劉祿林 江小偉 廖直斌 賴長君 張福生 曹子厚 劉午陽 姬廣林 徐又佳*

1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，江西 贛州 341000 2. 寧都縣人民醫(yī)院骨科，江西 贛州 3428003 3. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215000

由于人口老齡化程度的不斷加劇，骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥已成為公共健康領(lǐng)域新的挑戰(zhàn)[1]。骨質(zhì)疏松癥的原因很多，近年來研究[2-3]發(fā)現(xiàn)鐵蓄積是骨質(zhì)疏松癥的一個獨立危險因素。絕經(jīng)后女性雌激素下降90 %，伴隨血清鐵蛋白提高2～3倍，升高的血清鐵蛋白可能是I型骨質(zhì)疏松癥的重要致病因素[4]。一項針對1 729名健康絕經(jīng)后女性和中年男性(年齡≥40歲)為期3年的隊列研究[5]結(jié)果提示，血清鐵蛋白水平與骨量丟失速率呈正相關(guān)。鐵蓄積不僅對成骨細(xì)胞增殖、分化有抑制作用[6-7]，還可促進破骨細(xì)胞分化和骨吸收[8]，骨轉(zhuǎn)換失衡最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。鐵蓄積與骨質(zhì)疏松發(fā)生的相關(guān)性被發(fā)現(xiàn)后,有報道表明降低鐵水平可以改善代謝和骨微結(jié)構(gòu)[9-10]。鐵調(diào)素是調(diào)節(jié)機體鐵吸收和利用的關(guān)鍵分子[11]。本團隊對小鼠進行鐵調(diào)素基因敲除，發(fā)現(xiàn)7月齡時小鼠出現(xiàn)明顯鐵蓄積和骨量下降，主要表現(xiàn)為成骨細(xì)胞活性受抑制[12]。然而，慢性和持續(xù)性鐵蓄積對骨代謝的影響尚不清楚，尤其是在老年狀態(tài)下。因此，本研究利用鐵調(diào)素基因敲除小鼠構(gòu)建內(nèi)源性鐵蓄積小鼠模型(KO組)，將其與野生型(WT組)小鼠比較，觀察兩組小鼠7、12、18月齡時鐵代謝指標(biāo)和骨量變化，探究骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)和氧化應(yīng)激水平的變化，初步探討慢性持續(xù)性鐵蓄積對骨代謝的動態(tài)影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1研究材料：鐵調(diào)素基因敲除小鼠購自蘇州大學(xué)-劍橋基因組資源中心；微型計算機斷層(Micro-CT，SKY-SCAN公司，比利時)；多功能酶標(biāo)儀(Biotek公司，美國)；Elisa試劑盒：血清鐵調(diào)素 (武漢伊萊瑞特公司)、血清鐵蛋白(英國ABCam公司)、OCN(美國Cloud-Clone 公司)、CTX(美國Cloud-Clone 公司)水平；血清MDA(中國南京建成公司)，SOD(中國南京建成公司)。

1.1.2研究對象：參照文獻[12]將鐵調(diào)素基因敲除雜合子小鼠進行雜交，產(chǎn)生敲除型(KO組)和野生型(WT組)后代，選取雄性小鼠作為研究對象,經(jīng)基因鑒定后進行分籠飼養(yǎng)。在7、12、18月齡時每組選10只小鼠，麻醉后收集小鼠血清、肝臟、股骨及脛骨標(biāo)本。

1.2 研究方法

1.2.1骨鐵濃度：采用原子吸收光譜法測定脛骨鐵含量。將脛骨樣品用鹽水沖洗幾次，然后在110 ℃的烤箱中過夜干燥。準(zhǔn)確測量干重后將干燥的樣品在馬弗爐中550 ℃下灰化，然后溶解在王水酸中，根據(jù)原子吸收法測定鐵濃度。

1.2.2普魯士藍(lán)肝臟鐵染色：將肝組織用含10 %甲醛緩沖液固定，經(jīng)乙醇梯度脫水后包埋制成石蠟切片，用普魯士藍(lán)染色液(核固紅法)對肝鐵進行染色。

1.2.3Micro-CT掃描檢測小鼠股骨微結(jié)構(gòu)：取小鼠左側(cè)股骨，剔除骨周圍肌肉等軟組織。將股骨標(biāo)本及時置于Micro-CT樣品檢測板中進行適當(dāng)固定，并行精準(zhǔn)掃描。股骨遠(yuǎn)端感興趣區(qū)(ROI)掃描條件和參數(shù)參照文獻[8]。

1.2.4血清中鐵調(diào)素、鐵蛋白、氧化應(yīng)激和骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的測定：將兩組小鼠完全麻醉后，經(jīng)小鼠內(nèi)眥靜脈取適量血液，室溫靜置2 h后，4 ℃，3 000 r/min，離心20 min，取上清即為血清標(biāo)本。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清鐵調(diào)素、鐵蛋白、OCN、CTX。采用組織化學(xué)反應(yīng)法檢測SOD、MDA水平。按照各種試劑盒說明書步驟進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0.05。經(jīng)處理后的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5軟件進行圖像編輯。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重、鐵代謝指標(biāo)相關(guān)結(jié)果

與WT組小鼠相比，KO組小鼠發(fā)育正常，且小鼠的飲食、睡眠、活動、毛發(fā)色澤等無異常跡象。如圖1A所示，在7、12、18個月各時間觀察點，同一觀察節(jié)點時間比較兩組小鼠的體重?zé)o顯著差異。為驗證Hepc1基因敲除的效果，采用ELISA檢測血清鐵調(diào)素水平，KO組小鼠各時間點鐵調(diào)素均顯著低于同期的WT組小鼠(圖1B)。反映機體鐵存儲水平的血清鐵蛋白在KO組小鼠則明顯高于同期的WT組小鼠(圖1C)。此外，在本研究中也觀察到骨組織鐵含量在KO組小鼠均顯著高于WT組小鼠(圖1 D)。鐵調(diào)素敲除后鐵調(diào)素水平下降，血清鐵和組織鐵含量明顯升高，結(jié)果提示內(nèi)源性鐵蓄積小鼠模型成功構(gòu)建。

圖1 小鼠體重和鐵代謝指標(biāo)結(jié)果Fig.1 Results of body weight and iron metabolism related indices in mice注：A：體重；B：血清鐵調(diào)素；C.：血清鐵蛋白；D：骨鐵濃度。與WT小鼠相比，*P<0. 05。

2.2 小鼠普魯士藍(lán)肝鐵染色

肝臟普魯士藍(lán)染色提示KO組小鼠肝臟切片鐵沉積在3個時間點均明顯增高(圖2)，提示鐵調(diào)素基因敲除后，小鼠肝臟逐漸出現(xiàn)鐵蓄積，該結(jié)果進一步說明內(nèi)源性鐵蓄積模型的成功構(gòu)建。

圖2 肝臟普魯士藍(lán)鐵染色圖 (×40)Fig.2 Prussian blue staining of iron in liver (×40)

2.3 股骨Micro-CT掃描檢測結(jié)果

為了評估鐵超載對骨微結(jié)構(gòu)的影響，對骨小梁和皮質(zhì)骨進行了顯微CT分析。從三維立體圖可以看出隨著年齡增大，WT組小鼠松質(zhì)骨骨小梁逐漸疏松，而KO組小鼠較同期WT組小鼠骨小梁數(shù)量更少、骨小梁間隙更大(圖3A、3B)。進一步三維CT數(shù)據(jù)分析表明，較同期WT組小鼠，KO組小鼠BMD明顯降低，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、ConnD減小，Tb.Sp、SMI增大；皮質(zhì)骨三維數(shù)據(jù)分析提示和同期WT組小鼠相比，KO組小鼠皮質(zhì)外徑周長沒有明顯區(qū)別，而內(nèi)徑周長增大，皮質(zhì)骨面積明顯減小(表1)。

表1 小鼠股骨遠(yuǎn)端微結(jié)構(gòu)參數(shù)三維分析Table 1 Three-dimensional analysis of microstructural parameters of distal femur in

圖3 股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨Micro-CT三維重建Fig.3 Three-dimensional reconstruction of cancellous and cortical bone of the distal femur by Micro-CT注：A：松質(zhì)骨；B：皮質(zhì)骨。

2.4 血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)和氧化應(yīng)激指標(biāo)

KO組小鼠在7、12、18個月三個時間點的OCN水平均顯著低于WT組小鼠(圖4A)；而兩組小鼠的CTX水平在7月齡時無明顯區(qū)別，在12、18月齡時KO組小鼠均顯著高于WT組小鼠(圖4B)，提示內(nèi)源性鐵積累同時合并骨吸收活性增強、骨形成水平抑制。本研究同時檢測了氧化應(yīng)激水平，KO組小鼠三個時間點的氧化指標(biāo)MDA明顯高于WT組小鼠(圖4C)，而抗氧化指標(biāo)SOD則呈相反趨勢(圖4D)。

圖4 小鼠骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)和氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果Fig.4 Results of bone turnover index and oxidative stress index in mice注：A：血清骨鈣素；B：血清I型膠原羧基末端肽；C：血清丙二醛；D：血清超氧化物歧化酶。與WT小鼠相比，*P<0. 05。

3 討論

近年來的研究[3,13]表明骨代謝異常與機體鐵蓄積有關(guān)。通過基因工程敲除鐵代謝相關(guān)基因得到的內(nèi)源性鐵蓄積模型穩(wěn)定可靠、結(jié)果更加準(zhǔn)確[7]。在本研究中，大致模仿了人類的青年期、成年期、老年期，觀察鐵調(diào)素基因進行敲除后小鼠7、12、18月齡時鐵代謝和骨代謝相關(guān)指標(biāo)的變化。而且，由于雌激素和鐵調(diào)素之間存在潛在直接調(diào)控關(guān)系[4]，為排除雌激素影響，將雄性小鼠作為研究對象。本研究發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)素敲除組雄性小鼠鐵調(diào)素明顯下降，組織呈現(xiàn)明顯的鐵蓄積狀態(tài)。隨著小鼠月齡增大，組織鐵呈漸進性累積，但兩組小鼠在飲食、睡眠、活動或體重方面沒有顯著差異。這些表型證實這是研究機體慢性鐵蓄積的成功模型。對股骨顯微CT掃描發(fā)現(xiàn)KO組小鼠的骨密度較正常組小鼠顯著下降，同時骨小梁分析參數(shù)發(fā)生了相應(yīng)的變化，骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目下降及骨小梁間隙增加。研究結(jié)果表明鐵蓄積能顯著降低小鼠的骨量和干擾正常骨微結(jié)構(gòu)，與相關(guān)文獻報道一致[12]。

骨重塑包括破骨細(xì)胞去除舊骨以及成骨細(xì)胞促進新骨的形成。本研究進一步檢測了骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)OCN和CTX。縱向比較發(fā)現(xiàn)WT組和KO組小鼠隨著月齡增大，OCN和CTX均逐漸減少，說明隨著增齡骨轉(zhuǎn)換水平降低。而兩組小鼠橫向比較，KO組小鼠各時間點OCN均低于WT組小鼠；CTX水平除了在7月齡時無明顯差異，在12、18月齡時KO組小鼠均高于WT組小鼠，說明鐵蓄積抑制了成骨的同時且促進了破骨活性。對原代小鼠祖細(xì)胞和小鼠成骨細(xì)胞系的研究[14]表明，鐵可抑制成骨細(xì)胞的生成、分化和功能。同時，鐵蓄積還可通過刺激mTOR水平的升高抑制“骨形成和血管生成偶聯(lián)”導(dǎo)致骨量下降[7]。成熟破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能過程需要大量線粒體提供高能量來完成[15]。鐵攝取可通過增加PGC-1 beta表達(dá)、ROS生成和線粒體數(shù)量刺激破骨細(xì)胞分化和骨吸收[16]。而鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子鐵調(diào)素通過降鐵可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)[10]。

本次研究同時觀察了氧化應(yīng)激指標(biāo)。在本實驗?zāi)Ｐ椭?，小鼠體內(nèi)的ROS水平顯著升高，在小鼠老齡時尤為明顯，可能有兩個主要原因。一方面，ROS主要產(chǎn)生于線粒體代謝，會隨著年齡的增長而積累[17]；另一方面，衰老細(xì)胞通常會積累大量的細(xì)胞內(nèi)鐵(高達(dá)30倍)[18]，鐵可介導(dǎo)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，因此衰老的因素及內(nèi)源性鐵蓄積綜合導(dǎo)致了小鼠老齡時ROS水平升高[19]。活性氧的積累被認(rèn)為是破壞骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個重要因素，包括抑制成骨細(xì)胞的活動、促進其凋亡[6]，且可通過激活參與破骨細(xì)胞功能的關(guān)鍵途徑加速破骨細(xì)胞的再吸收[16]。

綜上所述，鐵調(diào)素基因敲除后小鼠出現(xiàn)慢性累積性鐵蓄積，鐵蓄積可刺激氧化應(yīng)激水平提高，并通過抑制成骨活性、促進破骨吸收而加重骨量丟失。