸。此外，KEGG通路富集分析表明，黃酮和黃酮醇、泛酸和輔酶A、檸檬酸循環(huán)和類胡蘿卜素生物合成是這2個器官在鹽脅迫下的共同代謝途徑。鹽脅迫主要通過碳、氮代謝引起代謝過程改變，增加根向子葉的碳分配。此外，氨基酸和核酸譜的變化僅在子葉中發(fā)現(xiàn)，而根可以增強抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧的活性。

2.3 紫外線-B脅迫

吳可心[32]利用UPLC-MS分析刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms在紫外線-B（UV-B）脅迫下的代謝組變化，UV-B輻射后刺五加皂苷表現(xiàn)較強的組織特異性，主要表現(xiàn)在上位葉中；中度脅迫顯著提升各位葉中齊墩果酸的含量，以及上、下位葉中異嗪皮啶和金絲桃苷的含量；重度脅迫下各位葉中異嗪皮啶和金絲桃苷含量均上升，但齊墩果酸含量下降。又利用UPLC-qTOF-MS測定葉片中14種酚類化合物，包括酚類化合物合成前體（L-苯丙氨酸）、4種C6C1型化合物（丁香酸、水楊酸、對羥基苯甲酸、香草酸）、6種C6C3型化合物（對羥基肉桂酸、染料木素、咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸、對香豆酸）、3種C6C3C6型化合物（槲皮素、山柰酚、蘆丁）。UV-B輻射后上位葉中酚類化合物合成前體物質(zhì)積累量升高，且隨葉位遞增；中度脅迫下，C6C1型化合物在各位葉的積累量均呈上升趨勢。UV-B脅迫后，C6C3型化合物積累量整體呈下降趨勢，而黃酮類（C6C3C6型）化合物積累量普遍升高，且山柰酚最為明顯。

劉洋[25]利用GC-MS 研究膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge 和蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus（Bunge）P.K.Hsiao在UV-B脅迫下的代謝組變化，共鑒定出144種代謝物，包括2種黃芪根和葉組織中共79種差異顯著的化合物。其中，蒙古黃芪葉組織中顯著增加的化合物中有2種是糖類化合物，根組織有4種糖及2種糖苷化合物；相似的，在膜莢黃芪葉組織中顯著增加的化合物中沒有糖類，而根組織有5種糖類化合物。作為能量來源的糖，在地上組織中減少，而地下組織中增加。這意味著UV-B脅迫促使2種黃芪的生長能量均顯示出向地下組織轉(zhuǎn)移的趨勢。又利用UPLC-qTOF-MS分析28種酚類代謝物和1種關(guān)鍵化合物。在UV-B輻射增強條件下，蒙古黃芪和膜莢黃芪的根和葉片中大部分C6C1碳骨架的酚類化合物都表現(xiàn)出減少趨勢。不同的是，蒙古黃芪中C6C3碳骨架的酚類化合物在UV-B輻射脅迫下均有所減少，而C6C3C6碳骨架酚化合物大部分有所增加；與此相反，在膜莢黃芪中，C6C3碳骨架酚化合物在UV-B輻射脅迫下有所增加，而C6C3C6碳骨架酚化合物大部分有所減少。鑒于C6C3C6碳骨架化合物比C6C3碳骨架化合物更優(yōu)秀的UV-B輻射吸收能力，蒙古黃芪這種以C6C3碳骨架化合物為代價的C6C3C6碳骨架化合物的增加，可能會帶來更好的UV-B輻射防御能力。

楊丙賢[33]利用GC-MS 分析圓錐鐵線蓮Clematis ternifloraDC.在UV-B脅迫下的代謝組變化，共鑒定113個代謝物，其中62個差異響應了高強度UV-B輻射和黑暗脅迫；通過對代謝物的分析，推斷圓錐鐵線蓮在脅迫下氨基酸代謝和有機酸代謝是增強的，而碳水化合物的代謝顯著堿弱，表明葉片在脅迫逆境下，其光合作用和呼吸作用的減弱及次生代謝增強。又利用UPLC-MS/MS分析鑒定了160個代謝物，并利用NMR技術(shù)對其中7個代謝物進行結(jié)果確證，結(jié)果有38個次生代謝物含量發(fā)生顯著變化，其中19個次生代謝物響應脅迫處理而被特異合成，這些代謝物主要屬于脂肪酸類、內(nèi)酯類、多酚類、苯甲酸類、香豆素類及芪類。而聚類分析顯示，香豆素是顯著變化的次生代謝物的主要成分。

2.4 其他脅迫

除上述脅迫外，植物還常受其他逆境的脅迫，如冷脅迫、凍融脅迫、多重脅迫等。Rastogi 等[34]利用GC-MS研究圣羅勒Ocimum tenuiflorum冷脅迫下代謝組變化發(fā)現(xiàn)，苯丙素類化合物（丁香酚和甲基丁香酚）含量均有下降；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，苯丙素類化合物合成途徑相關(guān)基因PAL、C4H、4CL表達下調(diào)是導致丁香酚和甲基丁香酚含量降低的主要原因。Shi等[35]利用NMR 和LC-MS 研究決明Senna tora（Linnaeus）Roxburgh在凍融下的代謝組變化，并對108種代謝物進行相對定量分析。在第3個循環(huán)后，凍融誘導的影響程度較小。連續(xù)5次凍融循環(huán)后，水蘇糖、蔗糖、去甲紅霉素-6-O-β-d-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3-(3''-乙酰半乳糖苷)含量降低，而苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、甘露糖、葡萄糖酸和纈氨酸含量升高。

管仁偉等[36]利用UPLC-QTOF-MS 研究黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi在干旱及鹽脅迫下的代謝組變化，分析鑒定出44個黃酮類成分，差異代謝物共篩選出18個黃酮類成分；且主要黃酮類代謝產(chǎn)物相對定量值隨干旱及鹽脅迫程度增強呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。由此得出干旱及鹽脅迫會引起黃芩黃酮類成分含量和差異成分種類的改變，適度干旱脅迫可促進黃芩黃酮類成分的合成積累，但程度有限。

3 展望

代謝組學拓展了對植物耐受非生物脅迫分子機理的認識，能檢測大部分脅迫響應的代謝物質(zhì)，目前已有通過代謝組學找出差異代謝物，并通過外源施加方式作用于植物的逆境研究，如丙二酸浸泡小麥種子[37]，紫花苜蓿葉面噴施外源5氨基乙酰丙酸[38]可提高抗旱能力，長春花外源施加海藻糖[39]可促進拮抗低溫脅迫，外源表沒食子兒茶素沒食子酸酯可緩解鹽脅迫對番茄種子的抑制作用和緩解低溫、高溫和干旱等非生物脅迫對幼苗造成傷害[40]，外源褪黑素可緩解鹽脅迫對棉花種子的抑制作用[41]等，這些生物標志物可提高植物逆境下的生存能力。而藥用植物方面的研究多數(shù)僅限于差異代謝物的鑒定和篩選等，因此下一步可將篩選的功能代謝物通過外源加入方式進行驗證，并通過生理生化特性、轉(zhuǎn)錄水平等變化解析外源代謝物的作用機理，以輔助培育耐旱、耐鹽等藥用植物品種。