江娜，許元，馮林玉，謝敏杰

1 缺血性腦卒中

腦卒中是一種急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特點(diǎn)是發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率高。世界卒中組織最近的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)顯示，卒中已成為世界上第二大死亡原因和第三大死亡和殘疾原因，給全球經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)[1,2]。中國(guó)的腦卒中預(yù)防和控制也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年中國(guó)腦血管疾病死亡率為149.49/10萬(wàn)，死亡人數(shù)為157萬(wàn)人，腦卒中已成為僅次于惡性腫瘤和心臟病的第三大死亡原因[3]。目前臨床上急性缺血性腦卒中的治療主要為靜脈溶栓和機(jī)械取栓，促進(jìn)血管再通，拯救缺血半暗帶。然而，由于其狹窄的治療窗口和出血轉(zhuǎn)化（hemorrhagic transformation，HT）的高風(fēng)險(xiǎn)，只有少數(shù)患者能得到有效治療[4]。

腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占全球所有卒中的80%[5]。缺血性腦卒中后，血流中斷，大腦代謝所需的氧氣和葡萄糖缺乏，能量產(chǎn)生不足，導(dǎo)致一些毒性代謝產(chǎn)物在局部堆積，如興奮性毒性氨基酸、酸性代謝產(chǎn)物、氧化應(yīng)激產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)等，對(duì)組織造成損害并導(dǎo)致廣泛神經(jīng)元死亡，死亡的神經(jīng)元通過(guò)釋放損傷相關(guān)分子 模 式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。

炎癥在缺血性腦卒中病理生理發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，存在于缺血性腦卒中神經(jīng)損傷與修復(fù)的所有階段，由損傷或死亡細(xì)胞釋放DAMPs 啟動(dòng)[7]。缺血性腦卒中急性期的炎癥最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、血腦屏障破壞等一系列腦損傷。因此，針對(duì)腦缺血急性期炎癥是一種有希望的、潛在的治療策略[8]。中性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）是缺血性腦卒中急性炎癥重要組成部分，在急性腦損害中發(fā)揮重要作用。靶向中性粒細(xì)胞和NETs 治療是缺血性腦卒中潛在的治療靶點(diǎn)。

2 中性粒細(xì)胞

中性粒細(xì)胞由骨髓中的粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞分化而來(lái)，是一種終末分化、壽命短的吞噬細(xì)胞[9]，在創(chuàng)傷、傳染病、代謝性疾病、自身免疫性疾病等不同疾病中發(fā)揮著不同的作用。一方面，中性粒細(xì)胞在防御感染中發(fā)揮積極作用，如抗菌[10]、抗真菌[11]和抗病毒[12]。此外，它們可以吞噬損傷組織，消除凋亡細(xì)胞碎片，使損傷局限化，并有利于組織損傷后的組織再生和血管生成[13]。另一方面，中性粒細(xì)胞通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)病變，比如中性粒細(xì)胞被招募到病變部位釋放各種顆粒蛋白，例如中性粒細(xì)胞彈性酶（neutrophil elastase，NE）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）、分泌細(xì)胞因子、形成NETs等，進(jìn)一步加重組織損傷，甚至發(fā)展為慢性炎癥[14]。

中性粒細(xì)胞具有不同的亞群和功能特征，它們?cè)诓±韺W(xué)中的作用取決于表型而不是數(shù)量[7]。Friedlender等[15]將中性粒細(xì)胞主要分為促炎型中性粒細(xì)胞（N1）和抗炎型中性粒細(xì)胞（N2）。最近的證據(jù)表明，N1和N2只是以高度異質(zhì)性和可塑性為特征的極化狀態(tài)連續(xù)體中的極端，機(jī)體內(nèi)還存在廣泛的中性粒細(xì)胞亞群，比如表現(xiàn)中性粒細(xì)胞功能受損和免疫抑制特性的粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞（granulocytic myeloid-derived suppressor cells，G-MDSCs）[16]、促血管生成中性粒細(xì)胞[17]、老年中性粒細(xì)胞[18]、反向跨內(nèi)皮遷移CD54hiCXCR1lo 中性粒細(xì)胞[19]、具有促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活和軸突再生特性的CD14+Ly6Glo中性粒細(xì)胞[20]。

不同中性粒細(xì)胞亞群對(duì)缺血性卒中有不同的影響，因此，可以針對(duì)特定中性粒細(xì)胞亞群靶向治療，而不需對(duì)中性粒細(xì)胞數(shù)量的全面靶向[21]。

3 缺血性腦卒中后中性粒細(xì)胞的招募和變化

生理情況下，腦內(nèi)并不存在中性粒細(xì)胞。缺血性腦卒中后，中性粒細(xì)胞數(shù)量在短時(shí)間內(nèi)迅速增加，并率先從循環(huán)血液中通過(guò)破壞的血腦屏障進(jìn)入病變部位，這一過(guò)程由缺血誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞快速激活驅(qū)動(dòng)[22]。中性粒細(xì)胞聚集在缺血性腦卒中再灌注后1～3 d達(dá)到峰值，幾乎淹沒(méi)了缺血半球，第7天中性粒細(xì)胞顯著下降[23,24]。于此同時(shí)，血腦屏障部分恢復(fù)[25]，中性粒細(xì)胞隨著時(shí)間的推移在浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞中成為一個(gè)次要群體，但仍少量存在，可能與慢性期腦重構(gòu)有關(guān)。

中性粒細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移由粘附分子介導(dǎo)，如細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）和血管細(xì)胞粘附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1），它們?cè)谌毖阅X卒中后表達(dá)增加，并驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[26,27]。趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）和趨化因子配體2（C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）是中性粒細(xì)胞趨化的重要因子，內(nèi)皮VCAM-1 和中性粒細(xì)胞晚期抗原-4（very late antigen-4，VLA-4）之間的相互作用促進(jìn)缺血性腦卒中的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[28]。同時(shí)，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）也是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中的主要驅(qū)動(dòng)力。

4 中性粒細(xì)胞在缺血性腦卒中中的作用

既往研究證明中性粒細(xì)胞在急性缺血性腦卒中中主要發(fā)揮破壞作用，急性期中性粒細(xì)胞高提示卒中預(yù)后不良[29,30]。中性粒細(xì)胞進(jìn)入缺血灶后，一方面，中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)積聚，堵塞毛細(xì)血管血流，加劇缺血后微血管損傷，阻礙血流再灌注。另一方面，中性粒細(xì)胞是缺血性腦卒中急性炎癥的重要組成成分，中性粒細(xì)胞通過(guò)DAMPs 誘導(dǎo)駐留細(xì)胞Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）激活，釋放白三烯、細(xì)胞因子、趨化因子、ROS，各種蛋白酶如MPO、NE、MMP-9 等直接損傷內(nèi)皮，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，腦組織水腫，進(jìn)一步阻塞血管，并釋放NETs，進(jìn)而促進(jìn)組織和血腦屏障損傷[31]。同時(shí)中性粒細(xì)胞可參與血栓的形成和擴(kuò)張，進(jìn)而損害腦卒中后血循環(huán)重建和血管重構(gòu)，加劇缺血性神經(jīng)元損傷[32]。

最近研究表明，中性粒細(xì)胞在缺血性腦卒中中可能獲得不同的表型，如N2抗炎型中性粒細(xì)胞，并通過(guò)釋放抗炎介質(zhì)減輕炎癥，繼而減輕腦損害[33]。在缺血性腦卒中慢性修復(fù)過(guò)程，中性粒細(xì)胞可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)腦重塑。中性粒細(xì)胞作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的重要來(lái)源，可刺激血管生成[34]。此外，中性粒細(xì)胞可吞噬凋亡細(xì)胞碎片，局限化損傷灶，且對(duì)預(yù)防全身感染有重要意義。

5 NETs

中性粒細(xì)胞被激活后，染色質(zhì)去致密，釋放細(xì)胞核和顆粒內(nèi)容物，形成了以脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為骨架，附著組蛋白和顆粒蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即為NETs[35]。2015 年，Perez-de-Puig 等[36]在小鼠永久性大腦中動(dòng)脈阻塞模型中首次發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后損傷灶NETs的形成。NETs是一種強(qiáng)負(fù)電荷的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由DNA、組蛋白和其他蛋白質(zhì)組成，如NE、MPO、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）、肽?；彼崦搧啺泵?（Peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）、MMP-9、組織蛋白酶G等[37]。

缺血性腦卒中后，中性粒細(xì)胞滲入缺血腦組織，并被進(jìn)一步激活形成NETs。缺血性腦卒中后NETs 的形成主要受HMGB1-TLR4、JAK-STAT 和cGAS-STING 通路的調(diào)節(jié)[38,39]。NETs 的生物標(biāo)志物主要有瓜氨酸組蛋白3（citrullinated histone H3，CitH3）、MPO-DNA[40,41]。NETs通過(guò)多種機(jī)制參與缺血性腦卒中的病理過(guò)程。

NETs介導(dǎo)缺血性腦卒中的炎癥反應(yīng)[42]。NETs的主要成分組蛋白和顆粒蛋白如MMPs、MPO、NE等具有細(xì)胞毒性，同時(shí)也是強(qiáng)有力的促炎因子，能夠誘發(fā)急性炎癥[43]。同時(shí)，NETs 可介導(dǎo)炎癥小體的激活，炎癥小體促進(jìn)IL-18和IL-1β的合成和釋放來(lái)誘導(dǎo)誘導(dǎo)NETs的形成，加重炎癥反應(yīng)[44]。

NETs 促進(jìn)血栓形成并介導(dǎo)缺血性腦卒中后的溶栓抵抗。Fuchs等[45]研究表明NETs可為血小板結(jié)合和聚集提供支架和刺激，并對(duì)血栓穩(wěn)定性起重要作用，DNA酶或抗凝劑肝素可破壞NETs支架并阻止血栓形成。Laridan等[38]對(duì)接受血管內(nèi)治療的68例缺血性腦卒中患者的血栓進(jìn)行了表征，在所有血栓中均廣泛檢測(cè)到中性粒細(xì)胞和NETs 的標(biāo)志物H3Cit 的存在。阿替普酶可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒形成NETs，導(dǎo)致出血轉(zhuǎn)化和溶栓抵抗，當(dāng)使用阿替普酶聯(lián)合DNase1治療時(shí)，效率更高，患者血栓的離體溶解更成功。

NETs 介導(dǎo)缺血性腦卒中后的血管損害。活化的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-8 和ROS 等促進(jìn)NETs 的形成，而NETs 也通過(guò)蛋白酶成分，如組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化[46]。Kang 等[32]發(fā)現(xiàn)，NETs 通過(guò)激活STING 通路誘導(dǎo)干擾素-β（interferon-β，IFN-β），阻礙卒中后的血管再生和血管重塑。同時(shí)，缺血性腦卒中后，HGMB1、MMP-9、MPO 和NE 等NETs 的主要成分可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，損傷腦血管內(nèi)皮，抑制血管生成和血運(yùn)重建[47-50]。此外，血栓和外周血中NETs的存在與數(shù)量可預(yù)測(cè)缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度，可能是缺血性腦卒中診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[40]。

6 靶向中性粒細(xì)胞治療缺血性腦卒中

6.1 減少中性粒細(xì)胞生成或耗竭中性粒細(xì)胞

粒細(xì)胞-集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是一種強(qiáng)大的造血因子，可提高骨髓系細(xì)胞的存活率并驅(qū)動(dòng)其分化，從而產(chǎn)生中性粒細(xì)胞。阻斷G-CSF受體可減少中性粒細(xì)胞生成，進(jìn)而減輕炎癥[51]。給予抗Ly6G抗體耗竭中性粒細(xì)胞可在小鼠局灶性腦缺血模型中發(fā)揮保護(hù)作用,減少缺血性腦損傷和神經(jīng)功能障礙[52]。

6.2 干擾中性粒細(xì)胞募集和趨化

阻滯選擇素、整合素和黏附分子可減少中性粒細(xì)胞在大腦中的浸潤(rùn)，進(jìn)而在缺血性腦卒中發(fā)揮保護(hù)作用[53]。在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物局灶性腦缺血中，抗E/P 選擇素抗體可以減少缺血后梗死灶，改善神經(jīng)功能[54]。在短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞模型（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）中，ICAM-1缺失可減少梗死灶[55]。趨化因子對(duì)協(xié)調(diào)中性粒細(xì)胞遷移至關(guān)重要。阻斷CCL5-CXCL4可阻止中性粒細(xì)胞募集，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)[56]。敲除CCR2后，小鼠梗死體積減少，腦水腫和缺血半球中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)也會(huì)減少[57]?？筕LA-4治療可抑制中性粒細(xì)胞的聚集，進(jìn)而減輕缺血性腦卒中急性期損害[22]。

6.3 促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑能通過(guò)誘導(dǎo)半胱天冬酶（Caspases）依賴性的中性粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕小鼠急性和慢性炎癥[58]。依克多因是一種天然化合物，存在于多種細(xì)菌中。它是一種相容的溶質(zhì)，通過(guò)充當(dāng)滲透液作為保護(hù)物質(zhì)，從而幫助生物體在極端滲透壓力下生存，具有抗炎性，能夠阻止炎癥微環(huán)境中性粒細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制[59]。此外，中性粒細(xì)胞的清除是炎癥消退的基礎(chǔ)[60]。

6.4 減少中性粒細(xì)胞分泌的炎性因子

活化的中性粒細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β等炎癥因子，是炎癥因子的主要來(lái)源，同時(shí)這些炎癥因子又會(huì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化，加重炎癥反應(yīng)[61]。同時(shí)，其他細(xì)胞如膠質(zhì)細(xì)胞也分泌TNF-α、IL-1β等炎癥因子[62]。因此，拮抗炎癥因子治療可以通過(guò)減少多種來(lái)源的炎癥因子進(jìn)而減輕炎癥，繼而減少梗死灶，改善預(yù)后。IL-1受體拮抗劑治療可以改善急性缺血性腦卒中患者預(yù)后[63]。

6.5 促進(jìn)中性粒細(xì)胞向N2型轉(zhuǎn)變

在特定刺激下，中性粒細(xì)胞可從N1型向N2型轉(zhuǎn)變，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，該策略也被認(rèn)為是治療缺血性腦卒中的有效措施。在小鼠tMCAO 模型中，維甲酸受體激動(dòng)劑貝沙羅汀可增加N2型中性粒細(xì)胞，顯著減少血腦屏障損傷和神經(jīng)功能缺損，且不影響腦血流量，可有效用于缺血性卒中的急性治療[64]。在其他研究中，TLR4 敲除[65]和IL-27[66]治療可促進(jìn)中性粒細(xì)胞向N2型轉(zhuǎn)變，并對(duì)大腦起到保護(hù)作用，提示N2型中性粒細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。

7 靶向NETs治療缺血性腦卒中

NETs作為中性粒細(xì)胞最重要最強(qiáng)大的殺傷機(jī)制，在急性缺血性腦卒中增強(qiáng)急性炎癥反應(yīng)，參與血栓形成，促進(jìn)血管損傷，并介導(dǎo)溶栓抵抗，大大加重了急性腦損傷。抑制NETs 的形成或促進(jìn)NETs 的降解在缺血性腦卒中中起到保護(hù)作用，成為治療缺血性腦卒中新的靶向。

7.1 抑制NETs的形成

PAD4抑制劑通過(guò)抑制NETs的形成可增加缺血性腦卒中后新生血管和血管修復(fù)，減少血腦屏障損害，改善功能恢復(fù)，很有潛力被開(kāi)發(fā)為缺血性腦卒中治療劑[67]。PAD4抑制劑如GSK484[68]、GSK199[40]、新生兒NET 抑制因子（neonatal NET-inhibitory factor，nNIF）[40]、氯胺[69]均被證明可減少NETs 的形成，減輕炎癥。HMGB1 不僅參與NETs 的形成過(guò)程，而且是NETs 的重要組成部分。血小板是HMGB1 的主要來(lái)源之一，耗竭血小板或特異性敲除血小板HMGB1 可顯著降低缺血性腦卒中后血漿HMGB1和NETs水平，并大大改善缺血性腦卒中預(yù)后[40]。NETs的形成與ROS 的產(chǎn)生密切相關(guān)。氧自由基清除劑依達(dá)拉奉在MCAO 小鼠中減少NETs，進(jìn)而改善神經(jīng)功能[70]。因此，ROS 抑制劑可通過(guò)抑制NETs 的形成對(duì)急性缺血性腦卒中起保護(hù)作用。其他藥物如環(huán)孢菌素減少IL-8 介導(dǎo)的NETs 形成，并在缺血性卒中的治療中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[71]。辛伐他汀具有抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和NETs 形成的能力，減輕卒中后的腦損傷，改善阿替普酶誘導(dǎo)的出血轉(zhuǎn)化[72]。

7.2 促進(jìn)NETs的降解

除了抑制NETs 的形成外，破壞DNA 骨架、拮抗組蛋白、MPO 和NE 以促進(jìn)NETs 的降解為缺血性腦卒中治療提供了另一種潛在的方法。DNA降解劑DNase治療通過(guò)降解NETs來(lái)減少缺血性腦卒中小鼠的梗死體積并改善卒中預(yù)后。此外，DNase 加速腦卒中血栓的溶解，DNase 和阿替普酶聯(lián)合治療可以減少阿替普酶的劑量和副作用，并擴(kuò)大治療時(shí)間窗口，同時(shí)降解血栓中的纖維蛋白和NETs[32,38]。組蛋白是NETs 重要組成成分，降解組蛋白可以促進(jìn)NETs的降解。臨床研究表明，組蛋白降解劑3K3A-APC可增加小鼠缺血性腦卒中后神經(jīng)發(fā)生，改善神經(jīng)功能[73]。NE和MPO都是NETs的組成部分，也是中性粒細(xì)胞的重要酶，在炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究證實(shí)NE抑制劑和MPO抑制劑對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用[74,75]。

8 小結(jié)

中性粒細(xì)胞作為缺血性腦卒中急性炎癥重要組成部分，在缺血性腦卒中后，中性粒細(xì)胞第一個(gè)從血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入缺血灶，分泌各種炎性因子和蛋白酶，并釋放NETs，加重內(nèi)皮損傷和血腦屏障損害，與缺血性腦卒中不良預(yù)后成正相關(guān)。同時(shí)，中性粒細(xì)胞和NETs參與血栓形成，阻礙血管重構(gòu)，加劇缺血性神經(jīng)元損傷。已有研究證實(shí)調(diào)控進(jìn)入缺血半球的中性粒細(xì)胞數(shù)目與功能可以減輕缺血性腦卒中急性炎癥，改善腦水腫，減少梗死灶體積，改善神經(jīng)功能。

既往中性粒細(xì)胞在缺血性腦卒中中的作用長(zhǎng)期被忽視，但近十年的研究提示中性粒細(xì)胞和NETs在缺血性腦卒中后急性炎癥、血栓形成、血管損害等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能是促進(jìn)缺血性腦卒中后新生血管和功能恢復(fù)的關(guān)鍵。因此，靶向中性粒細(xì)胞及NETs 是急性缺血性腦卒中治療的潛在靶點(diǎn)，有希望促進(jìn)未來(lái)缺血性腦卒中治療的發(fā)展。然而，如何避免中性粒細(xì)胞靶向治療的不良反應(yīng)如感染等問(wèn)題值得進(jìn)一步研究。同時(shí)，由于流式技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種具有不同作用的中性粒細(xì)胞亞群，如何精準(zhǔn)靶向中性粒細(xì)胞某一亞群而不影響其他中性粒細(xì)胞亞群仍需繼續(xù)探索。