王懷程，李鵬，汪標(biāo)文，杜純宇，于濤*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，吉林 長春 130031；2.吉林大學(xué)機(jī)械工程與航空學(xué)院工程力學(xué)系，吉林 長春 130022)

周圍神經(jīng)損傷主要是由于牽拉傷、切割傷、火器傷、壓迫性損傷、缺血等原因?qū)е碌亩虝夯蚪K生的神經(jīng)功能障礙，它的病理[1]變化包括軸漿運輸受損、軸突變性、施萬細(xì)胞損傷、節(jié)段性脫髓鞘和完全瓦勒氏變性[2]。美國2009—2018年間，單上肢周圍神經(jīng)損傷發(fā)生率顯著上升，年平均發(fā)病率為36.9%，2018年發(fā)病率為51.9%[3]。損傷程度較重時，自發(fā)周圍神經(jīng)再生、感覺和運動功能的恢復(fù)并不完全[4]。隨著組織工程研究的發(fā)展，近期研究表明[5]：將細(xì)胞和生物材料復(fù)合支架[6]植入受損的組織進(jìn)行修復(fù)治療已成為現(xiàn)實[7]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是目前組織工程研究和應(yīng)用最為廣泛的一類材料[8]。學(xué)者們對PLGA導(dǎo)管對周圍神經(jīng)的生物學(xué)特性進(jìn)行了大量的研究。 Gattermeye等[9]和Quirk等[10]研究結(jié)果表明，采用離子表面處理方法在PLGA材料表面引入功能基團(tuán)或功能鏈，可提高支架材料表面的黏附性。Shen等[11]以引入陽離子化的凝膠抗基，離子處理PLGA膜，有效地改善了細(xì)胞對PLGA降解支架材料的親和性，得出了通過等離子處理的PLGA支架提高了堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibrobast growth factor，BFGF)的固化效率的結(jié)論。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是目前細(xì)胞治療及組織工程修復(fù)的重要細(xì)胞來源[12]。學(xué)者們對以BMSCs移植干預(yù)治療神經(jīng)損傷進(jìn)行了大量的研究。張學(xué)磊等[13]以脫細(xì)胞異體神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合BMSCs和富血小板凝膠移植動物股神經(jīng)損傷，對比分析脫細(xì)胞神經(jīng)支架聯(lián)合BMSCs和富血小板凝膠移植治療兔股神經(jīng)損傷的效果，得出了脫細(xì)胞神經(jīng)支架聯(lián)合BMSCs和富血小板凝膠修復(fù)股神經(jīng)損傷效果較好的結(jié)論。張威等[14]研究了BMSCs來源的外泌體對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)效果，隨機(jī)將24只SD大鼠分為三組，暴露出大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)后，建立鼠鉗夾傷模型，Control組在相同部位注射等量磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，Sham組僅分離出神經(jīng)，Exosome組在鉗夾傷附近的神經(jīng)外膜下注射5 μL外泌體。術(shù)后4周檢測大鼠運動功能的恢復(fù)情況；檢測各組大鼠電生理神經(jīng)傳導(dǎo)功能的恢復(fù)情況；以馬松染色的方法檢測各組大鼠手術(shù)側(cè)腓腸肌的纖維面積；以透射電鏡觀察神經(jīng)纖維直徑結(jié)構(gòu)變化；免疫熒光染色方法對坐骨神經(jīng)損傷的相應(yīng)脊髓節(jié)段染色后觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)量。結(jié)果得出了坐骨神經(jīng)損傷后BMSCs來源的外泌體有利于運動功能的恢復(fù)[15]，其機(jī)制和緩解疼痛與促進(jìn)軸突再生有關(guān)的結(jié)論。以往的研究[13-15]均未涉及坐骨神經(jīng)損傷動物模型以PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植修復(fù)后坐骨神經(jīng)生物力學(xué)特性分析。PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損生物力學(xué)分析罕見報道，鑒于此，作者對以PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植坐骨神經(jīng)缺損動物模型后的動物模型大鼠，進(jìn)行大體行為學(xué)觀察、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測量、坐骨神經(jīng)拉伸力學(xué)實驗，觀察PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷動物模型的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 6個月齡健康SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量300～308 g，購于長春高新醫(yī)學(xué)動物實驗中心[(許可證CXK(吉)2003—2004)]。ECM凝膠(BD公司，美國)、大鼠BMSCs(上海一研生物科技有限公司，中國)、PLGA(長春圣博瑪生物材料有限公司，中國)。9-0無創(chuàng)縫合線(青島耐克醫(yī)材有限公司，中國)。

1.2 實驗設(shè)備 MODEL55100型自動控制電子萬能試驗機(jī)(長春試驗機(jī)研究所集團(tuán)公司，中國)、CGA-5型讀數(shù)顯微鏡(長春市第三光學(xué)儀器廠，中國)。Leica手術(shù)顯微鏡(德國)。

1.3 PLGA導(dǎo)管制作 按于濤等[16]方法將PLGA溶于二氯甲烷(7∶3)中，加入200～300 μm粒徑的NaCl做致孔劑(PLGA與NaCl質(zhì)量比1∶9)混合攪拌均勻。將混合物注入內(nèi)徑1.6 mm、外徑1.8 mm、長40 mm的預(yù)制模具中，室溫下使模具中的混合物在通風(fēng)櫥中自然揮發(fā)，96 h后脫模，取出PLGA與NaCl柱狀導(dǎo)管，將導(dǎo)管移到真空干燥箱內(nèi)。在37 ℃環(huán)境溫度下真空干燥48 h，將PLGA與NaCl柱狀導(dǎo)管浸入裝有800 mL離子水的燒杯中，每4 h更換1次去離子水，去離子水洗滌96 h后，將PLGA與NaCl柱狀導(dǎo)管取出，置于干燥箱中37 ℃干燥48 h，36 ℃環(huán)氧乙烷對PLGA與NaCl柱狀導(dǎo)管消毒12 h后備用。實驗前取出與NaCl與PLGA導(dǎo)管，使用S-5無菌塑柄手術(shù)刀切取NaCl與PLGA導(dǎo)管組試樣40個，試樣長10 mm。

1.4 實驗分組與方法 按Lopes等[17]方法制備動物坐骨神經(jīng)損傷缺損，36只實驗動物隨機(jī)分為三組：(1)自體神經(jīng)移植組12只；(2)PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs移植組12只；(3)PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)凝膠移植組12只。分別將36只實驗大鼠固定于動物手術(shù)臺上，以6%(6 mL/kg)水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠左側(cè)股后部做正中切口，切開皮膚、皮下組織，分離半膜肌、半腱肌，使左側(cè)坐骨神經(jīng)暴露并游離。在梨狀肌下緣3 mm處切除10 mm坐骨神經(jīng)，制備坐骨神經(jīng)10 mm的缺損模型。

1.5 坐骨神經(jīng)缺損移植 按于濤等[16]的方法：(1)自體神經(jīng)移植組：在手術(shù)顯微鏡下，將切除的自體坐骨神經(jīng)用縫合神經(jīng)外膜縫合兩斷端，每端縫合4針。(2)PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs移植組：取10 mm PLGA導(dǎo)管在手術(shù)顯微鏡下，將神經(jīng)斷端分別套入PLGA神經(jīng)導(dǎo)管，用9-0無創(chuàng)縫合線一針固定神經(jīng)外膜和PLGA神經(jīng)導(dǎo)管管壁，之后兩端各縫合4針。用微量注射器將大鼠BMSCs(1×109L)注入PLGA神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)。(3)PLGA神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植組：在手術(shù)顯微鏡下取10 mm PLGA導(dǎo)管將神經(jīng)斷端分別套入PLGA神經(jīng)導(dǎo)管，用9-0無創(chuàng)縫合線一針固定神經(jīng)外膜和PLGA神經(jīng)導(dǎo)管管壁，之后兩端各縫合4針，用微量注射器將大鼠BMSCs(1×109L)與外基質(zhì)凝膠(1×109L)注入PLGA神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)。各實驗組大鼠以慶大霉素沖洗傷口后分層關(guān)閉切口，術(shù)后大鼠肢體不做外固定。待大鼠清醒后將大鼠分籠喂養(yǎng)，每只實驗大鼠每天腹腔注射青霉素1萬U/kg×2次，連續(xù)注射7 d，以75%酒精對大鼠皮膚切口消毒1次/d，連續(xù)消毒7 d。

1.6 坐骨神經(jīng)功能測試 將大鼠置于平地，觀察大鼠術(shù)側(cè)下肢運動情況及后蹬力，判斷坐骨神經(jīng)運動功能狀態(tài)。觀察大鼠對疼痛產(chǎn)生的反應(yīng)(痛縮反應(yīng))判斷其坐骨神經(jīng)感覺功能的恢復(fù)情況。

1.7 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定 按Baptista等[18]評價坐骨神經(jīng)功能的方法，于大鼠術(shù)后每6周、12周、18周、24周測定各組大鼠正常側(cè)足(N)、實驗側(cè)足(E)的足印長度(podogram length，PL)，足印的較長距離，即從足跟到足尖的距離；足趾寬度(width between the first and fifth toes，TW)，即趾到第5趾連線距離；中間足趾距離(inter-toes distance，IT)，即第2趾到第4趾連線距離。將測量數(shù)據(jù)代入Bain公式，計算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)及其恢復(fù)率。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETW-NTW)/NTW+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8，正常大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)為0，坐骨神經(jīng)完全離斷指標(biāo)為-100。

1.8 坐骨神經(jīng)取樣方法 以大鼠坐骨神經(jīng)吻合處為中點，取各組實驗側(cè)(左側(cè))同一段坐骨神經(jīng)，長度約10 mm，每組各取12個坐骨神經(jīng)試樣；隨機(jī)取各組大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)12個試樣為正常對照組。試樣取出后置于裝有生理鹽水的器皿中存放備用。

1.9 坐骨神經(jīng)試樣拉伸實驗方法 采用CGA-5型讀數(shù)顯微鏡測量各組坐骨神經(jīng)試樣的長度和直徑，各組均長10 mm、直徑1.52～1.55 mm。按Piao等[19]的方法分別對每個坐骨神經(jīng)試樣進(jìn)行預(yù)調(diào)處理后進(jìn)行實驗，溫度控制在(36.5±1.0) ℃內(nèi)，分別將每個試樣裝夾于試驗機(jī)的夾具內(nèi)，之后以5 mm/min的速度對試樣施加拉伸載荷，為使試樣在實驗中保持濕度，實驗中不斷的向試樣噴灑生理鹽水。實驗結(jié)束后，計算機(jī)自動輸出試樣的彈性限度應(yīng)變、最大應(yīng)變、彈性限度應(yīng)力、最大應(yīng)力、彈性限度載荷、最大載荷等數(shù)據(jù)和應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠大體行為觀察結(jié)果 各組大鼠均未發(fā)現(xiàn)死亡，術(shù)后各組大鼠精神狀態(tài)尚可，傷口無感染，活動良好。PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植組大鼠術(shù)后14 d傷口愈合，足底皮膚有紅腫，無潰瘍，21 d后術(shù)側(cè)足趾可著地行走，后蹬力較好；自體神經(jīng)移植組、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs移植組大鼠術(shù)后2周發(fā)現(xiàn)足底皮膚有紅腫和潰瘍，4周后傷口和皮膚潰瘍愈合，術(shù)后42 d能著地行走，有跛行。術(shù)后168 d針刺患肢足底，各組大鼠均有痛縮反應(yīng)。各組大鼠神經(jīng)縫合處與周圍組織無黏連，遠(yuǎn)、近端與正常神經(jīng)連接處光滑無斷裂，均有纖維組織包繞，表面可見豐富的微小血管網(wǎng)形成，外形和正常神經(jīng)相似。

2.2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定 各組大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定結(jié)果表明，術(shù)后6周PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植組神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于自體神經(jīng)移植組、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs移植組(P<0.05)；術(shù)后12周、24周各組坐骨神經(jīng)功能相似(P>0.05，見表1)。

表1 各組大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定結(jié)果

2.3 坐骨神經(jīng)試樣拉伸實驗結(jié)果 PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs移植組、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植組，在拉伸彈性限度載荷、彈性限應(yīng)力、最大載荷、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性限度應(yīng)變均大于自體神經(jīng)移植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植組的拉伸彈性限度載荷、彈性限應(yīng)力、最大載荷、最大應(yīng)力、彈性限度應(yīng)變大于PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs移植組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)拉伸實驗結(jié)果

3 討 論

神經(jīng)損傷動物模型是研究神經(jīng)損傷的先決條件。大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)與人類坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，因此本實驗采取了以下干預(yù)措施，由同一具有高級技術(shù)職稱的顯微外科醫(yī)生以手術(shù)刀切取各組用于移植的坐骨神經(jīng)試樣，試樣的長度一、直徑基本一致。以無菌塑柄手術(shù)刀在每個大鼠坐骨神經(jīng)相同部位切斷，形成一個10 mm缺損，復(fù)制坐骨神經(jīng)缺損模型。自體神經(jīng)移植組以外膜縫合法移植縫合坐骨神經(jīng)，PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠組試樣，將神經(jīng)斷端分別套入PLGA神經(jīng)導(dǎo)管，將套接后縫合離斷試樣。對每個試樣均在相同的部位縫合，縫合的針數(shù)相同，對不符合要求的試樣予以剔出。由于干預(yù)措施得當(dāng)，實驗結(jié)果可靠。各組大鼠行為學(xué)觀察和功能測試結(jié)果各移植組大鼠移植24周內(nèi)均未發(fā)生死亡，大鼠移植手術(shù)沒有導(dǎo)致嚴(yán)重手術(shù)損傷、過敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)，術(shù)后對大鼠針刺有痛縮反應(yīng)，足底皮膚未發(fā)生嚴(yán)重潰瘍，通過PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠修復(fù)后大鼠感覺功能得到恢復(fù)。術(shù)后4周大鼠能正常著地行走，并有一定的后蹬力，說明神經(jīng)的運動功能得到了明顯的恢復(fù)。

坐骨神經(jīng)試樣拉伸實驗結(jié)果表明，PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs移植組、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植組坐骨神經(jīng)的彈性限度應(yīng)變、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變大于自體神經(jīng)修復(fù)組，說明PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植修復(fù)動物坐骨神經(jīng)損傷后起到了提高坐骨神經(jīng)彈性、強(qiáng)度的效果，其彈性提高有利于坐骨神經(jīng)抵抗變形和外力，有利于損傷的坐骨神經(jīng)的修復(fù)和再生。由于坐骨神經(jīng)受到損傷后打亂了神經(jīng)纖維的排列關(guān)系，神經(jīng)纖維受到損傷，使拉伸力學(xué)性能指標(biāo)降低，拉伸力學(xué)特性發(fā)生改變，PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植后坐骨神經(jīng)的功能得到了修復(fù)，所以力學(xué)特性也得到了恢復(fù)。

本實驗坐骨神經(jīng)損傷動物模型以PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs、PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植干預(yù)后，動物坐骨神經(jīng)的拉伸力學(xué)、生理功能等均到了一定的恢復(fù)，與所期望的結(jié)果相符。PLGA導(dǎo)管復(fù)合BMSCs與ECM凝膠移植對動物坐骨神經(jīng)具有很好的修復(fù)效果。Piao等[20]研究化學(xué)提取脫細(xì)胞神經(jīng)聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞移植修復(fù)坐骨神經(jīng)，在移植24周時進(jìn)行了電生理測試和拉伸實驗，得出了添加脂肪源性干細(xì)胞對神經(jīng)功能、形態(tài)和拉伸力學(xué)功能的恢復(fù)有顯著影響。本實驗與Piao等不同，Piao等[20]是以脫細(xì)胞聯(lián)合脂肪間充值干細(xì)胞移植修復(fù)家兔坐骨神經(jīng)損傷，本實驗是以PLGA導(dǎo)管聯(lián)合BMSCs與ECM凝膠修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷，Piao等對動物坐骨神經(jīng)進(jìn)行了簡單拉伸力學(xué)實驗，本實驗是對各組動物坐骨神經(jīng)進(jìn)行了長時間的應(yīng)力松弛、蠕變特性實驗，結(jié)果更具參考價值。