黃 金，肖信錦，王慧娟，孫雪菲，鄧揚悟,2*

（1 國家離子型稀土資源高效開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心 / 江西離子型稀土工程技術(shù)研究有限公司，江西 贛州 341000；2 江西理工大學(xué)，江西 贛州 341000；3 江西應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000）

離子型稀土礦開采早期，主要采用池浸和堆浸工藝，要求剝離地表土壤，對礦體進行開挖，每生產(chǎn)1 t稀土，就要破壞地表植被160～200 m2，剝離地表土達 300 m3，形成尾砂 1000～1600 m3[1–2]。以贛州地區(qū)為例，稀土開采遍布贛州18 個縣(市、區(qū))，涉及廢棄稀土礦山302 個，遺留的尾礦1.91 億t，因為離子型稀土開發(fā)，造成了大約97 km2的荒漠化土地。此外，浸礦過程中長期、大量使用硫酸銨溶液，使廢棄礦區(qū)土壤理化性質(zhì)遭到嚴(yán)重破壞，礦區(qū)動植物基本消失，水土流失極其嚴(yán)重，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境安全[3–4]。

植被恢復(fù)技術(shù)常被用于各種廢棄礦區(qū)的生態(tài)修復(fù)[5–6]，然而，離子型稀土廢棄地土壤立地條件十分惡劣，存在土壤偏酸性、營養(yǎng)元素缺失、透氣性及水土保持能力差等問題，即使經(jīng)過物理修復(fù)或添加化學(xué)肥料等方式的土壤改良，植物依然難以長期穩(wěn)定生長，植被恢復(fù)的效果差[7]。

叢枝菌根 (arbuscular mycorrhiza，AM)真菌幾乎能與陸地上80%以上高等植物根系形成有益共生體，已有的研究結(jié)果表明，在AM真菌與宿主植物的共生關(guān)系中，AM真菌在利用宿主植物的光合產(chǎn)物來滿足自身生長繁殖需要的同時，能促進宿主植物對水分和礦質(zhì)元素的吸收，提高宿主植物抗脅迫的能力[8–12]。目前，借助菌根技術(shù)調(diào)控退化生態(tài)系統(tǒng)，許多礦區(qū)的土地生產(chǎn)力得以恢復(fù)，生態(tài)環(huán)境得以改善。然而，這類真菌在離子型稀土礦山廢棄地的生態(tài)重建中的作用效應(yīng)研究鮮見報道。此外，黑麥草(Lolium perenne L.)作為優(yōu)良的禾本科植物具有生長速度快、產(chǎn)量高、生長季節(jié)長、適應(yīng)性廣等特點，常作為修復(fù)植物應(yīng)用于廢棄場地的生態(tài)重建[13–14]。

基于此，本試驗以離子型稀土礦山廢棄地土壤為供試材料，以黑麥草為宿主植物，通過研究3種AM真菌(Glomus mosseae、Rhizophagus intraradices和Glomus etunicatum)對土壤改良和植物生長、抗干旱等方面的影響，探討AM真菌對離子型稀土廢棄礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的作用效果，以期為離子型稀土廢棄礦區(qū)加速生態(tài)修復(fù)實踐提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種為摩西斗管囊霉(Glomus mosseae，G.m)、根內(nèi)根孢囊霉(hizophagus intraradices，R.i)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum，G.e)，3種AM真菌均購自于北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所“叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫”(BGC)，接種劑為以三葉草作為宿主擴大繁殖獲得的含孢子、被侵染根段及根外菌絲的沸沙混合物，接種劑量為100 g/盆。

供試植物為市購黑麥草種子，用10% H2O2消毒10 min，然后用純水沖洗干凈殘留雙氧水，用水浸泡 12 h 催芽。

供試土壤為贛州定南某離子型稀土礦堆浸后留下的尾砂土壤，自然風(fēng)干過0.25 mm篩，160℃高溫滅菌，土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，該土壤pH僅為4.24，為酸性土壤，土壤中全氮、全磷和全鉀含量分別為0.179、0.161和57.5 g/kg，堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為48.3、0.76和69.7 mg/kg，土壤有機質(zhì)含量為0.727 g/kg，均顯著低于正常土壤水平。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置4個處理，分別為滅菌尾砂土壤上接種G.m、R.i或G.e 菌劑，以不接種菌劑為對照(CK)，每個處理6次平行重復(fù)，共24盆。每盆裝1.5 kg風(fēng)干土，接種菌劑量為100 g/盆，播50顆催過芽的黑麥草種子。播種完畢后在室內(nèi)培養(yǎng)，保持良好通風(fēng)，光照時間為14 h/d。播種后第7天進行間苗，每盆保留25株長勢良好且一致的幼苗。前4周每周噴灑一次改良后的Hoagland營養(yǎng)液[15]，每次噴適量(100 mL/盆)，后續(xù)視土壤干濕和植物生長情況適量補充水或營養(yǎng)液，黑麥草總生長時長約7個月(210 天)。

1.3 樣品采集與測定

分別在黑麥草生長的第10、20、30、45、75、115、155、195天，每盆選取15株黑麥草用卷尺量取株高，取平均值記錄黑麥草株高。

在黑麥草生長的第195天，每個處理組收獲3盆，取植株樣分析養(yǎng)分含量、根系侵染率、植株地上部及地下部干重，取土壤樣品分析理化性質(zhì)。剩下的3盆進行抗干旱試驗，不噴灑水，在室溫(24℃～35℃)下自然干旱，分別在干旱脅迫的第0、2、4、6天取黑麥草葉片，檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量。

新鮮黑麥草根系侵染率用墨水醋染色法檢測[15]。黑麥草洗凈處理后，分為地上部和地下部，105℃殺青30 min，再于70℃下烘干至恒重，用天平稱量得地上部及地下部平均干重[16]。黑麥草全氮采用開氏法測定，全磷采用硫酸消煮—鉬銻抗比色法測定，全鉀采用硫酸消煮—鉬銻抗比色法測定[17]。黑麥草葉片SOD活性用氮藍四唑(NBT)光還原法進行測定，脯氨酸含量用比色法進行測定[18]。

試驗初始土壤和黑麥草生長195天后的根際土壤陰干后過2 mm篩，參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測土壤pH、有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀以及堿解氮、有效磷和速效鉀[19–26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2003、SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。采用origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AM真菌對黑麥草根系的侵染

3種AM真菌對黑麥草的侵染率具有較大差異，其中G.m侵染率最高為70.17%，R.i次之為65.17%，G.e僅為46.83%，G.m和R.i侵染率顯著高于G.e(圖 1、圖 2)。

圖1 AM真菌侵染黑麥草根系情況Fig. 1 Infection of AM fungi on ryegrass root system

圖2 AM真菌對滅菌廢棄地種植的黑麥草根系的侵染率Fig. 2 Infection rate of AM fungi to ryegrass root planted in sterilized abandoned soil

2.2 AM真菌對廢棄礦區(qū)土壤養(yǎng)分供應(yīng)的影響

由表1可知，相比于不接菌空白組，接種AM真菌的根際土壤pH由強酸性(4.60)提高至7.62～7.90，有利于植物的生長；G.m、R.i、G.e組土壤有機質(zhì)含量分別提升了123.9%、126.8%、105.0%，3個真菌處理間無顯著差異；接種G.m和R.i真菌顯著提高了土壤中全氮、堿解氮、全磷和速效鉀含量，G.m組全氮、堿解氮和全磷的提升最高，分別提升了64.17%、59.93%和84.12%，R.i真菌組速效鉀含量的提升最高，速效鉀含量提高了73.31%，G.e對土壤全磷和全鉀含量的增加未達到顯著水平，3個真菌對有效磷和全鉀含量的提升也未達到顯著水平。

表1 AM真菌對土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effects of AM fungi on soil physicochemical properties

2.3 AM真菌對植物生長的影響

2.3.1 AM真菌對株高的影響 植株株高能直觀表征植株的生長狀況，也能間接反映植株生物量的累積。在黑麥草生長初期，特別是在生長20天以內(nèi)，接種了AM真菌組與未接菌空白組對比，黑麥草株高沒有明顯區(qū)別(圖3)，主要因為此時是黑麥草的幼苗期，根系剛剛發(fā)育，AM真菌尚未侵染或者侵染程度較低，菌根促進生長的效應(yīng)尚未顯現(xiàn)。隨著種植時間延長，在黑麥草生長115天后，接種G.m和R.i真菌的黑麥草株高顯著高于未接菌的空白組，表現(xiàn)出了很好的促進植物生長的效應(yīng)，接種G.e真菌的黑麥草略高于未接菌的空白組，未達到顯著性水平 (圖 4)。

圖3 接種不同AM真菌下黑麥草株高的生長動態(tài)Fig. 3 Effects of AM fungi on plant height of ryegrass

圖4 接種不同AM真菌對黑麥草株高的影響Fig. 4 Plant height of ryegrass as affected by AM fungi

當(dāng)黑麥草生長到195天時，AM真菌促進生長的效應(yīng)進一步體現(xiàn)(圖5)，接種3種AM真菌的黑麥草株高均顯著高于未接菌空白組，接種G.m、R.i和G.e真菌組分別比未接菌的空白組高了38.13%、34.53%和25.33%。

圖5 生長195天的接種不同AM菌劑的黑麥草長勢Fig. 5 The growth of 195-days ryegrass under soil inoculated with different AM fungi strains

由上所述，通過監(jiān)測黑麥草的長勢，發(fā)現(xiàn)接種AM真菌可有效促進植株生長。在生長初期效果不明顯，但隨著生長時間延長，在生長的后期開始顯現(xiàn)顯著的促生效果，相比未接菌空白組，接種G.m、R.i和G.e真菌組株高分別增加了38.13%、34.53%和25.33%，其中G.m和R.i真菌促生效果更好。

2.3.2 AM真菌對植株干重的影響 由圖6可知，土壤接種3種AM真菌均顯著提高了黑麥草的地上部干重(P<0.05)，其中接種G.m真菌和R.i真菌更為顯著，均比未接菌空白組高43.73%，且二者地上部干重也顯著高于接種G.e真菌。接種G.m真菌和R.i真菌可顯著提高黑麥草的地下部干重，其中接種G.m真菌促進作用最大，比未接菌空白組高64.68%。G.e處理根部干重的增加未達顯著水平。

圖6 生長195天的黑麥草地上及地下部干重Fig. 6 Dry weight of shoot and roots of ryegrass after 195 days of growth

2.4 AM真菌對植株營養(yǎng)元素的影響

由表2可見，相較于未接菌空白組，G.m和R.i及G.e處理顯著提高了地上部氮磷鉀含量。R.i處理還顯著提高了地下部氮磷鉀含量，較未接菌空白組分別提升了58.60%和83.27%、45.60%；G.m和G.e也顯著提升了地下部的氮磷鉀含量，但是提升幅度低于R.i?？傮w看，接種AM真菌顯著提高了植株地上部和地下部的氮磷鉀養(yǎng)分吸收量，提高效果尤以R.i真菌顯著。

表2 AM真菌對黑麥草營養(yǎng)元素含量的影響Table 2 Effects of AM fungi on nutrient element contents of ryegrass

2.5 AM真菌對植株抗旱性的影響

2.5.1 AM真菌對植株SOD活性的影響 圖7表明，在正常水分條件下(干旱脅迫第0天)，各處理組SOD活性都較低，其中接種G.e真菌組活性最低，接種R.i真菌組活性最高；干旱脅迫2天后，土壤中的水分部分蒸發(fā)，此時表土水分較為干燥，但底層土壤還比較濕潤，各處理組SOD活性均有不同程度提高，其中接種G.m組和G.e組SOD活性分別提高了19.74%和19.34%；當(dāng)干旱脅迫4天后，因為室溫較高(白天溫度30℃～35℃)，土壤水分大量蒸發(fā)，各處理組SOD活性急速升高，但接種G.m、R.i和G.e 3種AM真菌組SOD活性分別高于未接菌空白組7.35%、15.94%和4.68%，均達到顯著水平，其中接種R.i組活性最高；當(dāng)干旱脅迫6天后，此時土壤非常干燥，黑麥草葉片干枯變黃，可能極度的水分脅迫下，植株受損，產(chǎn)生SOD的能力降低，此時不同處理組SOD活性均出現(xiàn)不同程度地降低，但接種了AM真菌的黑麥草SOD活性依然顯著高于未接菌空白組。

圖7 AM真菌對干旱條件下黑麥草SOD活性的影響Fig. 7 Effects of AM fungi on SOD activity of ryegrass under drought condition

在干旱脅迫下，接種AM真菌有利于植物產(chǎn)生更多SOD從而提高植物的抗水分脅迫能力，特別是在環(huán)境干旱較為嚴(yán)重時(干旱脅迫第4、6天)，接種3種AM真菌組SOD活性都顯著高于未接菌空白組，表現(xiàn)出了較強的抗干旱能力，但環(huán)境水分脅迫不能過強，當(dāng)極度干旱時(干旱脅迫第6天)，植株嚴(yán)重缺水，出現(xiàn)枯黃，不論是否接種AM真菌，SOD活性都會降低。

2.5.2 AM真菌對植株脯氨酸含量的影響 圖8顯示，在正常水分(干旱脅迫第0天)條件下，各處理組脯氨酸含量均較低；當(dāng)?shù)投热彼畻l件下(干旱脅迫第2天)時，黑麥草體內(nèi)脯氨酸含量大量增多，但各處理組之間相差相對較小，只有接種R.i組與未接菌空白組達到了顯著性差異，但脯氨酸含量也僅高6.88%；當(dāng)嚴(yán)重缺水條件時(干旱脅迫第4天)，黑麥草中脯氨酸急劇升高，相比正常水分條件下，未接菌空白組提高了3.41倍，接種AM真菌組最高提高了4.64倍，此外，接種AM真菌組脯氨酸含量顯著高于未接菌空白組，接種G.m、R.i和G.e組分別提高了34.94%、36.66%和16.87%，表現(xiàn)出了良好的抗水分脅迫能力；當(dāng)極度缺水條件(干旱脅迫第6天)下，此時各處理組脯氨酸含量均有所降低，但接種AM真菌組依然顯著高于未接菌空白組，此時接種R.i組脯氨酸含量最高，比未接菌空白組高42.92%。

圖8 AM真菌對干旱條件下黑麥草脯氨酸含量的影響Fig. 8 Effects of AM fungi on proline content of ryegrass under drought condition

接種AM植物可產(chǎn)生更多的脯氨酸從而提高抗水分脅迫能力，尤其是在嚴(yán)重缺水(干旱脅迫第4天)和極度缺水(干旱脅迫第6天)時3種AM真菌均能顯著提高脯氨酸含量，其中接種R.i真菌組脯氨酸含量最高，抗缺水脅迫能力最強。

3 討論

3.1 AM真菌可改良離子型稀土廢棄礦區(qū)土壤

離子型稀土廢棄礦區(qū)土壤為剝離表土后的“生土”，土壤生物活性較低。根據(jù)前文土壤理化性質(zhì)指標(biāo)分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，該土壤有機質(zhì)含量特別低，營養(yǎng)元素缺失，再加上池浸、堆浸工藝過程中長期被偏酸性的硫酸銨溶液浸泡，大量的離子被淋失，導(dǎo)致土壤立地條件進一步惡劣。

參照綠化種植土壤標(biāo)準(zhǔn)[27]，一般植物對pH的要求為5～8、有機質(zhì)為12～80 g/kg、堿解氮為40～200 mg/kg、有效磷為 5～60 mg/kg、有效速為 60～300 mg/kg。對比可知，離子型廢棄礦區(qū)土壤呈酸性，有機質(zhì)含量極低，氮、磷、鉀 3種元素含量均偏低。因此，離子型稀土廢棄礦區(qū)生態(tài)修復(fù)首要解決的問題就是礦區(qū)土壤的改良。目前，離子型稀土廢棄礦區(qū)土壤改良措施主要有客土覆蓋以及施加石灰、化肥等改良方法[28]，但客土覆蓋措施工程量大、費用高，難以大面積實施，而施加石灰降低土壤酸度、施加化肥改良土壤營養(yǎng)則存在時效性低的不足，停止施加后土壤pH、植被覆蓋度、物種數(shù)和生物量都會顯著下降[29]，難以從根本上解決土質(zhì)差的問題，進而導(dǎo)致植被恢復(fù)的長期效果較差。

AM真菌能夠侵染宿主植物根系，在根系皮層內(nèi)形成菌絲、叢枝、泡囊、孢子以及輔助細胞等結(jié)構(gòu)，同時菌絲又可向根外延伸，最長可達10 cm以上，延伸過程中遇到其他根系時能夠繼續(xù)侵染，從而在根系之間形成致密的菌絲網(wǎng)絡(luò)[30]。AM菌絲體活動影響根系的分泌作用，可調(diào)節(jié)根系土壤pH的變化[31]，這可能是本研究中土壤pH由酸性轉(zhuǎn)為中性的原因之一。同時，本研究中AM真菌侵染黑麥草根系后，在土壤中形成巨大的菌絲網(wǎng)絡(luò)，而菌絲網(wǎng)絡(luò)能夠分泌磷酸酶，增加磷酸酶活性[32]，對于極度缺乏磷的離子型廢棄礦區(qū)土壤，能夠極大促進土壤中難溶性磷的轉(zhuǎn)化，提高有效磷含量。另外，菌絲網(wǎng)絡(luò)能夠?qū)⑼寥辣旧淼臓I養(yǎng)物質(zhì)以及施加的Hoagland營養(yǎng)液[15]中的營養(yǎng)物質(zhì)同化到菌絲體中，從而把這些物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)化到根際土壤中，促進土壤“肥沃島”的發(fā)育和形成，這也使得離子型稀土廢棄礦區(qū)土壤氮、磷、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)大幅度提升，在礦山復(fù)墾的試驗研究也表明，AM真菌能夠加速土壤肥力的改良[33]。此外，AM真菌菌絲體及孢子較易腐爛，可向土壤輸入有機質(zhì)[34]，這可能是接種AM真菌后離子型稀土廢棄土壤有機質(zhì)含量是未接菌空白組1.27倍的主要原因。由上，利用AM真菌可改良離子型廢棄礦山土壤，為植被恢復(fù)創(chuàng)造有利條件。

3.2 AM真菌促進植物生長

離子型稀土廢棄礦區(qū)是砍伐樹木、剝離表土后的遺留地，局部已呈荒漠化，生態(tài)修復(fù)迫在眉睫。植被修復(fù)是實現(xiàn)離子型稀土礦廢棄礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的重要途徑，但目前植被修復(fù)的效果并不理想。大量研究表明，AM真菌侵染宿主植物形成共生關(guān)系后，大量的菌絲延伸到植物根際土壤中，擴大根系對土壤氮、磷、鉀等元素的吸收范圍，增強對礦質(zhì)元素的吸收能力，從而改善植物的營養(yǎng)狀況，促進植物生長[35]。

本研究中，接種AM真菌的黑麥草株高顯著高于未接菌空白組，其中G.m和R.i真菌促進生長效果最好，相比未接菌空白組分別增加了38.13%和34.53%；3種AM真菌均能顯著提高黑麥草的干重，其中接種R.i真菌黑麥草地上部干重比未接菌空白組高43.73%，接種G.m真菌黑麥草地下部干重比未接菌空白組高64.68%；3種AM真菌均能顯著提升黑麥草對氮、磷、鉀等養(yǎng)分的吸收量，其中接種R.i真菌黑麥草地下部全磷含量提升了83.27%。這表明接種AM真菌可顯著促進植物生長和對養(yǎng)分的吸收，研究結(jié)論與王海娟等[36]一致。

3.3 AM真菌提高植物抗干旱能力

離子型稀土廢棄礦區(qū)在長期的環(huán)境侵蝕下土壤結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，持水性、透氣性較差，與沙化土壤性質(zhì)相似，干旱是主要脅迫。AM真菌通過龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)能夠擴大植物根系對水分的吸收，把更遠更深處的水分傳遞給植株，從而調(diào)節(jié)水分代謝。在干旱季節(jié)，AM真菌能夠增加植物水分通量[37–38]，而剪短AM菌絲后則會顯著地縮減植物根系對土壤水分的傳遞范圍[39]。同時，AM真菌還能通過分泌球囊霉素促進土壤團聚體形成，從而提高土壤的保水能力，緩解水分脅迫對植物的影響[40]。此外，AM真菌還能通過調(diào)節(jié)植物礦質(zhì)營養(yǎng)元素[41]、改變植物體內(nèi)激素平衡[42]、提高保護酶活性[43]等，調(diào)控植物抗旱的生理生化過程，影響宿主植物對水分的吸收和利用，提高植物抗干旱能力。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶系，在逆境環(huán)境下，植物體內(nèi)的超氧陰離子自由基的產(chǎn)量增加，對細胞產(chǎn)生傷害，而SOD可以有效清除超氧陰離子自由基，降低傷害[44]。脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，易與水合或具有較強的水合力，植物受到水分脅迫的時候，植物會通過合成大量的脯氨酸等有機溶質(zhì)提高細胞滲透勢，利于細胞或者組織的持水，有助于提高抗干旱能力[45]。因此SOD活性和脯氨酸含量大小可以反映植物抗水分脅迫的能力。本研究中，在嚴(yán)重缺水脅迫下，接種AM真菌的黑麥草通過分泌更多的脯氨酸利于細胞持水，又通過提高黑麥草中SOD活性清除超氧自由基，進而緩解干旱對黑麥草細胞的傷害，顯著提升植物抗干旱脅迫能力，這與Samiappan等[46]、Huang等[44]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在離子型稀土廢棄礦區(qū)土壤上接種3種AM真菌，均能有效侵染黑麥草根系，提高黑麥草植株的耐旱性，有利于黑麥草植株產(chǎn)生更多的SOD和脯氨酸以提高抗干旱脅迫能力。接種AM真菌可顯著提高離子型稀土廢棄地上黑麥草根際土壤pH，提高土壤有機質(zhì)、全氮、全磷和速效氮、鉀含量，顯著增加植株株高和地上及地下部干重生物累積量。因此，接種AM真菌有利于提高離子型稀土廢棄礦區(qū)的生態(tài)修復(fù)效果，尤其是G.m和R.i兩種真菌有非?？善诘耐茝V前景。