李 婷,趙 祥,潘會(huì)賓,王 懿,高吉仁

(商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院公共課教學(xué)部，陜西 商洛726000)

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying]是小檗科鬼臼亞科桃兒七屬植物，主要分布在我國(guó)西北和西南地區(qū)[1]。作為傳統(tǒng)中藥材，桃兒七對(duì)血病、胎盤(pán)滯留及中風(fēng)等疾病具有顯著療效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，桃兒七根和莖中糖苷衍生物在睪丸癌、淋巴癌、白血病和小細(xì)胞肺癌治療中發(fā)揮著重要作用[3-4]，且其有效成分鬼臼毒素是合成抗癌藥物的前體物質(zhì)[5]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展及抗癌藥物需求量的增加，桃兒七的需求量也隨之增加，但桃兒七已被列入珍稀瀕危植物，因此，合理開(kāi)發(fā)其潛在的藥用價(jià)值具有重要意義。

植物內(nèi)生真菌[6]在植物生長(zhǎng)過(guò)程中具有促生、抗逆等積極作用，可幫助寄主植物合成次級(jí)代謝產(chǎn)物或完成代謝物的生物轉(zhuǎn)化[7]。內(nèi)生真菌長(zhǎng)期與寄主植物共存，可產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗腫瘤及抗氧化等作用，是篩選活性物質(zhì)的潛在資源[8]。研究者[9-10]已從桃兒七根和莖中分離到了可產(chǎn)鬼臼毒素的內(nèi)生真菌，但真菌代謝產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求，不利于菌種的擴(kuò)大篩選[11]。由于桃兒七植物不同產(chǎn)地、不同營(yíng)養(yǎng)器官中生物活性物質(zhì)的含量差異較大[12]，作者以秦嶺桃兒七內(nèi)生煙色擬盤(pán)多毛孢菌為研究對(duì)象，采用萃取法從菌絲中分離活性代謝產(chǎn)物，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生物活性進(jìn)行初步分析，為桃兒七內(nèi)生真菌活性藥用成分的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

桃兒七，采自陜西秦嶺山，海拔高度377.12 m。采樣時(shí)挑選無(wú)病害健康植株，取材部位為植物根、莖、葉。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基：200 g土豆，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL水。PDA液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

葡萄糖(分析純)、冰醋酸(色譜純)、丙酮(色譜純)、石油醚(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、乙酸乙酯(色譜純)，美國(guó)Sigma公司；甲醇(色譜純)，上?？仆瘜W(xué)試劑有限公司；Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠，Pharmacia公司；薄層色譜用硅膠，西安道生化工科技有限公司；200～300目色譜柱硅膠，青島海洋化工廠；(R)-(-)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯[(R)-MTPA]，Alfa Aesar 公司。

AM-400型核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；Auto-Spec3000型質(zhì)譜儀，英國(guó)VG公司；RP-18反相硅膠色譜柱，美國(guó)Merck公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2D型垂直流超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；真空泵，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；iMark型酶標(biāo)儀，日本Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 內(nèi)生真菌的分離及代謝產(chǎn)物提取

對(duì)桃兒七根、莖、葉表面消毒后，置于PDA固體培養(yǎng)基上，以組織塊法分離出內(nèi)生真菌，經(jīng)純化后得到煙色擬盤(pán)多毛孢菌。

將煙色擬盤(pán)多毛孢菌活化后接入PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)12 d，抽濾；菌絲用乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(80∶15∶5，體積比)浸提3次，合并提取液，經(jīng)乙酸乙酯萃取后得浸膏。以RP-18反相硅膠色譜柱處理浸膏，采用水及體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、100%丙酮梯度洗脫，采用薄層色譜法(TLC)和反復(fù)硅膠柱色譜(洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯)分離得到10個(gè)單體化合物，分別標(biāo)記為1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10。

1.3 化合物的Mosher酯制備及表征

分別將化合物1-1、1-2、1-3和1-4分為 2 部分，用無(wú)水吡啶溶解后加入10 μL 的(R)-MTPA，于30 ℃下攪拌12 h，蒸干有機(jī)溶劑，以Sephadex LH-20凝膠柱純化產(chǎn)物，通過(guò)氘代甲醇(CD3OD)核磁共振(NMR)和異核單量子關(guān)系(HSQC)確定仲醇羥基的β-、γ-和δ-位的各個(gè)質(zhì)子的化學(xué)位移變化，確定化合物的絕對(duì)構(gòu)型[13]。

1.4 化合物的細(xì)胞毒活性檢測(cè)

以依托泊苷為陽(yáng)性對(duì)照，參照El-Sayed等[14]方法，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) 比色法檢測(cè)化合物1-1～1-10對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒活性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、HeLa和HepG2細(xì)胞懸液分別接種于96孔板中，37 ℃下培養(yǎng)1 d，加入經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)稀釋的化合物溶液，每個(gè)化合物做3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，取出，加入MTT培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，測(cè)定570 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率(R，%)：

(1)

式中：Ae為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；Ab為空白組的吸光度；Ac為對(duì)照組的吸光度。

1.5 乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測(cè)

參照dos Santos等[15]方法，采用Ellman光度法檢測(cè)乙酰膽堿酯酶抑制活性。將150 μL濃度為0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH值8.04)加入96孔板中，依次加入30 μL化合物溶液、50 μL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(756 μmol·L-1)、20 μL稀釋后的乙酰膽堿酯酶溶液(0.54 U·mL-1)；以加蘭他敏作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液作為陰性對(duì)照?；靹蚝笾糜?7 ℃培養(yǎng)箱孵育5 min，加入50 μL底物碘化硫代乙酰膽堿(3 mmol·L-1)，用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測(cè)動(dòng)力學(xué)速率，按式(2)計(jì)算抑制率(R，%):

(2)

式中:Ke、Kp、Kn分別為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組的動(dòng)力學(xué)速率。

由于抑制率與濃度之間存在一定的線性關(guān)系，通過(guò)回歸方程計(jì)算IC50值，并依據(jù)IC50值評(píng)價(jià)乙酰膽堿酯酶的抑制活性。

1.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[16]方法并作適當(dāng)修改。將99 μL濃度為 67 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH值 6.8)加入96孔板中，加入DMSO稀釋的不同濃度(1.0 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1)化合物溶液1 μL，然后加入25 μL α-葡萄糖苷酶(0.4 U·mL-1)，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min；取出，加入25 μL底物對(duì)硝基苯酚、α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)(5.0 mmol·L-1)，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min；加入50 μL Na2CO3溶液(0.2 mol·L-1)終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm處吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，并計(jì)算半抑制濃度(IC50)。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)體系總體積為200 μL。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1-1的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CD3OD)Tab.1 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-1 in CD3OD

化合物1-1的分子式為C17H22O6(計(jì)算值為345.130 8；不飽和度為7)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-1含有4個(gè)甲基[δH2.10(3H,s,OAc-17)，1.47(3H,s,CH3-13)，1.32(3H,s,CH3-14)，0.97(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15)；δC20.61(q,C-17)，11.20(q,CH3-13)，22.46(q,CH3-14)，10.30(q,CH3-15)]；2個(gè)亞甲基[δH3.79(1H,d,J=9.8 Hz,H-12)，3.71(1H,dd,J=9.3 Hz、4.7 Hz,H-12a)，2.25(1H,d,J=13.2 Hz,H-6)，1.52(1H,d,J=13.2 Hz,H-6a)；δC71.18(t,C-12)，34.96(t,C-6)]；5個(gè)次甲基[δH6.38(1H,s,H-9)，5.14(1H,t,J=5.2 Hz,H-3)，3.72(1H,dd,J=9.3 Hz、4.7 Hz,H-2)，3.63(1H,d,J=3.8 Hz,H-1)，1.80(1H,dd,J=7.0 Hz、5.7 Hz,H-4)；δC125.29(d,C-9)，72.84(d,C-3)，54.83(d,C-2)，58.97(d,C-1),45.41(d,C-4)]；1個(gè)羰基碳[δC172.35(s,C-16)]；5個(gè)脂肪族季碳[δC146.94(s,C-10)，101.92(s,C-8)，70.49(s,C-7)，63.34(s,C-11)，41.38(s,C-5)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-15及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-1/C-5,9、H-2/C-4,10、H-3/C-5,16、H-4/C-6,10,14、H-6/C-4,10,14、H-9/C-5,7、H-12/C-7,8、H-13/C-7,12、H-14/C-4,10、H-15/C-3,5，分析化合物1-1與已知化合物eremofortin C-1的13CNMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)化合物的13CNMR數(shù)據(jù)基本接近。與文獻(xiàn)[17]數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，化合物1-1與已知化合物eremofortin C-1的結(jié)構(gòu)相似，化合物1-1中δC101.92(C-8)與化合物eremofortin C-1中δC102.41(C-8)之間僅相差0.49 ppm；分析HR-ESI-MS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)化合物的分子離子峰之間僅相差14，由此初步確定為失去了一個(gè)亞甲基的碎片，再根據(jù)化合物1-1的IR光譜在2 939 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)寬的吸收譜帶，可以確定連接在eremofortin C-1的C-8位上是一個(gè)甲氧基，而連接在化合物1-1的C-8位上是一個(gè)羥基。通過(guò)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，最終確定化合物1-1是一個(gè)新的艾里莫芬烷型倍半萜類(lèi)化合物，命名為pestalotiopnoid A?；衔?-1的相對(duì)構(gòu)型通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到，以圓二色譜(CD)計(jì)算確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖1)。

圖1 化合物1-1的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.1 Key HMBC,COSY，and NOESY of compound 1-1

表2 化合物1-2的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CD3OD)Tab.2 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-2 in CD3OD

化合物1-2的分子式為C34H42O11(計(jì)算值為649.261 9；不飽和度為14)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-2含有8個(gè)甲基[δH2.10*(6H,d,J=2.3 Hz,OAc-17,17′)，1.34(3H,s,CH3-13)，1.47(3H,s,CH3-13′)，1.28(3H,s,CH3-14)，1.30(3H,s,CH3-14′)，1.00(3H,s,CH3-15)，1.02(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15′)；δC25.73(q,CH3-14′)，23.65(q,CH3-14)，20.60*(q,C-17′)，20.52*(q,C-17)，17.20(q,CH3-13′)，12.86(q,CH3-13)，11.18(q,CH3-15)，10.77(q,CH3-15′)]；4個(gè)亞甲基[δH4.07(1H,d,J=10.7 Hz,H-12′)，4.00(2H,d,J=10.7 Hz,H-12′a,12a)，3.55(1H,s,H-12)，2.24(1H,d,J=14.8 Hz,H-6′)，1.84(1H,d,J=5.8 Hz,H-6′a)，1.96(1H,m,H-6)，1.88(1H,m,H-6a)；δC70.41(t,C-12)，65.96(t,C-12′)，42.26(t,C-6′)，33.74(t,C-6)]；10個(gè)次甲基[δH5.96(1H,s,H-9)，6.43(1H,s,H-9′)，5.17(1H,dd,J=9.6 Hz、4.2 Hz,H-3)，5.14(1H,d,J=5.1 Hz,H-3′)，3.62(1H,d,J=3.9 Hz,H-1)，3.75(1H,d,J=3.6 Hz,H-1′)，3.66(1H,m,H-2)，3.89(1H,m,H-2′)，1.84(1H,t,J=4.6 Hz,H-4)，1.93(1H,t,J=4.5 Hz,H-4′)；δC131.81(d,C-9′)，129.49(d,C-9)，72.48(d,C-3)，71.99(d,C-3′)，58.78(d,C-1)，57.09(d,C-1′)，56.68(d,C-2′)，54.74(d,C-2)，42.76(d,C-4′)，42.30(d,C-4)]；3個(gè)羰基碳[δC195.19(s,C-8′)，172.31*(s,C-16′)，172.28*(s,C-16)]；9個(gè)脂肪族季碳[δC163.67(s,C-10′)，146.14(s,C-10)，102.35(s,C-8)，70.01(s,C-7)，67.52(s,C-11′)，67.42(s,C-11)，64.07(s,C-7′)，40.23(s,C-5)，38.81(s,C-5′)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-1/H-2、H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-15、H-1′/H-2′、H-2′/H-3′、H-3′/H-4′、H-4′/H-15′及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-1/C-5,9、H-2/C-4,10、H-3/C-5,15,16、H-4/C-2,6,10,14、H-6/C-4,8,13,14、H-9/C-1,5,7、H-12/C-7,13、H-13/C-7,12、H-14/C-4,6,10、H-15/C-3,5、H-1′/C-5′,9′、H-2′/C-4′,10′、H-3′/C-5′,15′,16′、H-4′/C-2′,6′,10′,14′、H-6′/C-4′,8′,13′,14′、H-9′/C-1′,5′,7′、H-12′/C-7′,8′,13′、H-13′/C-7′,12′、H-14′/C-4′,6′,10′、H-15′/C-3′,5′，通過(guò)HR-ESI-MS數(shù)據(jù)和C-8(δC102.35)、C-12(δC70.41)及H-12′/C-8之間的長(zhǎng)程耦合關(guān)系，可以確定化合物1-2中存在一個(gè)由C-11′/C-12′/O/C-8組成的醚鍵，且化合物1-2是由具有高氧化度的化合物PR-toxin和化合物1-1之間脫去一分子水成醚縮合而成。通過(guò)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和相關(guān)文獻(xiàn)[18]調(diào)研，確定化合物1-2是一個(gè)新的艾里莫芬烷型倍半萜類(lèi)化合物，命名為pestalotiopnoid B，通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到其相對(duì)構(gòu)型。對(duì)已知化合物eremofortin C-1進(jìn)行單晶培養(yǎng)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，利用X-射線單晶衍射證實(shí)了化合物1-2的平面結(jié)構(gòu)并確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖2)。

圖2 化合物1-2的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.2 Key HMBC,COSY，and NOESY of compound 1-2

表3 化合物1-3的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CD3OD)Tab.3 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-3 in CD3OD

化合物1-3的分子式為C34H42O11(計(jì)算值為649.261 9；不飽和度為14)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-3中含有8個(gè)甲基[δH2.10*(6H,d,OAc-17,17′)，1.38(3H,s,CH3-13′)，1.47(3H,s,CH3-13)，1.27(3H,s,CH3-14′)，1.32(3H,s,CH3-14)，0.98(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15)，1.02(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15′)；δC23.40(q,CH3-14′)，22.49*(q,C-17′)，20.59*(q,C-17)，20.50(q,CH3-14)，17.05(q,CH3-13′)，11.24(q,CH3-13)，10.70(q,CH3-15′)，10.34(q,CH3-15)]；4個(gè)亞甲基[δH3.78(1H,d,J=9.9 Hz,H-12)，3.90(1H,m,H-12′)，3.68(1H,d,J=9.9 Hz,H-12a),1.55(1H,d,J=13.3 Hz,H-6a)，2.24(1H,dd,J=18.1 Hz、14.1 Hz,H-6)，1.87(1H,d,J=14.1 Hz,H-6′a)，2.20(1H,d,J=14.7 Hz,H-6′)；δC71.46(t,C-12)，63.95(t,C-12′)，42.65(t,C-6′)，35.07(t,C-6)]；10個(gè)次甲基[δH6.35(1H,s,H-9)，6.43(1H,s,H-9′)，5.15(1H,t,J=3.5 Hz,H-3′)，5.12(1H,t,J=3.2 Hz,H-3)，3.64(1H,d,J=3.8 Hz,H-1)，3.75(1H,d,J=3.6 Hz,H-1′)，3.72(1H,dd,J=4.9 Hz、3.9 Hz,H-2)，3.88(1H,d,J=2.4 Hz,H-2′)，1.81(1H,dd,J=7.0 Hz、5.6 Hz,H-4)，1.89(1H,m,H-4′)；δC131.97(d,C-9′)，125.67(d,C-9)，72.86(d,C-3′)，71.94(d,C-3)，59.02(d,C-1)，56.89(d,C-1′)，56.60(d,C-2′)，54.87(d,C-2)，45.56(d,C-4)，42.97(d,C-4′)]；3個(gè)羰基碳[δC195.32(s,C-8′)，172.39*(s,C-16′)，172.28*(s,C-16)]；9個(gè)脂肪族季碳[δC163.78(s,C-10′)，146.82(s,C-10)，102.20(s,C-8)，70.52(s,C-7)，67.19(s,C-11′)，63.40(s,C-11)，63.75(s,C-7′)，41.39(s,C-5)，38.62(s,C-5′)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-1/H-2、H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-15、H-1′/H-2′、H-2′/H-3′、H-3′/H-4′、H-4′/H-15′及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-1/C-5,9、H-2/C-4,10、H-3/C-5,15,16、H-4/C-2,6,10,14、H-6/C-4,8,13,14、H-9/C-1,5,7、H-12/C-7,13、H-13/C-7,12、H-14/C-4,6,10、H-15/C-3,5、H-1′/C-5′,9′、H-2′/C-4′,10′、H-3′/C-5′,15′,16′、H-4′/C-2′,6′,10′,14′、H-6′/C-4′,8′,13′,14′、H-9′/C-1′,5′,7′、H-12′/C-7′,8′,13′、H-13′/C-7′,12′、H-14′/C-4′,6′,10′、H-15′/C-3′,5′，通過(guò)HR-ESI-MS數(shù)據(jù)和相關(guān)NMR數(shù)據(jù)，可以確定化合物1-3與化合物1-2結(jié)構(gòu)相同，造成13CNMR數(shù)據(jù)不同的原因可能是化合物1-3與1-2的構(gòu)型不同，因此，化合物1-3命名為pestalotiopnoid C。化合物1-3的相對(duì)構(gòu)型通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到，以CD計(jì)算確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖3)。

圖3 化合物1-3的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.3 Key HMBC,COSY,and NOESY of compound 1-3

表4 化合物1-4的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CDCl3)Tab.4 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-4 in CDCl3

化合物1-4的分子式為C18H28O6(計(jì)算值為363.177 8；不飽和度為5)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-4中含有4個(gè)甲基[δH2.02(3H,s,CH3-15)，1.59(3H,s,CH3-16)，1.16(3H,s,CH3-13)，1.03(3H,s,CH3-12)；δC27.16(q,CH3-12)，24.07(q,CH3-13)，21.56(q,C-15)，19.06(q,CH3-16)]；3個(gè)亞甲基[δH4.34(1H,d,J=11.3 Hz,H-18)，3.95(1H,d,J=11.0 Hz,H-18a)，2.29(1H,dd,J=11.8 Hz、4.1 Hz,H-8)，1.56(1H,d,J=11.6 Hz,H-8a)，1.92(1H,dd,J=12.9 Hz、6.3 Hz,H-11)，1.74(1H,dd,J=12.9 Hz、10.9 Hz,H-11a)；δC64.70(t,C-18)，38.87(t,C-8)，32.85(t,C-11)]；5個(gè)次甲基[δH5.88(1H,d,J=2.5 Hz,H-4)，5.24(1H,dd,J=11.5 Hz、4.1 Hz,H-9)，3.78(1H,dd,J=9.2 Hz、2.0 Hz,H-5)，3.24(1H,dd,J=10.7 Hz、6.3 Hz,H-2)，2.89(1H,d,J=9.2 Hz,H-6)；δC138.95(d,C-4)，75.60(d,C-5)，74.67(d,C-9)，65.58(d,C-6)，41.43(d,C-2)]；5個(gè)脂肪族季碳[δC170.44(s,C-14)，137.91(s,C-3)，79.24(s,C-1)，56.78(s,C-7)，43.07(s,C-10)]；1個(gè)甲氧基[δH3.42(3H,s,OCH3-17)；δC57.69(OCH3-17)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-2/H-11、H-4/H-5、H-5/H-6、H-8/H-9及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-2/C-10,18、H-4/C-2、H-5/C-7,17、H-6/C-8,16、H-8/C-1,16、H-9/C-2,14、H-11/C-1,3,12,13、H-12/C-1,13、H-13/C-1,11,12、H-16/C-6,8、OCH3-17/C-5、H-18/C-2,4，通過(guò)HR-ESI-MS和C-6(δC65.58)、C-7(δC56.78)等數(shù)據(jù)，可以確定化合物1-4含有一個(gè)由C-6/O/C-7組成的環(huán)氧結(jié)構(gòu)。通過(guò)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和相關(guān)文獻(xiàn)[19]調(diào)研，確定化合物1-4是一個(gè)新的石竹烯型倍半萜類(lèi)化合物，命名為pestalotiopsin K，通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到其相對(duì)構(gòu)型。對(duì)該化合物進(jìn)行單晶培養(yǎng)，再利用X-射線單晶衍射證實(shí)其平面結(jié)構(gòu)并確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖4)。通過(guò)單晶結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)可知，化合物1-4的OH-1與OH-18之間形成氫鍵，在空間上構(gòu)成4/6/9三環(huán)網(wǎng)狀骨架(圖5)。

圖4 化合物1-4的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.4 Key HMBC,COSY，and NOESY of compound 1-4

圖5 化合物1-4的X-射線單晶衍射ORTEP圖Fig.5 XRD ORTEP diagram of compound 1-4

化合物1-5：無(wú)色油狀液體；HR-ESI-MS，m/z：393.130 8([M+Na]+,C21H22O6Na+;計(jì)算值：393.131 4)；1HNMR(400 MHz,CD3OD)，δ：6.58(1H,dd,J=2.3 Hz、0.8 Hz,H-6)，6.57(1H,d,J=2.2 Hz,H-8)，6.08(1H,dd,J=5.7 Hz、2.5 Hz,H-13)，5.99(1H,dd,J=5.7 Hz、1.8 Hz,H-14)，5.68(1H,d,J=2.3 Hz,H-18)，5.66(1H,d,J=2.2 Hz,H-19)，4.78(1H,m,H-17)，3.77(1H,d,J=5.8 Hz,H-16)，3.57(1H,d,J=1.6 Hz,H-11)，2.93(1H,m,H-12)，2.61(3H,s,CH3-21)，1.63(3H,s,CH3-20)，1.24(3H,d,J=7.2 Hz,CH3-22)；13CNMR(100 MHz,CD3OD)，δ：168.78(C-2)，163.38(C-4)，162.53(C-9)，158.98(C-7)，143.83(C-13)，139.44(C-5)，131.16(C-18)，129.85(C-14)，128.47(C-19)，116.36(C-6)，111.62(C-15)，105.84(C-10)，104.37(C-3)，101.50(C-8)，78.18(C-16)，67.82(C-17)，52.23(C-11)，47.35(C-12)，21.73(CH3-21)，21.42(CH3-22)，13.54(CH3-20)。通過(guò)與文獻(xiàn)[11]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-5為pestalustaine B(圖6a)。

圖6 化合物1-5(a)和1-6(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.6 Structural formulas of compounds 1-5(a) and 1-6(b)

圖7 化合物1-7(a)和1-8(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.7 Structural formulas of compounds 1-7(a) and 1-8(b)

化合物1-8：白色無(wú)定形固體；HR-ESI-MS，m/z：333.167 6([M+Na]+,C17H26O5Na+;計(jì)算值：333.167 2)；1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：5.73(1H,dd,J=5.9 Hz、2.6 Hz,H-6)，5.67(1H,d,J=5.9 Hz,H-5)，5.32(1H,dd,J=10.5 Hz、5.7 Hz,H-2)，4.16(1H,d,J=2.9 Hz,H-7)，3.71(1H,d,J=11.7 Hz,H-14a)，2.54(1H,dd,J=12.7 Hz、8.0 Hz,H-9)，2.10(1H,dd,J=12.7 Hz、9.2 Hz,H-10a)，1.58(1H,dd,J=9.0 Hz、8.1 Hz,H-10b)，1.78(2H,s,H-3)，2.02(3H,s,CH3-17)，1.08(3H,s,CH3-12)，1.12(3H,s,CH3-13),1.06(3H,s,CH3-15)；13CNMR(100 MHz,CDCl3)，δ：170.44(C-16)，141.64(C-5)，129.58(C-6)，87.34(C-7)，79.92(C-1)，72.48(C-2)，62.10(C-14)，54.94(C-8)，50.40(C-4)，47.06(C-9)，42.31(C-11)，36.42(C-3)，35.06(C-10)，23.54(CH3-15)，23.39(CH3-12)，23.33(CH3-13)，21.40(CH3-17)。通過(guò)與文獻(xiàn)[19]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-8為punctaporonin L(圖7b)。

化合物1-9：淡黃色油狀液體；HR-ESI-MS，m/z：333.167 8([M+Na]+,C17H26O5Na+;計(jì)算值：333.167 8)；1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：5.95(1H,s,H-5)，5.94(1H,s,H-7)，5.67(1H,d,J=13.6 Hz,H-6)，4.86(1H,t,J=5.3 Hz,H-2)，4.16(2H,d,J=11.5 Hz,H-14)，3.48(1H,m,H-9)，2.91(1H,d,J=5.9 Hz,H-3a)，1.55(1H,d,J=16.6 Hz,H-3b)，2.20(1H,t,J=11.9 Hz,H-10a)，1.63(1H,d,J=9.8 Hz,H-10b)，2.09(3H,s,CH3-17)，1.21(3H,s,CH3-15)，1.14(3H,s,CH3-12)，1.12(3H,s,CH3-13)；13CNMR(100 MHz,CDCl3)，δ：172.31(C-16)，143.68(C-5)，137.43(C-8)，128.63(C-7)，123.88(C-6)，81.22(C-1)，75.79(C-2)，72.56(C-4)，65.06(C-14)，44.78(C-3)，40.36(C-11)，39.23(C-9)，33.64(C-10)，31.20(CH3-15)，24.23(CH3-12)，23.37(CH3-13)，21.45(CH3-17)。通過(guò)與文獻(xiàn)[23]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-9為punctaporonin H(圖8a)。

圖8 化合物1-9(a)和1-10(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.8 Structural formulas of compounds 1-9(a) and 1-10(b)

化合物1-10：白色粉末狀固體；HR-ESI-MS，m/z：275.162 3([M+Na]+,C15H24O3Na+;計(jì)算值：275.162 3)；1HNMR(400 MHz,CD3OD)，δ：5.74(1H,dd,J=5.9 Hz、2.4 Hz,H-6)，5.71(1H,d,J=5.9 Hz,H-7)，4.14(1H,d,J=2.4 Hz,H-5)，3.66(1H,d,J=11.2 Hz,H-14a)，2.49(1H,dd,J=12.8 Hz、7.8 Hz,H-9)，2.05(1H,m,H-10a)，1.55(1H,m,H-10b)，1.99(1H,m,H-2a)，1.33(1H,dt,J=12.3 Hz、5.5 Hz,H-2b)，1.84(1H,dd,J=9.2 Hz、3.8 Hz,H-3)，1.13(3H,s,CH3-12)，1.06(3H,s,CH3-13)，1.02(3H,s,CH3-15)；13CNMR(100 MHz,CD3OD)，δ：142.94(C-7)，130.80(C-6)，89.36(C-5)，80.35(C-1)，62.89(C-14)，56.59(C-8)，49.13(C-9)，47.00(C-4)，43.64(C-11)，36.31(C-10)，32.40(C-2)，31.88(C-3)，24.92(CH3-15)，24.01(CH3-12)，23.58(CH3-13)。通過(guò)與文獻(xiàn)[24-25]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-10為punctaporonin A(圖8b)。

2.2 細(xì)胞毒活性

對(duì)化合物1-3、1-4、1-8進(jìn)行細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖9。

*表示P<0.05，與依托泊苷相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示P<0.01，與依托泊苷相比具有顯著性差異圖9 不同化合物細(xì)胞毒活性比較Fig.9 Comparison of cytotoxic activities of different compounds

由圖9可知，化合物1-3對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為(32.27±4.26) μmol·L-1，與依托泊苷相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值分別為(9.71±0.61) μmol·L-1和(12.63±0.47) μmol·L-1，均顯著低于依托泊苷(P<0.01)，表明化合物1-3對(duì)A549、HeLa和HepG2細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒活性?；衔?-4和1-8對(duì)A549細(xì)胞的IC50值，與依托泊苷相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值均顯著高于依托泊苷(P<0.01)。

2.3 乙酰膽堿酯酶抑制活性

乙酰膽堿酯酶抑制劑是治療阿爾茨海默病最有效的手段[26]，目前報(bào)道的高效乙酰膽堿酯酶抑制劑均來(lái)源于藥用植物[27-28]?；衔?-1和1-3對(duì)乙酰膽堿酯酶的IC50值分別為31.0 μmol·L-1和16.1 μmol·L-1，化合物1-1的IC50值明顯高于加蘭他敏(P<0.05)，化合物1-3的IC50值與加蘭他敏相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。其它化合物在濃度為1 μmol·L-1時(shí)，對(duì)乙酰膽堿酯酶均未表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性(圖10)

圖10 不同化合物α-葡萄糖苷酶抑制活性比較Fig.10 Comparison of α-glucosidase inhibitory activities of different compounds

由圖10可知，化合物1-1、1-2、1-3和1-4對(duì)α-葡萄糖苷酶均未表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

3 結(jié)論

從桃兒七內(nèi)生煙色擬盤(pán)多毛孢菌代謝產(chǎn)物中分離并鑒定了10個(gè)萜類(lèi)化合物，其中化合物1-1、1-2、1-3和1-4為新化合物，對(duì)其細(xì)胞毒活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，化合物1-3、1-4和1-8對(duì)A549、HeLa和HepG2細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒活性，表明化合物1-3、1-4和1-8具有潛在的抗腫瘤活性，但其抗腫瘤活性與化合物結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究分析?；衔?-3對(duì)乙酰膽堿酯酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，但其對(duì)乙酰膽堿酯酶活性抑制具體機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究?；谔覂浩邇?nèi)生煙色擬盤(pán)多毛孢菌分離出具有抗腫瘤活性和抑制乙酰膽堿酯酶活性的萜類(lèi)化合物，為桃兒七內(nèi)生真菌抗腫瘤及治療阿爾茨海默病新藥開(kāi)發(fā)提供了新思路。